Pseudozłamanie, odtwarzalny mysi model sterylnego urazu układu mięśniowo-szkieletowego, umożliwia ocenę późnych odpowiedzi immunologicznych po urazie. Niniejszy artykuł opisuje krok po kroku wykonanie procedury tego modelu, w tym możliwość łączenia modeli eksperymentalnych w celu badania urazów wielonarządowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pseudozłamanie: model ostrego urazu tkanek obwodowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po urazie występuje wczesna, nadreaktywna odpowiedź zapalna, która może prowadzić do wielonarządowej niewydolności i wysokiej śmiertelności u pacjentów z urazami; odpowiedzi tej często towarzyszy opóźniona immunosupresja, która powoduje kliniczne powikłania w postaci infekcji i może również zwiększyć śmiertelność.1-9 W wielu badaniach zaczęto oceniać te zmiany w reaktywności układu odpornościowego po urazie.10-15
Badania immunologiczne są w dużym stopniu wspierane przez szeroką gamę dostępnych myszy transgenicznych i nokautowych do modelowania in vivo; szczepy te pomagają w szczegółowych badaniach nad oceną szlaków molekularnych zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne.16-21
Wyzwaniem w eksperymentalnym modelowaniu urazów u myszy są badania długoterminowe, ponieważ techniki stabilizacji złamań u tych zwierząt mogą być złożone i trudne do odtworzenia.22-30
Ten model pseudozłamania, będący łatwo powtarzalnym modelem urazu, pozwala pokonać te trudności poprzez immunologiczne naśladowanie środowiska złamania kończyny, umożliwiając jednocześnie zwierzętom swobodę ruchów oraz długoterminowe przeżycie bez konieczności ciągłego i przedłużonego stosowania znieczulenia. Celem jest odtworzenie cech złamania kości długiej; uszkodzone mięśnie i tkanki miękkie są eksponowane na uszkodzoną kość i szpik kostny bez konieczności łamania natywnej kości.
Model pseudozłamania składa się z dwóch etapów: obustronnego zmiażdżenia mięśni kończyn tylnych, a następnie wstrzyknięcia roztworu kostnego do tych uszkodzonych mięśni. Roztwór kostny przygotowuje się poprzez pobranie kości długich z obu kończyn tylnych syngeneicznego dawcy o zbliżonym wieku i masie ciała. Kości te są następnie miażdżone i resuspensowane w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w celu otrzymania roztworu kostnego.
Obustronne złamanie kości udowej jest powszechnie stosowanym i dobrze opracowanym modelem urazu kończyn, który służył jako model porównawczy podczas opracowywania modelu pseudozłamania. spośród wielu dostępnych modeli złamań, w porównaniu do pseudozłamania wybraliśmy zamkniętą metodę złamania z urazem tkanek miękkich, ponieważ zależało nam na uzyskaniu sterylnego, a jednocześnie proporcjonalnie ciężkiego modelu urazu tkanek obwodowych. 31
Wstrząs krwotoczny jest częstym zjawiskiem w przebiegu ciężkich urazów, a globalna hipoperfuzja stanowi istotny element modelu urazowego. 32-36 Model pseudozłamania można łatwo połączyć z modelem wstrząsu krwotocznego, aby stworzyć model politraumy o wysokim stopniu ciężkości. 37
Protokół
1. Przygotowanie instrumentarium i pola operacyjnego:
Wszystkie procedury eksperymentalne są wykonywane z zachowaniem zasad aseptyki. Przed rozpoczęciem pracy obszar eksperymentalny musi zostać dokładnie oczyszczony i wysterylizowany. Blat należy zdezynfekować, pozostawić do wyschnięcia, a następnie przetrzeć 70% alkoholem. W obszarze roboczym należy umieścić chirurgiczną podkładkę absorbującą i jałowy opatrunek.
Wszystkie materiały i instrumenty są sterylizowane w autoklawie przed użyciem. Strzykawki i igły są dostarczane w stanie sterylnym. Badacz powinien być odpowiednio ubrany w fartuch laboratoryjny, maseczkę chirurgiczną i sterylne rękawiczki chirurgiczne.
Nasze instrumenty chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie każdego wieczora. Po operacji są one myte wodą i mydłem antybakteryjnym. Następnie pozostawia się je do wyschnięcia na czystej, niebieskiej podkładce chirurgicznej. Po wyschnięciu są one ostrożnie umieszczane w workach do sterylizacji i sterylizowane do późniejszego użycia.
