W celu zbadania ekspresji genów w tkance skrzydeł poczwarki Bicyclus anynana przedstawiamy zoptymalizowany protokół hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem ryboprobes. Dostarczamy również wytyczne dotyczące dalszej optymalizacji tego protokołu w celu zastosowania go w skrzydłach poczwarek innych gatunków Lepidoptera.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół hybrydyzacji in situ dla skrzydeł poczwarki motyla z użyciem rybop sond
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym materiale wideo przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ w skrzydłach poczwarki motyla Bicyclus anynana z wykorzystaniem ryboprobn. Hybrydyzacje in situ, stanowiące fundament biologii rozwoju, są przydatne do badania przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów w rozwijających się tkankach na poziomie transkrypcji. Metodę in situ można zastosować w sytuacjach, gdy nie opracowano jeszcze przeciwciał skierowanych przeciwko produktom białkowym transkrypcji genu i/lub gdy w genomie występuje wiele kopii genu kodującego dane białko, których nie można rozróżnić za pomocą dostępnych przeciwciał. Choć technika in situ dla larwalnych krążków skrzydeł jest dostępna dla badaczy motyli od kilku lat, niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem większych i bardziej delikatnych skrzydeł poczwarki.
Protokół
DZIEŃ 1
- Przygotować następujące roztwory:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- ddH2O
- Dodać DEPC do całkowitej objętości w stężeniu 0,1% i energicznie wstrząsnąć roztworami.
- Autoklawować.
- 4% Paraformaldehyd do fiksacji - w PBS-DEPC
- Roztwór Proteinazy K - w przypadku wystąpienia osadu, energicznie wymieszać w vortexie przed pobraniem alikwoty
- Bufor zatrzymujący trawienie (Digestion Stop Buffer)
- Bufor do prehybrydyzacji
- Mieszanina 50:50 PBT:Bufor do prehybrydyzacji
- Bufor do hybrydyzacji
- Roztwory powinny być wolne od RNaz. Należy używać szkła wypalanego (4 godziny w 250°C) lub jednorazowego plastiku. Pipety serologiczne są bardzo przydatne przy przygotowywaniu roztworów
- Wypreparować skrzydła z poczwarek o określonym wieku w PBS
- Przenieść skrzydła bezpośrednio do buforu do fiksacji w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej w temperaturze pokojowej
- Fiksować krążki przez 2 godziny
- Przemyć 5 x 5 minut w PBT
- Inkubować skrzydła przez 3 minuty w roztworze Proteinazy K
- Opłukać 2 x w buforze zatrzymującym trawienie
- Przemyć 5 x 5 minut w PBT
- Przemyć 2 x 5 minut w mieszaninie 50:50 PBT : PHB
- Przemyć 1 x 10 minut w PHB
- Inkubować w PHB przez co najmniej 1 godzinę w 55°C.
- Denaturować termicznie sondę RNA (wymagane 20-50ng na dołek) (80°C przez 5 minut) i dodać do buforu do hybrydyzacji (wymagane 100 μl na dołek)
- Dodać sondę do dołków i inkubować przez 48 godzin w 55°C
DZIEŃ 3
- Przemyć 4 x 5 minut w buforze PHB w temperaturze 55°C
- Inkubować przez noc w buforze PHB w temperaturze 55°C
DZIEŃ 4
- Przygotować następujące roztwory:
- bufor blokujący przeciwciała
- Przepłukać 1 x 5 minut w mieszaninie PBT : PHB w stosunku 50:50
- Przepłukać 4 x 5 minut w PBT
- Inkubować skrzydła przez 1 godzinę w buforze blokującym w temperaturze 4°C
- Inkubować skrzydła przez noc w temperaturze 4°C w roztworze przeciwciał anty-Dig w rozcieńczeniu 1:2000
DZIEŃ 5
- Przygotować następujące roztwory:
- Bufor detekcyjny
- Roztwór wywołujący – światłoczuły (owinąć folią)
- Przemyć 3 x 5 minut w PBT w temperaturze pokojowej
- Przemyć 7 x 5 minut w PBT
- Opłukać skrzydła dwukrotnie w buforze detekcyjnym
- Wywołać skrzydła w 1 ml roztworu wywołującego – czas wywoływania musi być monitorowany przy każdym badaniu – czas wywoływania może ulec zmianie nawet przy użyciu tych samych sond i roztworu wywołującego – zazwyczaj należy sprawdzać po 5-10 minutach, a następnie wydłużać odstępy aż do inkubacji przez noc. Płytkę należy owinąć folią, aby zapobiec ekspozycji na światło w czasie, gdy próbki nie są sprawdzane.
- Opłukać pięciokrotnie w buforze zatrzymującym wywoływanie
- Zamontować skrzydła.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Optymalizacja istniejących protokołów
Hybrydyzacje in situ na tarczach skrzydeł larwalnych zostały pomyślnie przeprowadzone z wykorzystaniem tarcz motyli Precis coenia (Carroll et al. 1994; Keys et al. 1999; Weatherbee et al. 1999). Niniejszy protokół został dostosowany z szczegółowego protokołu pisemnego dotyczącego barwienia skrzydeł larwalnych, dostępnego na prośbę z laboratorium Carrolla. Wprowadzone przez nas zmiany mają na celu uwzględnienie różnic między tkankami skrzydeł w stadium l...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed oraz wsparciu technicznemu firmy Roche za pomoc w rozwiązywaniu problemów z tym protokołem. Dziękujemy również Williamowi Pielowi za wskazówki dotyczące montażu filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Bufor utrwalający | 4% Paraformaldehyd w PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 w PBS | |||
| Roztwór proteinazy K | 2,5mg/ml Proteinase K w PBT | |||
| Bufor zatrzymujący trawienie | 2 mg/ml glicyny w PBT | |||
| Bufor przedhybrydyzacyjny | Na 50 ml PHB: 12 ml wody traktowanej DEPC + 25 ml formamidu + 12,5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml DNA nasienia łososia (wolny od RNaz, denaturowany termicznie przed dodaniem do roztworu). | |||
| Bufor hybrydyzacyjny | Do buforu przedhybrydyzacyjnego dodać 1 mg/ml glikogenu | |||
| Bufor blokujący | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Przeciwciało anty-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | sprzężone z fosfatazą alkaliczną |
| Zestaw buforów do przemywania i blokowania DIG | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Medium montażowe |
Bibliografia
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
