IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

Streszczenie

Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej (IP-FCM) jest wydajną metodą wykrywania i kwantyfikacji oddziaływań białko-białko. Podstawowa zasada wywodzi się z metody sandwich ELISA, w której przechwycony główny analityk może być wykrywany wraz z innymi cząsteczkami fizycznie powiązanymi w obrębie kompleksów wielobiałkowych. Procedura obejmuje kowalencyjne sprzęganie polistyrenowych mikrokulek lateksowych z immunoprecypitującymi przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) specyficznymi dla białka zainteresowania, inkubowanie tych kulek z lizatami komórkowymi, sondowanie przechwyconych kompleksów białkowych za pomocą sond sprzężonych z fluorochromami oraz analizę fluorescencji związanej z kulekami za pomocą cytometrii przepływowej. IP-FCM jest niezwykle czuła, pozwala na analizę białek w ich natywnym (niedenaturowanym) stanie i nadaje się do analizy półilościowej lub ilościowej. Dodatkowymi zaletami IP-FCM jest brak konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub specjalistycznego sprzętu, poza cytometrem przepływowym, a także łatwa adaptacja do zastosowań wysokoprzepustowych.

Protokół

**Ten protokół wideo opiera się na powiązanej publikacji ¹: High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang W. A. Schamel, Ed Palmer. Science's STKE 2007 (389): pl2, 5 czerwca 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Kliknij tutaj, aby przejrzeć tę publikację.

Przed rozpoczęciem należy przygotować następujące wodne roztwory stokowe:

Bufor sprzęgający MES:	Przechowywać w 25°C
MES, pH 6,0	50 mM
EDTA	1 mM
Bufor wygaszający/blokujący/do przechowywania (QBS):	Przechowywać w 4°C
BSA	1%
Azydek sodu	0.02%
PBS, pH 7,4	1x
Bufor FCM:	Przechowywać w temperaturze 4°C
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	100 mM
Azotek sodu	0.02%
FBS (płodowa surowica bydlęca)	5%
PBS, pH 7,4	1x

Przygotować bezpośrednio przed użyciem:

EDAC-MES:	Rozpuścić proszek EDAC w stężeniu 50 mg/ml w buforze sprzęgającym MES
Roztwór digitoniny (2% m/v):	Rozpuścić proszek digitoniny w dH2O2poprzez podgrzanie do 95°C przez 5 min, a następnie chłodzenie na lodzie
Bufor lizujący:
Tris, pH 7,4	50 mM
NaCl	150 Mm
Roztwór digitoniny	1%
Inhibitory proteaz	1x
Przechowywać w lodzie

1. Sprzęganie mAb z kuleczkami

1. Wyznaczyć stężenie kulek z zakupionego roztworu zapasowego poprzez rozcieńczenie w PBS i przeliczenie za pomocą komory liczydłowej (hemacytometru). Do liczenia zastosować rozcieńczenie kulek 1:10000.
2. Pipetować 18 x 10⁶ kulek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
3. Przemyć kulki 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL buforu sprzęgającego MES, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.
4. Resuspendować kulki w 50 μL buforu sprzęgającego MES.
5. Aktywować grupy karboksylowe na kuleczkach poprzez dodanie 20 μL świeżo przygotowanego EDAC-MES.
6. Mieszać delikatnie przez 15 min w temperaturze 25°C, pipetując roztwór w górę i w dół.
7. Przemyć aktywowane kulki 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL PBS, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.
8. Resuspendować aktywowane kulki w 50 μL PBS.
9. Dodać 50 μL przeciwciała mAb do immunoprecypitacji (IP) (o stężeniu zapasowym 0,2-1,0 mg/mL) do roztworu aktywowanych kulek.
10. Mieszać przez 3 do 4 godzin w temperaturze 25°C, umieszczając probówkę na wytrząsarce wibracyjnej. Wstrząsać wystarczająco mocno, aby zapobiec osadzaniu się kulek na dnie probówki.
11. Przemyć kulki sprzężone z przeciwciałami mAb 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL PBS, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.
12. Resuspendować kulki w 100 μL buforu QBS. Można je przechowywać w temperaturze 4°C.
13. Po dokładnym zawieszeniu kulek rozcieńczyć je 1:200-1:10 000 w PBS i przeliczyć za pomocą komory liczydłowej. Stężenie musi być mierzone dla każdej partii preparatywnej, aby można było precyzyjnie kontrolować liczbę kulek użytych w każdym eksperymencie IP lub pull-down.

