Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2078

⸱

14 września 2010

 , 
1Department of Microbiology & Immunology and the Center for AIDS Health Disparities Research, Meharry Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Streszczenie

Obecnie KS jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem złośliwym związanym z HIV/AIDS w Afryce Południowej, a tym samym na świecie.1,2 Jest on definiowany jako guz angioproliferacyjny komórek śródbłonka naczyniowego i wywołuje rzadkie chłoniaki limfoproliferacyjne komórek B w postaci chłoniaków wysięku opłucnowego (PEL) oraz niektóre formy wieloogniskowej choroby Castlemana.3-5 Tylko 1-5% komórek w zmianach KS aktywnie wspiera lityczną replikację wirusa herpes związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV), czynnika etiologicznego związanego z KS; oczywiste jest zatem, że czynniki komórkowe muszą oddziaływać z czynnikami wirusowymi w procesie onkogenezy i progresji guza.6,7 Identyfikacja nowych determinantów czynników gospodarza, które przyczyniają się do patologii KS, jest niezbędna do opracowania markerów prognostycznych progresji guza i przerzutów, a także do opracowania nowych metod terapeutycznych w leczeniu KS.8 Towarzyszące wideo szczegółowo opisuje metody, których używamy do identyfikacji programów ekspresji genów komórek gospodarza, które uległy zmianie w komórkach śródbłonka mikro naczyniowego skóry (DMVEC) po infekcji KSHV oraz w tkance nowotworowej KS.9 Po zidentyfikowaniu genów o zaburzonej regulacji za pomocą analizy mikromacierzy, zmiany w ekspresji białek są potwierdzane metodą immunoblotingu i podwójnie znakowanej immunofluorescencji. Zmiany w ekspresji transkrypcyjnej genów o zaburzonej regulacji są potwierdzane in vitro za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Walidacja wyników in vitro z wykorzystaniem archiwalnej tkanki nowotworowej KS jest również przeprowadzana za pomocą podwójnie znakowanej immunochimii oraz mikromacierzy tkankowych.8,10 Nasze podejście do identyfikacji genów o zaburzonej regulacji w mikrośrodowisku tkanki nowotworowej KS pozwoli na opracowanie systemów modelowych in vitro, a następnie in vivo w celu odkrycia i oceny potencjalnych nowych środków terapeutycznych do leczenia KS.

Protokół

1. Hodowla KSVH i zakażanie DMVEC

  1. Linię komórkową BCBL-1, pierwotnie wyizolowaną z chłoniaka jam ciała u człowieka, hoduje się w pełnej pożywce RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY). Komórki BCBL-1 wyjmuje się z ciekłego azotu, transportuje na suchym lodzie i szybko rozmraża przez 1 minutę w temperaturze 37°C. Alikwot 50 μL komórek BCBL-1 o zagęszczeniu 1x104 komórek/mL dodaje się do 500 mL pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 1x penicylinę/streptomycynę, a następnie rozdziela do kolb o pojemności 175 cm, w ilości 50 mL/kolba.
  2. Kolby z komórkami BCBL-1 inkubuje się następnie w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2, aż zagęszczenie komórek osiągnie 3x106 komórek/mL. Replikację wirusa w cyklu litycznym indukuje się poprzez dodanie TPA w stężeniu 20 ng/mL oraz maślanu sodu w stężeniu 0,3 ng/mL.
  3. Dwadzieścia cztery godziny po indukcji komórki przemywa się dwukrotnie w 40 mL PBS o pH 7,4 poprzez wirowanie przy 1500 rpm w wirówce Sorvall Legend RT (w celu usunięcia maślanu), a indukcję kontynuuje się z użyciem TPA w stężeniu 20 ng/mL w pożywce RPMI 1640 przez kolejne 5 dni.
  4. Wirusy wolne od komórek izoluje się i zagęszcza za pomocą wirowania różnicowego. W skrócie: komórki i szczątki komórkowe osadza się najpierw przy 10 000 rpm w wirówce Sorvall RC-6 Plus w temperaturze 4°C przez 30 minut. Usuwa się supernatant zawierający wirusa, a wirusy wolne od komórek osadza się w ultrawirówce Beckman Coulter Optima L-90K w temperaturze 4°C przez 1 godzinę przy 25 000 rpm.
  5. Usuwa się supernatant wolny od wirusa, a osad wirusowy resuspenduje się w pożywce do mrożenia (10% dimetylosulfoksydu i 90% płodowej surowicy cielęcej) i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu użycia.