Włącz sterylizator do koralików, aby upewnić się, że osiągnie odpowiednią temperaturę 300-350°F przed rozpoczęciem eksperymentu. Sterylizator ten będzie służył do czyszczenia narzędzi pomiędzy procedurami eksperymentalnymi przeprowadzanymi na poszczególnych myszach. Przygotuj tacę na narzędzia ze stali nierdzewnej i wypełnij ją w 1/3 70% etanolem. Ilość 70% etanolu powinna być wystarczająca, aby przykryć narzędzia chirurgiczne. Włącz cyrkulacyjną podkładkę grzewczą, połóż na niej niebieską podkładkę chirurgiczną, a następnie sterylny opatrunek do wyznaczenia pola operacyjnego. Grzejnik ten jest stosowany w celu zapewnienia odpowiedniego ciepła myszy podczas procedury eksperymentalnej oraz w okresie rekonwalescencji. Na sterylnym opatrunku umieść wszystkie sterylne narzędzia, gazę, strzykawki, igły oraz probówkę mikrocentryfugową o pojemności 1.5mL. Zachowaj ostrożność podczas otwierania sterylnych narzędzi i innych elementów, aby nie zanieczyścić ich poprzez dotknięcie. Podczas przygotowywania stanowiska najlepiej używać sterylnych rękawiczek.
2. Model pseudozłamania - procedury eksperymentalne:
1. Indukcja znieczulenia i pozycjonowanie myszy.
Zacznij od podania doprzewnowłasnego wstrzyknięcia Pentobarbitalu (70mg/kg). Należy to zrobić, najpierw podnosząc mysz z klatki za proksymalny koniec ogona. Następnie należy zważyć mysz, aby obliczyć prawidłową dawkę środka znieczulającego. Potem umieść zwierzę na górze klatki, wciąż trzymając je za ogon. Chwyć skórę na karku myszy kciukiem i środkowym palcem po obu stronach ciała, tuż za przednimi łapami. Palec wskazujący służy do odciągnięcia skóry w okolicy głowy i szyi do tyłu oraz częściowego unieruchomienia głowy. Ogon myszy należy trzymać między małym a serdecznym palcem, podczas gdy palec serdeczny jest dociskany do odcinka lędźwiowego kręgosłupa myszy. Znieczulenie powinno w pełni zadziałać w ciągu około 5 minut, co należy potwierdzić testem odruchów.
Po uśpieniu zwierzęcia umieść mysz w pozycji grzbietnej na płycie z pleksiglasu i unieruchom ją, przyklejając kończyny za pomocą techniki luźnych pętli. Technika luźnych pętli polega na wycięciu cienkich pasków taśmy i luźnym owinięciu nimi dystalnej części każdej kończyny. Następnie taśma jest przyklejana do siebie, a pozostały fragment mocuje się do płyty. Pozwala to na spójne przeprowadzenie manipulacji eksperymentalnej oraz zapewnia, że kończyny myszy przyjmują bardziej naturalną pozycję. Następnie, aby pomóc w utrzymaniu pola sterylnego, obszary brzucha, pachwin i ud zwierzęcia zostają ogolone za pomocą maszynki Oster A5 (głowica rozmiar 40). Gazę 4x4 nasącza się betadyną, a następnie przeciera obszar operacyjny w celu sterylizacji. Na koniec składa się i nakłada na mysz jałowy obłoż, aby odsłonić jedynie kończyny dolne i głowę.
Po unieruchomieniu i sterylizacji, przed rozpoczęciem procedury eksperymentalnej, należy umieścić nad nosem myszy lejek do podawania izofluranu na kilka sekund. Lejek składa się z probówki stożkowej o pojemności 50cc wypełnionej gazą. Połowa dolnego końca probówki jest wycięta, aby stworzyć miejsce na nos myszy. Na wyciętym końcu probówki stożkowej umieszcza się nasadkę (dno pojemnika do przechowywania tkanek, np. słoika o szerokim otworze i prostych ściankach), aby zapewnić pozostanie oparów izofluranu w probówce, gdy nie jest ona używana. Do gazy wewnątrz lejka należy dodać 1 mL izofluranu. Podczas stosowania znieczulenia, a w szczególności podczas podawania izofluranu za pomocą lejka, należy zachować szczególną ostrożność w obserwacji myszy. Gdy oddech zwierzęcia zacznie zwalniać, można rozpocząć eksperyment, a lejek należy zdjąć i zamknąć.
