Celem niniejszego badania było odtworzenie naturalnej, trójwarstwowej architektury ściany tętnicy. W tym celu zastosowano elektroprzędzenie z wykorzystaniem dyszy 3-1 (wejście-wyjście) oraz mieszanin polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwarstwowe elektroprzędzenie w celu naśladowania natywnej architektury tętnicy z wykorzystaniem polikaprolaktonu, elastyny i kolagenu: badanie wstępne
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W naturalnej tętnicy kolagen i elastyna pełnią istotną rolę, stanowiąc mechaniczny szkielet, zapobiegając pękaniu naczyń i sprzyjając regeneracji przy deformacjach pulsacyjnych. Celem niniejszego badania było odtworzenie struktury naturalnej tętnicy poprzez wytworzenie wielowarstwowego elektroprzędzionego naczynia z poli(kaprolaktonu) (PCL) z dodatkiem elastyny i kolagenu w mieszaninach PCL-ELAS-COL o proporcjach 45-45-10, 55-35-10 oraz 65-25-10, aby wykazać właściwości mechaniczne zbliżone do natywnej tkanki tętniczej, przy jednoczesnym zachowaniu sprzyjających warunków do regeneracji tkanki. Całe przeszczepy oraz poszczególne warstwy poddano analizie za pomocą jednowymiarowej próby rozciągania, pomiaru podatności dynamicznej, wytrzymałości na wyrwanie szwu oraz ciśnienia rozrywającego. Wyniki podatności wykazały, że zmiany w warstwie środkowej/medialnej wpływały na ogólne zachowanie przeszczepu, a wartości podatności całego graftu mieściły się w zakresie 0,8 - 2,8 % / 100 mmHg, podczas gdy wyniki jednowymiarowe wykazały średni moduł w zakresie 2,0 - 11,8 MPa. Zarówno dane dotyczące modułu, jak i podatności, mieściły się w zakresie wartości charakterystycznych dla naturalnej tętnicy. Zastosowano modelowanie matematyczne, aby wykazać, w jaki sposób zmiany sztywności warstw wpływają na całkowowe obciążenie obwodowe ściany, a także jako pomoc projektową w celu uzyskania optymalnej kombinacji materiałów pod kątem mechanicznym. Podsumowując, wyniki wskazały, że poprzez zmianę właściwości poszczególnych warstw można zaprojektować przeszczep naśladujący strukturę trójwarstwową.
Protokół
- Przed elektroprzędem kolagen z bovine corium (skóry bydlęcej) 6-miesięcznej musi zostać wyekstrahowany za pomocą procesu opartego na kwasie octowym. Wyekstrahowany kolagen jest następnie oczyszczany poprzez następującą serię rozpuszczania, wytrącania i dializ. Po liofilizacji kolagenu można rozpocząć proces elektroprzędzy.
- Odważone zostają trzy materiały: polikaprolakton (PCL), elastyna (ELAS) i kolagen (COL). Materiały te zostaną rozpuszczone oddzielnie w 1,1,1,3,3,3 heksafluoro-2-propanolu (HFP, TCI America) w stężeniach odpowiednio 100 mg/ml, 200 mg/ml i 70 mg/ml.
- Materiały są mieszane w pięciu różnych fiolkach scyntylacyjnych w stosunkach objętościowych: 98-2-0 PCL-ELAS-COL (tunica intima), 45-45-10, 55-35-10 i 65-25-10 PCL-ELAS-COL (tunica media) oraz 70-0-30 PCL-ELAS-COL (tunica adventitia).
- Do jednowymiarowych testów rozciągania i testów podatności poszczególnych warstw każdy z materiałów był elektroprzędziony indywidualnie, natomiast wielowarstwowe protezy naczyniowe do testów wytrzymałości na pękanie, retencji szwów i podatności były elektroprzędzione w konfiguracji od 3 do 1. Rusztowania do jednowymiarowych testów rozciągania były płaskie i prostokątne (szerokość 2,5 cm x długość 10,2 cm x grubość 0,3 cm), ponieważ trzpienie o średnicy 2 mm używane do elektroprzędzy poszczególnych warstw i protez wielowarstwowych były zbyt małe do wycinania próbek testowych.
- Zarówno w przypadku elektroprzędzy pojedynczej, jak i wielowarstwowej, roztwory polimerowe ładowano do plastikowej strzykawki Becton Dickinson o pojemności 3 ml z igłą tępą o rozmiarze 18 G i umieszczano w pompie strzykawkowej przy ustawionej prędkości dozowania. Prędkości indywidualnej elektroprzędzy ustawiono na 4 ml/hr, natomiast prędkości elektroprzędzy wielowarstwowej zmieniano w zależności od przejścia i warstwy. Przepływy i objętości wynosiły odpowiednio: tunica intima była elektroprzędzona z prędkością 4 ml/hr i objętością 0,5 ml, po czym nastąpiło przejście łączące strzykawki z intimą i medią dla 0,2 ml przy prędkości 2 ml/hr każda. Następnie wyłączono strzykawkę z intimą i pozwolono na przędzenie warstwy medialnej dla 0,6 ml przy 4 ml/hr, po czym nastąpiło przejście między medią a adventitią dla 0,2 ml roztworu polimerowego przy 2 ml/hr każda. Na koniec zatrzymano medię i pozwolono na przędzenie adventitii dla 0,4 ml przy 4 ml/hr.
- Wszystkie próbki poddano sieciowaniu w 50 mM EDC przez 18 godzin przed przystąpieniem do testów 1.