    Zakażenie pierwotnych komórek DMVEC wirusem KSHV.
  6. Komórki DMVEC na poziomie pasażu 2-5 wysiewa się z początkowym zagęszczeniem 1 X 105 w naczyniach do hodowli tkankowej 100x20 mm lub na szkiełkach z komorą, a następnie utrzymuje w pełnej pożywce EMB-2 (Lonza, Basel, Switzerland) w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Przy 80% konfluencji DMVEC zaraża się przy moi wynoszącym 0,01; jako kontrolę stosuje się komórki poddane pozornemu zakażeniu (sama pożywka). Co 2 dni do komórek dodaje się świeżą pożywkę.
  7. Monowarstwy komórek DMVEC oraz szkiełka z komorą bada się codziennie pod kątem objawów zakażenia, rozpoznawanych po tworzeniu się komórek wrzecionowatych. Po pojawieniu się pierwszych oznak tworzenia komórek wrzecionowatych (7-14 dni) zaprzestaje się wymiany pożywki. Jednak dłuższy czas inkubacji, przekraczający 15-21 dni bez dostarczenia świeżej pożywki, może naruszyć integralność komórek DMVEC, prowadząc do ich obumarcia lub odklejenia się od naczynia hodowlanego.
  8. W momencie maksymalnego wrzecionowacenia podczas zakażenia, monowarstwy komórek zbiera się w celu przygotowania osadów komórkowych do ekstrakcji białek lub RNA. Zainfekowane komórki DMVEC na szkiełkach z komorą przemywa się dwukrotnie 1 mL/okienko podgrzanym wcześniej PBS o pH 7,4. Komórki na szkiełkach z komorą zbiera się po dwukrotnym przemyciu PBS o pH 7,4. Pozostawia się je do całkowitego wyschnięcia przed usunięciem komór i umieszczeniem szkiełek w 100% metanolu przechowywanym w temperaturze -20°C do czasu wykonania barwienia immunofluorescencyjnego (IFA).

2. Izolacja całkowitego RNA i synteza cDNA z komórek DMVEC kontrolnych oraz zainfekowanych KSHV

  1. Całkowity RNA jest ekstrahowany z DMVEC zainfekowanych KSHV oraz komórek mock-zainfekowanych przy użyciu zestawu Qiagen RNesay Mini KIT (Qiagen, Valencia, CA). W przypadku izolacji RNA z komórek hodowlanych stosuje się protokół producenta przeznaczony do przetwarzania tkanek zwierzęcych, z pominięciem etapów homogenizacji.
  2. Wybierz opcję traktowania RNA enzymem DNAseI na kolumnie przy użyciu zestawu Qiagen RNA free DNAse Kit, zgodnie z zaleceniami producenta znajdującymi się w dodatku do instrukcji obsługi. DNAseI degraduje wszelkie zanieczyszczenia genomowym lub wirusowym DNA w preparacie RNA. Traktowanie DNAseI jest kluczowe dla dalszych zastosowań, w tym analiz RT-PCR, qRT-PCR oraz mikromacierzy.
  3. RNA przemywa się zgodnie z instrukcją, a pozostałości etanolu w buforze do płukania usuwa się poprzez odwirowanie kolumny dodatkowy raz, ponad liczbę sugerowaną przez producenta. Pozostałości etanolu obniżają czystość RNA po elucji.
  4. Po ostatnim przemyciu wykonuje się dodatkowy etap wirowania, zanim RNA zostanie wyeluowane z kolumny. RNA jest eluowane z kolumny za pomocą 30 μL wody wolnej od RNaz. Następnie ilość RNA jest określana, a jego czystość analizowana za pomocą biofotometru Eppendorf AG-6131. Stosunek gęstości optycznej (260/280 nm) powinien mieścić się w zakresie 1,8–2,0, co jest charakterystyczne dla RNA o wysokiej czystości.
  5. W celu analizy mikromaciern RNA analizuje się za pomocą systemu Agilent 2100 Bioanalyzer z wykorzystaniem algorytmu oprogramowania RIN. Analiza na bioanalizatorze pozwala uzyskać wskaźnik integralności RNA (RIN) w zakresie od 1 do 10; wykazano jednak, że wartości RIN w przedziale od 7 do 10 zapewniają spójne i bardziej wiarygodne wyniki w analizach mikromaciern oraz qRT-PCR. Średnia wartość RIN dla RNA wyizolowanego za pomocą zestawu Qiagen RNAeasy w naszych badaniach mieści się w przedziale od 7,5 do 9.
  6. Ilościowe oznaczenie RNA przeprowadza się poprzez dodanie 1 μL eluowanego z kolumny RNA do 99 μL z 10 mM Tris-EDTA o pH 7,6. RNA i bufor mieszają się za pomocą pipety, a następnie przenosi do czystej kuwety w celu przeprowadzenia analizy spektrofotometrycznej za pomocą Bio-Photometer firmy Eppendorf.
  7. Przymiarowanie matrycy mRNA w ilości jednego mikrograma z każdej próbki przeprowadzono za pomocą przypadkowych heksamierów dostarczonych przez producenta, przed transkrypcją odwrotną z wykorzystaniem zestawu High Capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA.).