Jeśli w dowolnej części eksperymentu wymagane będzie dodatkowe znieczulenie, można podać dodatkową dawkę pentobarbitalu lub zastosować izofluran. Dostępne są alternatywne metody podawania izofluranu, a aktualne wytyczne zalecają stosowanie precyzyjnego parownika w celu lepszej kontroli znieczulenia, jeśli jest to możliwe. Niezależnie od zastosowanej metody należy jednak zapewnić ścisły nadzór nad fizjologią układu oddechowego myszy.
2. Eksperyment z pseudozłamaniem.
Pseudozłamanie polega na połączeniu urazu tkanek miękkich, po którym następuje wstrzyknięcie roztworu kostnego do uszkodzonego mięśnia; zabieg ten jest wykonywany obustronnie w kończynach tylnych. Roztwór kostny musi zostać przygotowany przed rozpoczęciem jakichkolwiek manipulacji eksperymentalnych u myszy biorców.
3. Przygotowanie roztworu do kości.
Roztwór kostny przygotowany z jednej myszy donora będzie wystarczający dla 3 myszy biorców. Należy użyć syngeneicznej myszy donora, która jest dopasowana pod względem wieku i masy ciała do myszy biorcy w grupie eksperymentalnej.
Myszy dawcy zostanie poddana eutanazji poprzez inhalację izofluranem. Następnie zwierzę zostanie przymocowane taśmą do płyty z pleksiglasu, zwracając szczególną uwagę na to, aby kończyny dolne przymocować jedynie za pomocą taśmy na końcach stóp. Kończyny dolne należy starannie ogolić i dokładnie pokryć betadyną, a następnie przetrzeć alkoholem w celu zapewnienia sterylności. Następnie z obu kończyn dolnych w sposób sterylny zostaną chirurgicznie usunięte kość udowa i piszczelowa. Aby usunąć kości długie z kończyny dolnej, należy wykonać nacięcie chirurgiczne skóry w okolicy pachwinowej, a następnie kontynuować nacinanie skóry wzdłuż kończyny, aż do kostki. Odsunąć skórę i oddzielić ją od powięzi podskórnej i mięśni zarówno od strony przyśrodkowej, jak i bocznej, aby uzyskać maksymalną ekspozycję. Jedno ostrze nożyczek należy wsunąć pod mięśnie znajdujące się przednio-bocznie względem piszczeli (mięsień piszczelowy przedni, mięsień prostownik długi palców, mięsień prostownik długi palucha, mięsień strzałkowy długi, mięsień strzałkowy krótki), a następnie przesuwać ostrze proksymalnie i dystalnie, aby czysto oddzielić mięśnie od leżącej pod nimi kości. Powtórzyć tę technikę na tylnej i przyśrodkowej stronie piszczeli, aby odseparować mięśnie znajdujące się pod piszczelą (mięsień brzuchaty łydki, mięsień płaszczkowaty, mięsień plantarny, mięsień piszczelowy tylny, mięsień zginacz długi palców, mięsień zginacz długi palucha). Podczas przesuwania ostrza dystalnie po stronie tylnej należy użyć minimalnej dodatkowej siły, aby oddzielić kość strzałkową od piszczeli. Na końcach proksymalnych tych mięśni kończyn należy przeciąć ścięgna jak najbliżej ich przyczepów i odsunąć mięśnie dystalnie, pociągając całą grupę mięśniową w dół; krótkie szarpnięcie uwolni dystalne przyczepy tych mięśni ze stawu skokowego. Staw skokowy można przeciąć bezpośrednio nożyczkami. Na tym etapie nie należy oddzielać piszczeli od kości udowej! Połączenie to zapewnia dodatkową dźwignię, która ułatwi wypreparowanie kości udowej ze stawu biodrowego. W celu uwolnienia mięśni z kości udowej należy zastosować podobną technikę, wykonując ją z tyłu oraz, jeśli to konieczne, z obu stron — przyśrodkowej i bocznej. Przeciąć dystalne przyczepy tych grup mięśniowych, aby uwolnić je ze stawu kolanowego. Kontynuować dyssekcję, przechodząc pod mięśniami, aby wypreparować koniec kości udowej ze stawu biodrowego. Aby ułatwić tę dyssekcję, nacięcie skóry należy przedłużyć w stopniu niezbędnym do uzyskania odpowiedniej ekspozycji. Ruch kości udowej w stawie biodrowym może pomóc w zlokalizowaniu końca proksymalnego kości udowej podczas dyssekcji.