2. Przygotowanie lizatu ponuklearnego i immunoprecypitacja

Metoda lizy oraz optymalne warunki lizy będą zależeć od typu komórek oraz badanych oddziaływań białko-białko. Istnieje wiele protokołów, które można zmodyfikować pod kątem konkretnego zastosowania.

1. Poddać lizie 20 x 10⁶ „małych” komórek, takich jak limfocyty, lub 5 x 10⁶ „dużych” komórek, takich jak makrofagi lub komórki nowotworowe, w 100 μL świeżego buforu do lizy w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL przez 20 min na lodzie. Dostosować objętość lizy w zależności od potrzeb.
2. Aby usunąć jądra komórkowe i nierozpuszczalne szczątki komórkowe, odwirować lizat przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4°C. Zebrać nadsącz, a osad odrzucić.
3. Do oczyszczonego lizatu dodać od 0,5 x 10⁵ do 2,5 x 10⁵ kulek sprzężonych z mAb, delikatnie mieszając za pomocą pipety. Minimalna objętość stosowana do przeprowadzenia pojedynczego IP wynosi 5 μL.
4. Umieścić na pionowym rotatorze na 4 godziny lub przez noc w pomieszczeniu chłodniczym. Ustawić prędkość wystarczającą, aby zapobiec osiadaniu kulek. W przypadku IP o małej objętości dopuszczalne jest, aby ciecz pozostawała na dnie probówki podczas rotacji.

3. Detekcja białka wychwyconego na kuleczkach za pomocą przeciwciał koniugowanych z fluorochromem

1. Przemyć koraliki IP dwukrotnie w 0,2 do 1,0 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 20 000g w temperaturze 4°C przez 3 min po każdym przemyciu.
2. Resuspendować koraliki w 100 μL buforu FCM i rozdzielić po 20 μL do każdej z pięciu lub więcej probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL lub do dołków płytki z dnem w kształcie kominka.
3. Dodać przeciwciała mAb sprzężone z fluorochromem do próbek. Przeprowadzić barwienie FCM zgodnie z instrukcjami producenta lub zgodnie z empirycznie określonymi stężeniami. Jako punkt wyjścia dodać od 0,2 do 1 μL roztworu przeciwciał zapasowych (o stężeniu 0,2-1,0 mg/mL) na probówkę lub dołek i inkubować przez 40 min na lodzie.
4. Przemyć probe-owane koraliki w probówkach 1,5-ml dwukrotnie w 1,0 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 20 000g w temperaturze 4°C przez 3 min po każdym przemyciu. Ostrożnie usunąć nadosad po każdym przemyciu, uważając, aby nie naruszyć osadu koralików. W przypadku płytki z dnem w kształcie kominka przemyć dwukrotnie 0,2 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 1000g przez 5 min w temperaturze 4°C po każdym przemyciu. W tym kroku pomocne jest użycie pipety wielokanałowej. Aby usunąć nadosad z koralików w płytce z dnem w kształcie kominka, należy raz „potrząsnąć” płytką, a następnie, trzymając ją w pozycji odwróconej, osuszyć krople z krawędzi dołków. Objętość pozostała w każdym dołku zawierającym koraliki wyniesie około 20 μL.
5. Resuspendować koraliki w 200 μL buforu FCM na próbkę. Przenieść do oznakowanych probówek FACS. Próbki są teraz gotowe do analizy FCM.