    synteza cDNA

  8. W celu syntezy jednoniciowego cDNA z całkowitego RNA wykorzystujemy zestaw High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit firmy Applied Biosystems i postępujemy zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Przygotowuje się 2-krotny (2x) master mix odczynników, a następnie dodaje od 0,5 do 1 μg RNA w objętości 10 μL dodaje się do 10 μL z 2x mieszanki reagentów (master mix). Otrzymany roztwór 1x jest delikatnie mieszany, a następnie przeprowadza się reakcję odwrotnej transkrypcji w termocyklerze BIORAD MJ Mini zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Można użyć do dwóch mikrogramów całkowitego RNA na 20 μL reakcji. Ilość cDNA oznaczono przy 260 nm za pomocą biofotometru Eppendorf AG-6131, a następnie przechowywano w temperaturze -80°C do czasu użycia w reakcji qRT-PCR.

3. Porównawcza analiza mikromacierzy komórek DMVEC zakażonych KSHV oraz grupy kontrolnej (mock)

Nasze laboratorium przeprowadza analizy mikromacierzy w Vanderbilt University Medical Center Microarray Shared Resource Core Facility w ramach usług odpłatnych. Porównujemy pliki wynikowe w celu zbadania dysregulacji transkrypcyjnej genów w komórkach DMVEC zainfekowanych KSHV w odniesieniu do kontrolnych komórek z infekcją pozorowaną. Geny z dysregulacją transkrypcyjną w komórkach zainfekowanych KSHV, które są istotne dla angiogenezy, proliferacji komórek lub stanowią biomarkery przerzutowe, są walidowane in vitro na komórkach DMVEC zainfekowanych KSHV przy użyciu techniki real-time PCR, Western blot oraz podwójnej IFA; wyniki są następnie porównywane z ustaleniami w archiwalnych tkankach guzów KS.

4. Ilościowa analiza transkrypcyjna za pomocą Rt-pcr genów o rozregulowanej ekspresji zidentyfikowanych w kontrolnych (mock) i zainfekowanych KSHV komórkach DMVEC

  1. Reakcję Real Time PCR przeprowadza się w 96-dołkowych płytkach optycznych (Sorenson Bioscience, Inc.) z wykorzystaniem cDNA otrzymanego dzięki odwrotnej transkrypcji z oczyszczonej próbki RNA, używając systemu detekcji MyiQ Single Color Real Time PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) oraz objętości reakcji 25 μL. Procedurę tę wykonuje się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia obcym DNA/cDNA, które może znajdować się w pomieszczeniu.
  2. Dla każdego zestawu starterów przygotowuje się master mix w probówkach 1,5 mL (zgodnie z instrukcjami producenta), stosując SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) oraz wybrane startery forward i reverse dla każdego genu zainteresowania, w stężeniu 250 nM na dołek, sporządzony w wodzie H2O wolnej od RNAazy i DNAazy. Każda próbka powinna być wykonana w trzech powtórzeniach.
  3. Sekwencje starterów do qRT-PCR dla genów komórek gospodarza obejmują sekwencje starterów dla KSHV LANA, który jest wirusowym antygenem jądrowym związanym z latencją, wysoce eksponowanym w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w guzach KS.
  4. Zapasy cDNA o stężeniu 10 ng/ul z komórek DMVEC mock-zakażonych oraz zakażonych KSHV rozcieńcza się w stosunku 1:3 w wodzie H2O wolnej od RNAazy i DNAazy; 3 μL tego rozcieńczenia dodaje się do każdego dołka. W dołkach kontrolnych zamiast cDNA stosuje się wodę.
  5. Płytkę 96-dołkową zamyka się optyczną taśmą uszczelniającą (Bio-Rad Laboratories), delikatnie miesza i wiruje przez 2 minuty przy 1000 rpm w temperaturze pokojowej, aby zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie dołków. W tym czasie włącza się system detekcji Bio-Rad MyiQ oraz lampę, aby umożliwić 10-minutowy okres rozgrzewania przed rozpoczęciem procesu.
  6. OdwirCowaną płytkę 96-dołkową umieszcza się w systemie detekcji Bio-Rad MiQ Single Color Real Time PCR, wprowadza i zapisuje program sekwencji cykli, a następnie uruchamia analizę.
  7. Sekwencja cykli jest następująca: 95°C przez 3 minuty, 95°C przez 15 sekund, 60°C przez 1 minutę, 95°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę oraz 55°C przez 30 sekund przez łącznie 81 cykli. W programie uwzględniono krzywą topnienia w celu sprawdzenia wydajności starterów. Dla celów normalizacji amplifikuje się i dołącza zestaw starterów dla GAPDH.
  8. Analiza danych jest przeprowadzana za pomocą oprogramowania Bio-Rad iQ5 Optical System Software wersja 2.