Po usunięciu kości udowej (z przytwierdzoną kością piszczelową) z myszy dawcy, należy umieścić je na sterylnym gaziku 4x4. Dwie kości można rozdzielić w stawie kolanowym, chwytając każdą z nich w osobnej dłoni i delikatnie skręcając/obracając obie kości w przeciwnych kierunkach wzdłuż ich osi długiej. Zaleca się ostrożną dyssekcję i obchodzenie się z tymi kośćmi, ponieważ mogą one ulec łatwemu złamaniu przy zbyt silnej manipulacji ręcznej. Aby usunąć pozostałe przyczepy ścięgniste z kości długich, należy użyć suchego, sterylnego fragmentu gazika 4x4 owiniętego wokół długości kości. Należy mocno docisnąć gazik do kości i przeciągnąć go kilka razy na całej jej długości; pozwoli to zeskrobać pozostałe tkanki z powierzchni kości, ponieważ przylegają one do gazy i zostają szybko i łatwo od nich oddzielone. Zebrane kości należy następnie umieścić bezpośrednio w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5mL i pozostawić w lodzie na czas transportu.
Te cztery kości dawcy zostaną przeniesione do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu przygotowania do kąpieli kostnej. Wyciąg musi zostać dokładnie zdezynfekowany przed użyciem; na obszarze roboczym wewnątrz komory należy umieścić jałowy opatrunek. W obszarze roboczym należy umieścić jałowy moździerz z tłuczkiem, jałową probówkę 8mL oraz jałowy roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Wewnątrz komory powinna znajdować się pipeta automatyczna 1mL oraz odpowiednie końcówki.
Do sterylnego przeniesienia pobranych kości z probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5mL do moździerza należy użyć sterylnej pincety, a następnie za pomocą tłuczka delikatnie rozkruszyć kości. Jako medium do resuspensji fragmentów kości przed wstrzyknięciem stosuje się roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Do moździerza należy pipetować 1mL PBS i kontynuować rozdrabnianie pozostałych fragmentów, wykonując dodatkowe ruchy okrężne, aby zapewnić pełną resuspensję. Następnie dodaje się kolejny 1mL PBS i kontynuuje rozcieranie w celu przygotowania „roztworu kostnego”. Roztwór powinien mieć różowy odcień, a na dnie moździerza pozostaną resztki, których nie da się całkowicie rozbić. Należy powoli przelać roztwór z moździerza do probówki o pojemności 8mL, aby zebrać maksymalną objętość, dbając jednocześnie o to, by większe fragmenty pozostały w moździerzu. Roztwór kostny powinien być przechowywany w lodzie do momentu użycia w doświadczeniu, a następnie przeniesiony do strzykawek 1mL w celu iniekcji. Do strzykawki 1mL z roztworem kostnym należy później przymocować igłę o rozmiarze 20G, aby podać go myszy. Wybrano tak duży rozmiar igły, aby mieć pewność, że wszystkie fragmenty kości zostaną wprowadzone do obszaru docelowego podczas wstrzykiwania i nie zablokują igły.
Przed wstrzyknięciem myszy biorcy, kroplę roztworu kostnego nanosi się na płytkę z agarem MacConkeya w celu hodowli (inkubacja przez 24-48hours). Ma to na celu zapewnienie sterylności roztworu kostnego. Należy również sprawdzić pH roztworu kostnego, aby upewnić się, że ma on neutralne pH.
4. Uraz tkanek miękkich.
Niniejszy uraz tkanek miękkich jest obustronnym zmiażdżeniem kończyn tylnych. Początkowe ułożenie myszy, z kończynami tylnymi lekko odwiedzionymi i rotowanymi na zewnątrz, ułatwia dostęp do właściwej grupy mięśni, czyli zginaczy kolana (mięsień dwugłowy uda, mięsień półścięgnisty i mięsień półbłonisty). Do wykonania zmiażdżenia zostanie użyta duża kleszczyk hemostatyczny o długości 18cm. Rozkład siły tych kleszczyków został przeanalizowany za pomocą systemu Topaq Pressure Analysis System firmy Sensor Products Inc. i wyniósł 270psi. Kleszczyki należy zacisnąć wokół tylnej muskulatury uda, w połowie długości kości udowej, stroną wypukłą skierowaną w stronę kości udowej. Następnie kleszczyki należy zablokować tylko do pierwszego kliknięcia i pozostawić na 30 sekund. Ważna jest szczególna uwaga przy rozmieszczaniu kleszczyków – nie mogą być one zacisnięte bezpośrednio na kości udowej, aby zapobiec jej złamaniu. Czynność tę należy wykonywać w ten sam sposób za każdym razem, aby zagwarantować powtarzalność urazu pomiędzy myszami. Zmiażdżenie to jest wykonywane na obu kończynach dolnych.
