Pseudozłamanie, odtwarzalny mysi model sterylnego urazu układu mięśniowo-szkieletowego, umożliwia ocenę późnych odpowiedzi immunologicznych po urazie. Niniejszy artykuł opisuje krok po kroku wykonanie procedury tego modelu, w tym możliwość łączenia modeli eksperymentalnych w celu badania urazów wielonarządowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pseudozłamanie: model ostrego urazu tkanek obwodowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po urazie występuje wczesna, nadreaktywna odpowiedź zapalna, która może prowadzić do wielonarządowej niewydolności i wysokiej śmiertelności u pacjentów z urazami; odpowiedzi tej często towarzyszy opóźniona immunosupresja, która powoduje kliniczne powikłania w postaci infekcji i może również zwiększyć śmiertelność.1-9 W wielu badaniach zaczęto oceniać te zmiany w reaktywności układu odpornościowego po urazie.10-15
Badania immunologiczne są w dużym stopniu wspierane przez szeroką gamę dostępnych myszy transgenicznych i nokautowych do modelowania in vivo; szczepy te pomagają w szczegółowych badaniach nad oceną szlaków molekularnych zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne.16-21
Wyzwaniem w eksperymentalnym modelowaniu urazów u myszy są badania długoterminowe, ponieważ techniki stabilizacji złamań u tych zwierząt mogą być złożone i trudne do odtworzenia.22-30
Ten model pseudozłamania, będący łatwo powtarzalnym modelem urazu, pozwala pokonać te trudności poprzez immunologiczne naśladowanie środowiska złamania kończyny, umożliwiając jednocześnie zwierzętom swobodę ruchów oraz długoterminowe przeżycie bez konieczności ciągłego i przedłużonego stosowania znieczulenia. Celem jest odtworzenie cech złamania kości długiej; uszkodzone mięśnie i tkanki miękkie są eksponowane na uszkodzoną kość i szpik kostny bez konieczności łamania natywnej kości.
Model pseudozłamania składa się z dwóch etapów: obustronnego zmiażdżenia mięśni kończyn tylnych, a następnie wstrzyknięcia roztworu kostnego do tych uszkodzonych mięśni. Roztwór kostny przygotowuje się poprzez pobranie kości długich z obu kończyn tylnych syngeneicznego dawcy o zbliżonym wieku i masie ciała. Kości te są następnie miażdżone i resuspensowane w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w celu otrzymania roztworu kostnego.
Obustronne złamanie kości udowej jest powszechnie stosowanym i dobrze opracowanym modelem urazu kończyn, który służył jako model porównawczy podczas opracowywania modelu pseudozłamania. spośród wielu dostępnych modeli złamań, w porównaniu do pseudozłamania wybraliśmy zamkniętą metodę złamania z urazem tkanek miękkich, ponieważ zależało nam na uzyskaniu sterylnego, a jednocześnie proporcjonalnie ciężkiego modelu urazu tkanek obwodowych. 31
Wstrząs krwotoczny jest częstym zjawiskiem w przebiegu ciężkich urazów, a globalna hipoperfuzja stanowi istotny element modelu urazowego. 32-36 Model pseudozłamania można łatwo połączyć z modelem wstrząsu krwotocznego, aby stworzyć model politraumy o wysokim stopniu ciężkości. 37
Protokół
1. Przygotowanie instrumentarium i pola operacyjnego:
Wszystkie procedury eksperymentalne są wykonywane z zachowaniem zasad aseptyki. Przed rozpoczęciem pracy obszar eksperymentalny musi zostać dokładnie oczyszczony i wysterylizowany. Blat należy zdezynfekować, pozostawić do wyschnięcia, a następnie przetrzeć 70% alkoholem. W obszarze roboczym należy umieścić chirurgiczną podkładkę absorbującą i jałowy opatrunek.