5. Analiza immunofluorescencyjna z podwójnym znakowaniem komórek DMVEC zainfekowanych KSHV

  1. Lamelki z komor (wyjęte z komór) zawierające konfluentne zakażone i niezakażone DMVEC przemywa się dwukrotnie PBS pH 7.4, suszy na powietrzu, a następnie utrwala w schłodzonym do -20°C bezwodnym metanolu przez 10 minut i przechowuje w temperaturze -20°C.
  2. Lamelki z komórkami suszy się następnie na powietrzu przez 15 minut i umieszcza na 5 minut w słoiku Coplina na lodzie zawierającym roztwór soli Trisu (0.05M Tris pH 7.4). Następnie komórki inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze z mieszaniną przeciwciał monoklonalnych przeciwko KSHV LANA w rozcieńczeniu 1:50 w PBS pH 7.4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) oraz koziego przeciwciała poliklonalnego (rozcieńczenie 1:100 w PBS pH 7.4) przeciwko białku czynnika gospodarza, którego dysregulacja została stwierdzona za pomocą mikromacierzy w zakażonych KSHV komórkach DMVEC.
  3. Komórki przemywa się następnie 3x roztworem soli Trisu (nie dopuszczając do wyschnięcia komórek), a następnie inkubuje przez 30 minut z mieszaniną wtórnego przeciwciała osiołkowego anty-mysie IgG sprzężonego z rhodamine red-X oraz przeciwciała osiołkowego anty-kozie sprzężonego z FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), oba w rozcieńczeniu 1:100 w PBS.
  4. Komórki przemywa się później 3x roztworem soli Trisu w słoiku Coplina, a gdy lamelki są jeszcze wilgotne, montuje się je z użyciem medium montażowego Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zawierającego 1.5 g/ mL DAPI oraz szkiełka nakrywkowego.
  5. Fluorescencję obserwuje się i fotografuje za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Nikon TE 2000S wyposażonego w kamerę CCD (charge-coupled device). Zdjęcia wykonuje się przy użyciu obiektywu 20x, co daje całkowite powiększenie 200x.
  6. Oddzielne zdjęcia przy tym samym powiększeniu dla DAPI (200x) wykonuje się przy użyciu oświetlenia UV, z zielonym filtrem dla rhodamine oraz niebieskim filtrem dla FITC. Obrazy są następnie łączone za pomocą bezpłatnego oprogramowania firmy Nikon.