5. Iniekcja roztworu kostnego.
Myszy eksperymentalnej biorcy zostanie podano znieczulenie i przygotowano ją zgodnie z wcześniejszym opisem; przed wykonaniem tej iniekcji do kości u zwierzęcia wywołano uraz tkanek miękkich.
Następnie roztwór kostny zostanie wstrzyknięty obustronnie do zmiażdżonej muskulatury uda myszy biorcy. Przy użyciu igły o rozmiarze 20 G do tylnych mięśni każdego uda należy wstrzyknąć 0,15mL tego roztworu. Wprowadź igłę przez skórę na głębokość około 2~3mm, zwracając uwagę na dystans wprowadzenia igły – należy poczuć, gdy czubek ścięcia igły delikatnie dotknie kości udowej; jest to pozycja optymalna. Teraz wstrzyknij roztwór kostny. Wyjmij igłę i szybko przyłóż palec w sterylnej rękawiczce do miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się roztworu kostnego z rany. Przytrzymaj palec w tej pozycji przez kilka sekund.
Następnie mysz należy umieścić z powrotem w klatce i zapewnić jej pełną swobodę ruchów bezpośrednio po ustąpieniu znieczulenia. W miarę budzenia się myszy należy zastosować odpowiednie leki przeciwbólowe.
6. Okres pooperacyjny/rekonwalescencji.
Luźną taśmę w pętli usuwa się, a zwierzęta umieszcza w czystej klatce, którą przez kilka godzin po wybudzeniu utrzymuje się na cyrkulacyjnej podkładce grzewczej. W razie potrzeby należy zapewnić odpowiednie ciepło za pomocą dodatkowej lampy grzewczej.
Pokarm i woda będą łatwo dostępne.
Leki przeciwbólowe muszą zostać podane w momencie, gdy zwierzęta zaczynają budzić się z narkozy, aby prawidłowo kontrolować ból. Buprenorfinę (0.1mg/kg) wstrzykuje się podskórnie, gdy zwierzęta rozpoczynają aktywność fizyczną, lecz nie wcześniej, aby nie upośledzać funkcji oddechowych.
Myszy należy stale monitorować podczas znieczulenia, aż do momentu wybudzenia lub osiągnięcia punktu końcowego eksperymentu. W okresie pooperacyjnym należy również bardzo uważnie obserwować myszy i w razie potrzeby podawać dodatkowe leki przeciwbólowe. Należy monitorować aktywność fizyczną zwierząt, stan układu oddechowego, spożycie pokarmu i wody; wszelkie oznaki stresu lub cierpienia (utrudnione oddychanie, ból, zmiany w nawykach żywieniowych i piciu) powinny być odpowiednio leczone.
Umieść narzędzia chirurgiczne w 70% alkoholu i przetrzyj je sterylną gazą, a następnie włóż do sterylizatora koralikowego na ~20 sekund w celu sterylizacji pomiędzy zwierzętami. Wyjmij narzędzia chirurgiczne i spryskaj je 70% alkoholem, aby pomóc im ostygnąć. Połóż je na sterylnym polu operacyjnym. Upewnij się, że na narzędziach nie pozostał alkohol, który mógłby ścieknąć do kolejnego zwierzęcia.
3. Porównawczy model obustronnego złamania kości udowej - procedury eksperymentalne:
Myszy doświadczalnej podano znieczulenie i przygotowano ją zgodnie z opisem wstępnym. Duży zacisk hemostatyczny o długości 18cm należy zacisnąć na kończynie tylnej około 2-3mm powyżej stawu kolanowego, tak aby jego wypukła powierzchnia była skierowana w stronę kolana. Kciuk należy położyć na zacisniętym hemostacie, a palec wskazujący między hemostatem a biodrem. Przed skręceniem należy upewnić się, że wyczuwa się kość udową, aby wiedzieć, w którym miejscu nastąpi złamanie. Następnie należy skręcić hemostat w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, jednocześnie skręcając drugą ręką w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
Procedurę należy powtórzyć na przeciwległej nodze.