4. Pozyskiwanie danych FCM

Kule CML opisane w niniejszym protokole mają średnicę od 3 do 5 μm, co stanowi około połowy średnicy spoczywającego limfocytu mysiego. W związku z tym może być konieczne ręczne zwiększenie wzmocnienia (gain) dla rozproszenia światła w przód (FSC) oraz napięcia dla rozproszenia światła pod kątem (SSC), aby zdarzenia związane z populacją kulek mieściły się w skali. Poszczególne kulki IP powinny tworzyć jedną, ściśle zgrupowaną populację. Ustawienia i bramkowanie należy dostosować tak, aby wykluczyć dublety kulek oraz zanieczyszczenia.

1. Przed analizą kulek lub standardów kuleczkowych należy zdjąć tuleję zabezpieczającą krople, która otacza wlot próbek w niektórych cytometrach. Należy dopuścić do ściekania płynu osłonowego pomiędzy próbkami, co oczyści wlot i zapobiegnie przeniesieniu kulek z jednej próbki do drugiej.
2. Należy użyć kulek nieznakowanych, jako ujemnej kontroli fluorescencji, oraz kulek kalibracyjnych Rainbow Calibration Particles (RCPs), jako dodatniej kontroli fluorescencji, aby dostosować ustawienia w taki sposób, aby zarówno ujemne, jak i dodatnie ekstrema fluorescencji pojawiały się jednocześnie na osi x w skali logarytmicznej. Zapewnia to, że fluorescencja z próbek eksperymentalnych również znajdzie się w zakresie skali. Należy pamiętać, że RCPs są mniejsze od kulek CML, zatem parametry FSC i SSC, a także położenie bramki, mogą wymagać tymczasowej zmiany dla tej próbki.
3. Po zakończeniu kalibracji przy użyciu RCPs należy powrócić do ustawień dla kulek nieznakowanych. Jeśli w jednej próbce stosowana jest tylko jedna sonda fluorescencyjna, kompensacja fluorescencji nie jest konieczna. Zazwyczaj badamy kompleksy wielobiałkowe za pomocą pojedynczego przeciwciała mAb sprzężonego z fluorochromem w jednej próbce FCM, a wielu partnerów oddziaływań analizujemy poprzez barwienie równoległych próbek kuleczkowych przeciwciałami mAb specyficznymi dla różnych podjednostek.
4. Należy pozyskać i zapisać pliki z danymi fluorescencji. Analizę można następnie przeprowadzić za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej, takiego jak CellQuest, FlowJo lub CFlow.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. IP-FCM dla kompleksu multiproteinowego TCR/CD3. Limfocyty T od myszy szczepu BALB/c poddano lizie w 1% digitoninie, a lizat poddano analizie IP-FCM z użyciem kulek anty-CD3ε. Wychwycone kompleksy zawierały znaczne ilości TCR-β (obszar fioletowy) i współasocjowanego CD3-ε (zielony), natomiast poziomy innych białek, takich jak Thy1.2, CD45 lub H-2K(d) (odpowiednio linie brązowa, pomarańczowa i niebieska), były zbliżone do poziomu tła (zdefiniowanego przez sondę z nieistotną immunoglobuliną, linia różowa). Patrz podobne wyniki opublikowane wcześniej^1-6.

Dyskusja

Informacje o oddziaływaniach białko-białko są niezwykle istotne dla analizy wielu procesów komórkowych, takich jak transdukcja sygnału, dojrzewanie linii komórkowych, progresja cyklu komórkowego oraz kaskady apoptozy. Metoda IP-FCM zapewnia szybki, ilościowy i czuły sposób badania oddziaływań białek oraz definiowania składników kompleksów multiproteinowych w ich natywnej konformacji. Kulek może być sprzęganych i inkubowanych z lizatami komórkowymi w ciągu jednego dnia, a następnie poddawanych sondowaniu i analizie następnego dnia. Format płytki 96-dołkowej pozwala na jednoczesną analizę dużej liczby próbek, co zapewnia efektywne gromadzenie danych do celów statystycznych lub przesiewowych. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnych standardów kulek można oszacować liczbę białek uchwyconych przez każdą z nich. Do wychwytu i detekcji wymagana jest bardzo mała ilość materiału wyjściowego, dzięki czemu można analizować wielokrotne oddziaływania nawet w przypadku ograniczonych próbek i rzadkich analitów. Chociaż IP-FCM nie wymaga inżynierii genetycznej, znakowania epitopami, denaturacji ani mieszania białek in-vitro w środowisku nie fizjologicznym, może być łączona z tymi i innymi technikami, co czyni ją wartościowym i dostępnym narzędziem z zastosowaniem w wielu systemach biologicznych.