6. Podwójne znakowanie immunohistochemiczne tkanki Ks i mikromacierzy tkankowych Ks dla białka KSHV Lana oraz markera komórek śródbłonka Pecam-1/cd31

  1. Podwójne znakowanie immunohistochemiczne wykonuje się przy użyciu zestawu barwiącego DAKO strepavidin ABC duet dla KSHV LANA oraz białek komórek gospodarza, u których stwierdzono zmiany po infekcji wirusowej. IHC przeprowadza się na archiwalnych tkankach AIDS-KS utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
  2. Przekroje o grubości 5 μm wycina się mikrotomem i nanosi na szkiełka chemate przed immunobarwieniem.
  3. Szkiełka z tkankami zatopionymi w parafinie odparafinizuje się w ksylenie przez 10 minut pod wyciągiem, a następnie komórki nawadnia się w serii rozcieńczeń etanolu 100%, 95% i 70% przez pięć minut w każdym stopniu. Następnie szkiełka umieszcza się w wodzie na 10 minut przed odsłonięciem antygenów (znanym również jako retrieval antygenów).
  4. W celu immunobarwienia odsłanianie antygenów przeprowadza się w kuchence mikrofalowej w buforze cytrynianowym 50 mM o pH 6,0 w temperaturze 95°C przez 15 minut. W skrócie, szkiełka z komórkami zanurza się w buforze cytrynianowym o temperaturze 95°C na 15 minut, a następnie niezwłocznie przenosi do wody destylowanej w temperaturze pokojowej.
  5. Gaszenie endogennej peroksydazy wykonuje się poprzez inkubację szkiełek przez 30 minut w roztworze do gaszenia. W skrócie: do probówki stożkowej 50 mL dodaje się 47 mL 95% etanolu, 11,2 mL PBS pH 7,4 oraz 1,8 mL 3% nadtlenku wodoru, aby uzyskać łącznie 60 mL.
    Roztwór do gaszenia przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.
  6. Następnie komórki przemywa się 3x w PBS pH 7,4 po 5 minut każdy w temperaturze pokojowej. W celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu przeciwciał przygotowuje się roztwór blokujący (12,5 mL 95% etanolu, 1,4 mL normalnej surowicy koziej, 140 mg albuminy surowicy bydlęcej i 2 krople Tween 20). Przed użyciem należy schłodzić na lodzie. (Ten roztwór blokujący można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 tygodnia).
  7. Roztwór blokujący nanosi się na preparat na szkiełku, a następnie przykrywa paskiem parafiny (aby zapobiec wysychaniu preparatu), umieszcza w komorze wilgotnościowej i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Pierwotne przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne przeciwko antygenowi wirusowemu przygotowuje się w roztworie blokującym w rozcieńczeniu 1:50, miesza pipetą i przechowuje na lodzie do momentu użycia. W zależności od wielkości preparatów i liczby szkiełek, na jeden preparat tkankowy będziesz potrzebować od 50 do 100 μL roztworu przeciwciał.
  9. Bezpośrednio po inkubacji roztwór blokujący strząsa się ze szkiełka i dodaje 50-100 μL przeciwciała pierwszorzędowego do preparatu tkankowego, który następnie przykrywa się paskiem parafiny. Preparaty inkubuje się przez 1-2 godziny w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.
  10. Szkiełka z preparatami przemywa się następnie 3x po 5 minut w PBS pH 7,4, do którego dodaje się wtórne biotynilowane przeciwciało kozie anty-mysie w rozcieńczeniu 1:100 w PBS pH 7,4, a następnie inkubuje w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut.
  11. Około 30 minut przed użyciem przygotowuje się streptawidynę sprzężoną z peroksydazą w PBS pH 7,4. Używając zestawu DAKO Cytomation Duet, dodaje się 50 μL roztworu A do 5 mL PBS pH 7,4, miesza w wortexie, a następnie dodaje 50 μL roztworu B i miesza ponownie.
  12. Po zakończeniu inkubacji przeciwciał z kroku 6.10, szkiełka przemywa się 3x w PBS pH 7,4, a następnie dodaje świeżo przygotowany roztwór streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut w komorze wilgotnościowej.
  13. Po inkubacji szkiełka przemywa się 3x w PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Na pięć minut przed zakończeniem płukania przygotowuje się roztwór substratu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB, SIGMA) (20 mL PBS pH 7,4, 25 μL 3% nadtlenku wodoru i 1 tabletka DAB). Po całkowitym rozpuszczeniu tabletki DAB, brązowy roztwór filtruje się przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. Przefiltrowany roztwór DAB dodaje się do preparatów po ostatnim przemyciu, a następnie w czasie rzeczywistym obserwuje się rozwój barwy dla KSHV LANA w zainfekowanych komórkach w świetle przechodzącym przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse E200. Po uzyskaniu pożądanej intensywności barwy reakcję przerywa się inkubacją w wodzie destylowanej przez 5 minut.
  14. W przypadku podwójnego znakowania IHC, po inkubacji w wodzie szkiełka z preparatami poddaje się protokołowi IHC po raz drugi, zaczynając od etapu odsłaniania antygenów (6.4). Jednak protokół zmienia się na etapie substratu peroksydazy (6.11) w taki sposób, że zamiast streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową stosuje się koniugat streptawidyny z fosfatazą alkaliczną.
  15. Drugie znakowanie osiąga się poprzez dodatkowy etap odsłaniania antygenów w kuchence mikrofalowej, jak opisano powyżej, oraz drugie immunobarwienie przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białku komórkowemu, u którego stwierdzono dysregulację (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Następnie komórki przemywa się i inkubuje z biotynilowanym przeciwciałem kozim anty-mysim/króliczym IgG (DAKO) w rozcieńczeniu 1:100, a następnie z koniugatem fosfatazy alkalicznej-streptawidyny (Vector Labs, Burlingame, CA) w rozcieńczeniu 1:500. Rozwój barwy uzyskuje się poprzez inkubację komórek z substratem vector red przy użyciu zestawu substratu fosfatazy alkalicznej Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli jest to wskazane, można przeprowadzić przeciwbarwienie oreciną lub hematoksyliną. Preparaty tkankowe zostają następnie trwale zamontowane za pomocą medium montażowego permount i szkiełka nakrywkowego. Obrazy wykonuje się w świetle przechodzącym przy użyciu mikroskopu Nikon TE-2000S wyposażonego w kamerę CCD.