4. Model wielonarządowej urazy - procedura eksperymentalna dla połączenia pseudozłamania z wstrząsem krwotocznym:
Myszy biorące udział w eksperymencie zostaną poddane znieczuleniu i przygotowane zgodnie z opisem początkowym. W przypadku myszy, u których planowany jest wstrząs krwotoczny w połączeniu z pseudozłamaniem, przed procedurą pseudozłamania zostanie wykonana kanulacja tętnicy udowej, a następnie, po zakończeniu pseudozłamania, zostanie przeprowadzone upuszczenie krwi przez ten cewnik.
5. Wskazówki dla sukcesu:
Ogólne:
- Należy dołożyć szczególnych starań, aby zachować jak najwyższy stopień sterylności.
- Podczas podawania znieczulenia, a w szczególności izofluranu za pomocą maski nosowej, należy zachować skrupulatną uważność w monitorowaniu ogólnego stanu fizjologicznego myszy, w tym częstotliwości oddychania.
Przygotowanie roztworu do kości:
- Ostrożna manipulacja kośćmi – mogą one ulec łatwemu złamaniu przy zbyt silnym nacisku podczas prostej manipulacji manualnej!
- Podczas sekcji należy upewnić się, że strzałka została oddzielona od piszczeli.
- Rozpocznij od delikatnego kruszenia kości – aby wszystkie fragmenty pozostały wewnątrz moździerza!
- Na początku dodaj tylko 1 mL PBS i kontynuuj kruszenie pozostałych fragmentów kości; gdy powstanie odpowiednia zawiesina, dodaj pozostały 1 mL.
- Należy zebrać wyłącznie roztwór z moździerza i tłuczka – bez większych pozostałości tkanek, których nie udało się całkowicie rozdrobić – mogą one bowiem zablokować igłę podczas wstrzykiwania do myszy biorcy.
Uraz tkanek miękkich:
- Precyzyjne umieszczenie kleszczyków hemostatycznych jest istotne – nie należy ich umieszczać nad kością udową, aby uniknąć jej złamania. W celu uzyskania powtarzalnego urazu, należy zacisnąć kleszczyki na odpowiedniej muskulaturze (tylna część uda – zginacze kolana).
Iniekcja roztworu do kości:
- Podczas wstrzykiwania roztworu należy zwrócić uwagę na głębokość wprowadzenia igły – idealnym położeniem jest moment, w którym poczujesz, że skos igły ledwo dotyka kości udowej.
- Wyjmij igłę i szybko przyciśnij palcem miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się roztworu kostnego z rany. Przytrzymaj palec przez kilka sekund.
6. Kwestie pooperacyjne:
- Sprawdzić, czy w nodze występuje infekcja.
- Sprawdzić kulturę w roztworze kostnym.
- Zwierzę może mieć trudności z poruszaniem kończynami tylnymi w wyniku manipulacji eksperymentalnych i towarzyszącego im stanu zapalnego. Należy odpowiednio łagodzić ból.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pseudozłamanie, odtwarzalny mysi model jałowej urazy mięśniowo-szkieletowej, umożliwia ocenę potraumatycznych odpowiedzi immunologicznych. Model pseudozłamania na poziomie immunologicznym naśladuje środowisko złamania kończyny poprzez odtworzenie cech złamania kości długiej: uszkodzone mięśnie i tkanki miękkie są eksponowane na uszkodzoną kość i szpik kostny bez łamania naturalnej kości.38,39 Po urazie w modelu pseudozłamania można zaobserwować dwufazową odpowiedź immunologiczną, która składa się z wczesnej od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee oraz Research Conduct and Compliance Office Uniwersytetu w Pittsburghu, który jest instytucją akredytowaną przez AALAS/AAALAC. Zwierzęta pochodziły z Jackson Laboratories oraz Charles Rivers Laboratories. Wszystkie zwierzęta poddano szczegółowej kontroli stanu zdrowia przez dostawców, a także wewnętrznym programom monitorowania zdrowia zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Badania te są prowadzone zgodnie z zasadami rządu USA dotyczącymi wykorzystania kręgowców. Program jest zarejestrowany w USDA i posiada list zapewnienia (letter of assurance) wystawiony przez Public Health Service Office of Laboratory Animal Welfare.