Wszystkie materiały i instrumenty są sterylizowane w autoklawie przed użyciem. Strzykawki i igły są dostarczane w stanie sterylnym. Badacz powinien być odpowiednio ubrany w fartuch laboratoryjny, maseczkę ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pseudozłamanie, odtwarzalny mysi model jałowej urazy mięśniowo-szkieletowej, umożliwia ocenę potraumatycznych odpowiedzi immunologicznych. Model pseudozłamania na poziomie immunologicznym naśladuje środowisko złamania kończyny poprzez odtworzenie cech złamania kości długiej: uszkodzone mięśnie i tkanki miękkie są eksponowane na uszkodzoną kość i szpik kostny bez łamania naturalnej kości.38,39 Po urazie w modelu pseudozłamania można zaobserwować dwufazową odpowiedź immunologiczną, która składa się z wczesnej od.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee oraz Research Conduct and Compliance Office Uniwersytetu w Pittsburghu, który jest instytucją akredytowaną przez AALAS/AAALAC. Zwierzęta pochodziły z Jackson Laboratories oraz Charles Rivers Laboratories. Wszystkie zwierzęta poddano szczegółowej kontroli stanu zdrowia przez dostawców, a także wewnętrznym programom monitorowania zdrowia zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Badania te są prowadzone zgodnie z zasadami rządu USA dotyczącymi wykorzystania kręgowców. Program jest zarejestrowany w USDA i posiada list zapewnienia (letter of assurance) wystawiony przez Public Health Service Office of Laboratory Animal Welfare.
Podziękowania
Źródło finansowania /Numer Molecular Biology of Hemorrhagic Shock GM053789
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podkład chirurgiczny w kolorze niebieskim | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Sterylne opatrunki polowe | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Podgrzewacz cyrkulacyjny 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Sterylizator koralikowy do narzędzi | VWR international | 11156-002 | |
| Taca ze stali nierdzewnej 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Płyty z pleksiglasu (10x15x0,5 cm) | Warsztat mechaniczny University of Pittsburgh | ||
| Rolki taśmy 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| probówka stożkowa 50 ml | Dowolny dostawca | ||
| Słoiki z prostymi ściankami i szerokim otworem (używane jako nasadka stożka nosowego) | VWR international | 159000-058 | |
| Maszynka do strzyżenia Oster A5 z nasadką nr 40 | VWR international | 10749-020 | |
| Nożyczki chirurgiczne (proste) – 12 cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Kleszczyki hemostatyczne zakrzywione - 18 cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Pinceta (końcówka 0,8 mm, zakrzywiona, 10 cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gaza 4"x4" | Dowolny dostawca | ||
| probówka do mikrowirówki 1,5 ml | Dowolny dostawca | ||
| Kubełek z lodem | Dowolny dostawca | ||
| Moździerz i tłuczek | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| strzykawka 1 cm³ z igłą 25G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| igła 20G | Dowolny dostawca | ||
| pipetka automatyczna 1 ml | Dowolny dostawca | ||
| końcówki do pipety 1 ml | Dowolny dostawca | ||
| probówki polistyrenowe Falcon 8 ml | VWR international | 60819-331 | |
| Worek do sterylizacji 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Worek do sterylizacji 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| płytka z agarem MacConkey II | BD Biosciences | 221172 | |
| Alkohol etylowy – 100% | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital sodowy (roztwór Nembutol Sodium) | OVATION Pharmaceuticals | 70 mg/kg | |
| Aerrane (izofluran) | Baxter International Inc. | 99.9% | |
| Powididyna jodowa Triadine (Betadine) | Wyroby jednorazowe Triad | ||
| bufor fosforanowo-solny (PBS) | |||
| Chlorowodorek buprenorfiny | Bedford Laboratories | 0,1 mg/kg |
Bibliografia
- DeCamp, M. M., Demling, R. H. Posttraumatic multisystem organ failure. JAMA. 260, 530-534 (1988).
- Deitch, E. A. Multiple organ failure. Pathophysiology and potential future therapy. Ann Surg. 216, 117-134 (1992).
- Carrico, C. J., Meakins, J. L., Marshall, J. C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