7. Dostarczanie genów poprzez transdukcję komórek DMVEC adenowirusem

  1. Normalne komórki DMVEC hoduje się na szkiełkach komorowych przy gęstości wysiewu 2.5 X105 komórek na komorę w pełnej pożywce EBM-2.
  2. Komórki DMVEC hoduje się do osiągnięcia 80% konfluencji (co zajmuje od 3 do 5 dni), po czym do okna szkiełka komorowego dodaje się 5 ul adenowirusa wykazującego ekspresję EGFP o mianie 1X 1010 cząsteczek/mL.
  3. Żywe hodowle komórek DMVEC po dodaniu adenowirusa badano pod kątem fluorescencji EGFP 18 godzin po infekcji.
  4. Wykonano osobne fotografie w kontraście fazowym i fluorescencyjnym przy całkowitym powiększeniu 200X, a następnie nałożono je na siebie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego NIKON TE 2000S wyposażonego w kamerę CCD.

8. Reprezentatywne wyniki

Eksperyment z kulturą komórkową porównujący efekty infekcji KSHV; obrazy mikroskopowe morfologii zainfekowanych komórek.
Rysunek 1. Pierwotne komórki DMVEC z Lonza Corporation utrzymywano w pożywce EBM-2 i zainfekowano wirusem BCBL-1 przy moi wynoszącym 0,01. Po infekcji monowarstwy komórek DMVEC badano codziennie. Dziesięć dni po infekcji komórki w grupie kontrolnej (mock) wykazywały morfologię przypominającą brukowaną, natomiast komórki zainfekowane KSHV wykazywały morfologię wrzecionowatą, charakterystyczną dla wrzecionowatych komórek śródbłonka zainfekowanych KSHV w tkance guza KS. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu NIKON TE 2000S wyposażonego w kamerę CCD przy całkowitym powiększeniu 100X.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej barwionych komórek, jądra w kolorze niebieskim, markery białkowe w kolorze zielonym i purpurowym.
Rysunek 2. Podwójne znakowanie metodą pośredniej immunofluorescencji przeprowadzono na komórkach DMVEC zainfekowanych KSHV w 10. dniu po infekcji. Zainfekowane komórki poddano podwójnemu barwieniu z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko KSHV LANA oraz koziego przeciwciała poliklonalnego przeciwko specyficznemu białku komórki gospodarza, którego poziom ulega zmianie po infekcji KSHV. Dodano mieszaninę wtórnych przeciwciał osiołkowych anty-mysich i anty-kozią sprzężonych z rhodamine oraz FITC. Komórki badano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Nikon TE2000S wyposażonego w kamerę CCD. Do wizualizacji jąder wykorzystano medium montażowe z DAPI. Wszystkie fotografie wykonano przy całkowitym powiększeniu 200x. Zainfekowane komórki wykazujące ekspresję białka LANA wirusa (barwione rhodamine), zlokalizowane w jądrze, wykazują zmniejszoną ekspresję specyficznego białka komórki gospodarza (barwione FITC), zlokalizowanego w cytoplazmie.