Podziękowania
Źródło finansowania /Numer Molecular Biology of Hemorrhagic Shock GM053789
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podkład chirurgiczny w kolorze niebieskim | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Sterylne opatrunki polowe | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Podgrzewacz cyrkulacyjny 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Sterylizator koralikowy do narzędzi | VWR international | 11156-002 | |
| Taca ze stali nierdzewnej 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Płyty z pleksiglasu (10x15x0,5 cm) | Warsztat mechaniczny University of Pittsburgh | ||
| Rolki taśmy 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| probówka stożkowa 50 ml | Dowolny dostawca | ||
| Słoiki z prostymi ściankami i szerokim otworem (używane jako nasadka stożka nosowego) | VWR international | 159000-058 | |
| Maszynka do strzyżenia Oster A5 z nasadką nr 40 | VWR international | 10749-020 | |
| Nożyczki chirurgiczne (proste) – 12 cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Kleszczyki hemostatyczne zakrzywione - 18 cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Pinceta (końcówka 0,8 mm, zakrzywiona, 10 cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gaza 4"x4" | Dowolny dostawca | ||
| probówka do mikrowirówki 1,5 ml | Dowolny dostawca | ||
| Kubełek z lodem | Dowolny dostawca | ||
| Moździerz i tłuczek | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| strzykawka 1 cm³ z igłą 25G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| igła 20G | Dowolny dostawca | ||
| pipetka automatyczna 1 ml | Dowolny dostawca | ||
| końcówki do pipety 1 ml | Dowolny dostawca | ||
| probówki polistyrenowe Falcon 8 ml | VWR international | 60819-331 | |
| Worek do sterylizacji 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Worek do sterylizacji 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| płytka z agarem MacConkey II | BD Biosciences | 221172 | |
| Alkohol etylowy – 100% | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital sodowy (roztwór Nembutol Sodium) | OVATION Pharmaceuticals | 70 mg/kg | |
| Aerrane (izofluran) | Baxter International Inc. | 99.9% | |
| Powididyna jodowa Triadine (Betadine) | Wyroby jednorazowe Triad | ||
| bufor fosforanowo-solny (PBS) | |||
| Chlorowodorek buprenorfiny | Bedford Laboratories | 0,1 mg/kg |
Bibliografia
- DeCamp, M. M., Demling, R. H. Posttraumatic multisystem organ failure. JAMA. 260, 530-534 (1988).
- Deitch, E. A. Multiple organ failure. Pathophysiology and potential future therapy. Ann Surg. 216, 117-134 (1992).
- Carrico, C. J., Meakins, J. L., Marshall, J. C. Multiple organ failure syndrome. Arch Surg. 121, 196-208 (1986).
- Hauser, C. J., Joshi, P., Jones, Q. Suppression of natural killer cell activity in patients with fracture/soft tissue injury. Arch Surg. 132, 1326-1330 (1997).
- Faist, E., Baue, A. E., Dittmer, H. Multiple organ failure in polytrauma patients. J Trauma. 23, 775-787 (1983).
- Baker, C. C., Oppenheimer, L., Stephens, B. Epidemiology of trauma deaths. Am J Surg. 140, 144-150 (1980).
- Faist, E., Kupper, T. S., Bakeer, C. L. Depression of cellular immunity after major injury its association with posttraumatic complications and its reversal with immunomodulation. Arch Surg. 121, 1000-1005 (1986).
- Lenz, A., Franklin, G. A., Cheadle, W. G. Systemic inflammation after trauma. Injury. 38, 1336-1345 (2007).
- Flohe, S., Flohe, S. B., Schade, F. G. Immune response of severely injured patients--influence of surgical intervention and therapeutic impact. Lang Arch Surg. 392, 639-648 (2007).
- Ayala, A., Wang, P., Ba, Z. F. Differential alterations in plasma IL-6 and TNF levels after trauma and hemorrhage. Am J Physiol. 260, R167-R171 (1991).
- Kalicke, T., Schlegel, U., Printzen, G. Influence of a standardized closed soft tissue trauma on resistance to local infection. An experimental study in rats. J Ortho Res. 21, 373-378 (2003).
- Kobbe, P., Vodovotz, Y., Kaczorowski, D. J. The role of fracture associated soft tissue injury in the induction of sytemic inflammation and remote organ dysfunction after bilateral femur fracture. J Ortho Trauma. 22, 385-390 (2008).