Rozwiązywanie problemów:

Wiele eksperymentów IP-FCM generuje użyteczne dane o oddziaływaniach białek już przy pierwszej próbie. Niemniej jednak optymalizacja IP-FCM może poprawić konjugację przeciwciał z kuleczkami, wychwyt kompleksów białkowych oraz wiązanie sond fluorescencyjnych.

Wydajność koniugacji przeciwciał IP można określić poprzez bezpośrednią analizę sprzęgniętych kulek za pomocą przeciwciała przeciwciał przeciwciałom (anty-immunoglobuliny). Jeśli wydajność ta jest niska, zwiększenie stężenia przeciwciał podczas reakcji sprzęgania może pozwolić na przyłączenie większej liczby przeciwciał IP do każdej kulki. Może to zwiększyć pojemność wiązania partii kulek IP, co skutkuje usprawnionym wychwytywaniem i detekcją analitów. Podczas reakcji sprzęgania nie powinny być obecne inne cząsteczki zawierające grupy aminowe pierwotne (np. Tris, albuminy surowicy bydlęcej), ponieważ mogą one konkurować z mAb o przyłączenie do kulek i prowadzić do niskiego stopnia sprzęgania mAb. Jeśli koniugacja mAb z kulkami okaże się problematyczna z innych powodów, kulki można zamiast tego sprzęgnąć z awidyną/streptawidyną, a następnie niewiązalnie przyłączyć i wykorzystać do immunoprecypitacji przeciwciała biotynilowane.

Mimo prawidłowej konjugacji przeciwciał, początkowe wykrycie fluorescencji związanej z kuleczkami może być niskie. Po pierwsze, samo wychwytywanie kompleksów może być mało efektywne. Ponieważ metoda IP-FCM zależy od stężenia analitów, zwiększenie liczby komórek lizowanych w jednostce objętości lizatu może zwiększyć wychwyt i wykrywalność analitu. Dodatkowo wychwyt można usprawnić poprzez zmniejszenie liczby kuleczek IP inkubowanych z lizatem, co rozkłada wychwycone kompleksy na mniejszą liczbę kuleczek i skutkuje zwiększoną średnią fluorescencją każdej kuleczki podczas analizy. Po drugie, możliwe jest, że dostęp przeciwciała sondy do wychwyconych kompleksów jest sterycznie blokowany przez przeciwciało immunoprecypitujące. W takim przypadku problem można rozwiązać, stosując inne przeciwciała do wychwytu i/lub sondowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kuleczki z lateksu polistyrenowego modyfikowanego grupami karboksylowymi (CML) (5mm bez surfaktanta)	Odczynnik	Interfacial Dynamics	2-5000	Przechowywać w temperaturze 4°C.
Cząsteczki kalibracyjne Rainbow	Odczynnik	Spherotech, Inc.	RCP-30-5A	Przechowywać w temperaturze 4°C.
Kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy (MES)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M-5287
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDAC)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	22980 E-6383	Przechowywać w temperaturze -20°C w warunkach osuszania.
Ogólny koktajl inhibitorów proteaz, zawierający AEBSF, Bestatynę, Aprotininę, EDTA, E-64 i Leupeptynę	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P-2714	Przygotować 100-krotny roztwór zapasowy w H2O. Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20°C. Operować w rękawiczkach.
Płytki PCR, 96-dołkowe 0,2mL, naturalne, z wysokim kominkiem	Odczynnik	Fisher Scientific	08-408-230	Do użycia zamiast probówek do mikrowirówki podczas barwienia do FCM