Wyniki barwienia histologicznego, porównanie morfologii tkanki, analiza obrazu mikroskopowego, struktura komórkowa.
Rysunek 3. IHC w tkance guza KS dla LANA i PECAM-1/ CD31. Tkanka guza KS w przebiegu AIDS została poddana barwieniu IHC pojedynczym i podwójnym dla KSHV LANA i PECAM-1/CD31. A) Przedstawia tkankę KS zabarwioną przeciwciałem monoklonalnym przeciwko LANA i przeciwbarwioną hematoksyliną. Komórki LANA-dodatnie są zaznaczone białymi strzałkami. B) Tkanka KS zabarwiona przeciwciałem monoklonalnym przeciwko PECAMI/CD31; barwienie wydaje się specyficzne dla śródbłonka wokół naczyń, co wskazują białe strzałki. C) Przedstawia tkankę KS poddaną podwójnemu barwieniu na LANA (czerwień wektorowa) i CD31 (brąz); czarne strzałki wskazują LANA, a białe komórki wykazujące pozytywne barwienie dla CD31. D) Przedstawia obszar z tej samej preparatu co w panelu C przy mniejszym powiększeniu. Obrazy w świetle przechodzącym wykonano za pomocą mikroskopu NIKON TE2000S przy całkowitym powiększeniu 600x dla paneli A-C oraz 200x dla panelu D.

Czasowa ekspresja KSHV LANA określona metodą qRT-PCR, wykres słupkowy, analiza komórek DMVEC zainfekowanych KSHV.
Rycina 4. Czasowa ekspresja KSHV LANA określona metodą qRT-PCR 10 dni po infekcji w porównaniu do kontrolnych komórek zainfekowanych pozornie. Wszystkie wartości dla komórek DMVEC zainfekowanych KSHV zostały znormalizowane do GAPDH. W komórkach zainfekowanych pozornie nie stwierdzono amplifikacji cDNA LANA.

Preparat mikroarray tkankowy do badania KS, formy płatowe/plackowate, guzkowe, analiza wielu pacjentów, schemat.
Rysunek 5. Mikroarray tkankowe guza KS. Mikroarray tkankowy (TMA) przedstawia rdzenie tkankowe o średnicy 0,6 milimetra rozmieszczone na jednym preparacie. Każdy rdzeń tkankowy reprezentuje próbkę guza KS od innego pacjenta. TMA zostały udostępnione przez AIDS Cancer Specimen Resource (ASCR) od dr Leony Ayers z Ohio State University. Tkanka guza KS zatopiona w parafinie wraz z dopasowanymi tkankami normalnymi i kontrolą pozytywną zostały umieszczone na szkiełkach przedmiotowych. Próbki tkanki KS pobrano z guzów jamy ustnej, skóry, podniebienia miękkiego, języka i szyi. Wszyscy pacjenci byli seropozytywni w kierunku HIV.

Porównanie histologiczne, przekroje tkanek, barwione do analizy komórkowej, wyniki eksperymentu mikroskopowego.
Rycina 6. Mikromacierze tkankowe zostały poddane barwieniu immunohistochemicznemu na KSHV LANA i przeanalizowane za pomocą mikroskopii światła przechodzącego. Wywoływanie barwy dla LANA przeprowadzono z użyciem DAB jako substratu peroksydazy, a komórki LANA-dodatnie wizualizowano poprzez intensywne brązowe barwienie. Można zaobserwować różny stopień obciążenia wirusowego oraz obszary komórek wrzecionowatych. A) przedstawia ogniskową infekcję wirusową w określonym regionie guza. B) przedstawia infekcję rozsianą z wysokim obciążeniem wirusowym, które jest mniej więcej skorelowane z liczbą obecnych komórek wrzecionowatych. Zbarwione rdzenie tkankowe obserwowano przy powiększeniu 200x.