- Kobbe, P., Vodovotz, Y., Kaczorwoski, D. J. Pattern of cytokine release and evolution of remote organ dysfunction after bilateral femur fracture. Shock. 30, 43-47 (2008).
- Flohe, S. B., Flohe, S., Schade, F. U. Deterioration of the immune system after trauma: signals and cellular mechanisms. Inn. Immun. 14, 333-344 (2008).
- Maier, B., LeFering, R., Lhenert, M. Early versus late onset of multiple organ failure is associated with differing patterns of plasma cytokine biomarker expression and outcome after severe trauma. Shock. 28, 668-674 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. W. Of mice not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Hoth, J. J., Wells, J. D., Brownlee, N. A. Toll like receptor 4-dependent responses to lung injury in a murine model of pulmonary contusion. Shock. 31, 376-381 (2009).
- Matsutani, T., Samy, A. nantha, Rue, T. S., W, L. Transgenic prolactin-/- mice: effect of trauma-hemorrhage on splenocyte functions. Am J Physiol Cell Physiol. 288, 1109-1116 (2005).
- Matsutani, T., Samy, A. nantha, Kang, T. S., S-C, Mouse genetic background influences severity of immune responses following trauma-hemorrhage. Cytokine. 30, 168-117 (2005).
- Tsukamoto, T., Pape, H. C. Animal models for trauma research: What are the options. Shock. 31, 3-10 (2008).
- DeMaria, E. J., Pellicane, J. V., Lee, R. B. Hemorrhagic shock in endotoxin resistant mice : Improved survival unrelated to deficient production of tumor necrosis factor. J Trauma. 35, 720-724 (1993).
- Jamsa, T., Jalovaara, P., Peng, Z. Comparison of three-point bending test and peripheral quantitative computed tomography analysis in the evaluation of the strength of mouse femur. Bone. 23, 155-161 (1998).
- Bounarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Ortho Res. 2, 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U. Development of a locking femur nail for mice. J Biomech. 40, 215-219 (2007).
- Holstein, J. H., Garcia, P., Histing, T. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J Orthop Trauma. 23, Suppl 5. S31-S38 (2009).
- Histing, T., Garcia, P., Matthys, R. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Research. 28, 397-402 Forthcoming.
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Ortho Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Mark, H., Bergholm, J., Nilsson, A. An external fixation method and device to study fracture healing in rats. Acta Orthop Scand. 74, 476-487 (2003).
- Bhandari, M., Shanghnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121, 591-593 (2001).
- Sonanis, S. V., Lampard, A. L., Kamat, N. A simple technique to remove a bent femoral intramedullary nail and broken interlocking screw. J Trauma. 63, 435-438 (2007).
- Kobbe, P., Kaczorwoski, D. J., Vodovotz, Y. Local exposure of bone components to injured soft tissue induces Toll-like receptor 4-dependent systemic inflammation with acute lung injury. Shock. 30, 686-691 (2008).
- Bumann, M., Henke, T., Gerngross, H. Influence of haemorrhagic shock on fracture healing. Lang Arch Surg. 388, 331-338 (2003).
- Santry, H. P., Alam, H. B. Fluid resuscitation: past, present, and the future. Shock. 33, 229-241 (2010).
- Hierholzer, C., Billiar, T. R. Molecular mechanisms in the early phase of hemorrhagic shock. Lang Arch Surg. 386, 302-308 (2001).
- Chaudry, I., Ayala, A., Ertel, W. Hemorrhage and resuscitation: immunological aspects. Am J Physiol. 259, 63-678 (1990).
- Kawasaki, T., Hubbard, W. J., Choudhry, M. A. Trauma-hemorrhage induces depressed splenic dendritic cell functions in mice. J Immunol. 177, 4514-4520 (2006).
- Kohut, L., Darwiche, S. S., Frank, A. M., Brumfield, J. M., Billiar, T. R. Fixed volume or Fixed Pressure: A Murine Model of Hemorrhgaic Shock. J Vis Exp. , (2010).
- Menzel, C. L., Pfeifer, R., Darwiche, S. S. Models of lower extremity damage in mice: time course of organ damage and immune response. J Surg Res. 166, e149-e156 (2011).
- Pfeifer, R., Kobbe, P., Darwiche, S. S. Role of hemorrhage in the induction of systemic inflammation and remote organ damage: Analysis of combined pseudo-fracture and hemorrhagic shock. J Orthop Res. 29, 270-274 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