Komórki DMVEC po transdukcji; mikroskopia fazokontrastowa vs fluorescencyjna; analiza ekspresji EGFP.
Rycina 7. Komórki DMVEC hodowane w pełnej pożywce EBM-2 przy gęstości 2.5 X105 komórek na dołek zostały poddane transdukcji 5 μL Adenowirusa o mianie 1.0X1010. Komórki sprawdzono pod kątem fluorescencji EGFP 18 godzin po transdukcji. Zarówno obrazy w fazokontraście, jak i fluorescencyjne wykonano przy użyciu mikroskopu Nikon TE 2000S przy całkowitym powiększeniu 200X. Transfekcja pierwotnych komórek DMVEC okazała się problematyczna, dlatego zidentyfikowano wektory wirusowe, które pozwalają na bardzo wydajną dostarczenie fibuliny-2 i galetyny-3 do pierwotnych komórek DMVEC. Stwierdzono, że adenowirus wykazujący ekspresję EGFP może skutecznie transdukować pierwotne komórki DMVEC. Wykazano również, że wektor lentiwirusowy uzyskany z Lentigen Corporation był równie wydajny w transdukcji pierwotnych komórek DMVEC (dane nie przedstawiono).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metodologie opisane w niniejszym raporcie mogą być realizowane w różnych warunkach laboratoryjnych. Wymagają one specjalistycznego sprzętu lub dostępu do jednostek wsparcia badawczego (core facilities). Podczas prowadzenia eksperymentów z udziałem zakaźnych patogenów wirusowych, takich jak KSHV, należy zachować odpowiednie środki ostrożności, co może wymagać korzystania z laboratoriów o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3). Pozyskiwanie tkanek musi zostać również zatwierdzone przez odpowiednie instytucjonalne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Jamesowi E.K. Hildrethowi z Meharry Medical College za rady i recenzję niniejszego manuskryptu. Dziękujemy również Dianie Marver za redakcję tekstu. Praca ta była wspierana przez Meharry Vanderbilt Center for AIDS Research (grant NIH P30 AI054999-05); Center for AIDS Health Disparities Research (grant NIH 5U54 RR019192-05); Meharry Center for Clinical Research (grant NIH P20RR011792) oraz przez grant NIH P01 CA113239. D.J.A. otrzymał częściowe finansowanie z grantów pilotażowych z Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) oraz Meharry Center for Clinical Research (CRC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640Invitrogen05-0001DJ
TPASigma-AldrichP1585
PBS pH 7.4Invitrogen10010-023
Masłczan soduSigma-Aldrich19364 (FLUKA)
Pożywka EBM-2Lonza Inc.CC-3156+ suplement bullet kits
Komórki DMVEC (HMVEC)Lonza Inc.CC2543
Płodowa surowica cielęcaHycloneSH30066.03
Penicylina/streptomycynaInvitrogen15140-122
Szkiełka z komorąNalge Nunc international154461
Przeciwciało monoklonalne KSHV LANAVector LaboratoriesVP-H913rozcieńczenie 1:50/IFA
Przeciwciało poliklonalne przeciw galectinie-3 (kozie)R&D SystemsAF1154
Donkey-anti-goat FITCJackson ImmunoResearch705-095-1
Donkey-anti-goat RhoJackson ImmunoResearch705-295-003rozcieńczenie 1:100/IFA
Medium montażoweVector LaboratoriesH 1500Vectashield z DAPI
Zestaw do oznaczania białek BCAPierce, Thermo Scientific23235
NitrocelulozaBio-Rad161-0112
Koniugat Donkey-anti-goatSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC 2020
Substrat do Western blotPierce, Thermo Scientific34075
Biotynowane przeciwciało królicze przeciw kozimDako305-065-045
Koniugat AP-StrepawidynaDakoK 0492 (zestaw)
Zestaw do usuwania RNaz i DNazQiagen79254
MJ Mini CyclerBio-RadPTC-1148C
Bio-FotometrEppendorf952000006
Wirówka RC 6 PlusSorvall, Thermo Scientific46910
Ultrawirówka Coulter Optima L-90KBeckman Coulter Inc.392052
System detekcji Real Time PCR MYiQ iCyclerBio-Rad170-9770
Mikroskop fluorescencyjny TE 2000SNikon InstrumentsTE2000S
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938C
Eclipse E 200Nikon InstrumentsE 200
Wirówka Sorvall Legend RTThermo Fisher Scientific, Inc.75004377

Bibliografia

  1. Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
  2. Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
  3. Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
  4. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
  5. Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
  6. Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
  7. Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
  8. Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
  9. Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
  10. Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mi sak Kaposiszegozaka enie KSHVpodw jna immunohistochemiamikroarray tkankowyretrieval antygenuwirusowe bia ka gospodarzabarwienie immunofluorescencyjnewalidacja qRT PCRanaliza mikroarraykom rki r db onka
Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.