- Jednowymiarowe testy rozciągania przeprowadzono na sześciu próbkach z jednego elektroprzędzonego arkusza nawodnionego w PBS przez 24 godziny. Próbki w kształcie „hantla” wycięto z mat elektroprzędzonych i przetestowano w systemie testowym MTS Bionix 200 z ogniwem obciążeniowym 100 N i prędkością rozciągania 10,0 mm/min. Maksymalne naprężenie, moduł i odkształcenie przy zerwaniu obliczono za pomocą programu TestWorks wersja 4.
- Testy retencji szwów przeprowadzono na sześciu rurkowych okazach o wewnętrznej średnicy 2 mm z sześciu różnych elektroprzędzonych protez, namoczonych w PBS przez 24 godziny w temperaturze 37°C, w systemie testowym MTS Bionix 200 z ogniwem obciążeniowym 50 N (MTS Systems Corp.) i prędkością rozciągania 150,0 mm/min, zgodnie z procedurą prostego przeciągania opisaną przez American National Standards Institute 2. Mononiciową fioletową nić chirurgiczną PDS II 5-0 umieszczono 2 mm od końca próbki i rozciągano, aż szew został wyrwany z protezy. Maksymalne obciążenie zarejestrowano w gramach-siłach za pomocą programu TestWorks wersja 4.
- Testy wytrzymałości na pękanie przeprowadzono na sześciu próbkach z sześciu różnych elektroprzędzonych protez. Rurki testowe o długości 2-3 cm nawodniono w PBS, nałożono na wypustki o średnicy 1,5 mm przymocowane do urządzenia i zabezpieczono szwem jedwabnym 2-0. Do systemu wprowadzano powietrze, zwiększając ciśnienie w tempie 5 mmHg/s, aż do pęknięcia rurek 2. Wyniki podano jako ciśnienie w mmHg, przy którym nastąpił rozryw rurek.
- Podatność dynamiczną określono dla sześciu rurkowych protez o wewnętrznej średnicy 2 mm pobranych z sześciu różnych elektroprzędzonych protez o długości 3 cm w symulowanych warunkach fizjologicznych. Zarówno pojedyncze warstwy, jak i wielowarstwowe konstrukty rurkowe były elektroprzędzione i testowane w tych samych warunkach. Okazy testowano w bioreaktorze Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation (ITEMS) opracowanym przez Tissue Growth Technologies, wypełnionym PBS w temperaturze 37°C. Bioreaktor zapewniał cykliczną zmianę ciśnienia 1 Hz wewnątrz protezy, badając trzy różne poziomy ciśnienia skurczowego/rozkurczowego: 90/50, 120/80 i 150/110 mmHg 2, 3.
Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołów elektroprzędzenia produktem końcowym powinna być miękka, bezszwowa rurka bez początkowych oznak delaminacji między warstwami. Po przeprowadzeniu jednowymiarowych prób rozciągania, prób wytrzymałości na rozrywanie, prób retencji szwów oraz prób podatności wyniki powinny wykazać, że wraz ze zwiększeniem sztywności warstwy środkowej, przy zmniejszonej ilości elastyny, powiązane właściwości mechaniczne powinny wskazywać na większą sztywność rurki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowym elementem niniejszego badania jest proces elektroprzędzenia. Przy zastosowaniu dyszy o konfiguracji wejście-wyjście 3-1 może dojść do przeskoków iskrowych i utraty ładunku. W takim przypadku napięcie związane z przędzionym polimerem spadnie, co doprowadzi do powstania zespawanych, „mokrych” włókien oraz do rozwarstwienia pomiędzy każdą z trzech warstw. Dlatego też utrzymanie stałych potencjałów elektrycznych jest niezbędne do uzyskania optymalnej wielowarstwowej rurki.
Niedopasowani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Kilku autorów posiada oczekujące na rozpatrzenie patenty w Stanach Zjednoczonych i na arenie międzynarodowej w odniesieniu do technologii przedstawionej w niniejszym manuskrypcie, a technologia ta została licencjonowana firmie Organogenesis, Inc.
Podziękowania
Pragniemy podziękować amerykańskiemu stowarzyszeniu American Heart Association Mid-Atlantic Affiliate (0555407U,GLB) za sfinansowanie badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Polikaprolakton | Sigma-Aldrich | ||
| Elastyna | Elastin Products Company | ||
| Kolagen | |||
| Kwas octowy | Fisher Scientific | ||
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | ||
| TRIS | Fisher Scientific | ||
| wirówka Avanti J-HC 6 L | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol | TCI America | ||
| strzykawka Becton Dickinson 3 ml | |||
| Zasilacz montowany w szafie rack CZE1000R | Spellman | ||
| Pompa strzykawkowa wysokociśnieniowa | Cole-Parmer | ||
| 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)-karbodiimid | Pierce, Thermo Scientific | ||
| 70% etanol | Sigma-Aldrich | ||
| oprogramowanie ImageTool 3.0 | Oprogramowanie udostępnione przez UTHSCSA | ||
| Skaningowy mikroskop elektronowy | Carl Zeiss, Inc. | ||
| System testowy MTS Bionix 200 | MTS Systems Corp. | ||
| TestWorks wersja 4 | |||
| Bioreaktor do inteligentnej inżynierii tkankowej poprzez stymulację mechaniczną (ITEMS) | Technologie wzrostu tkanek |
Bibliografia
- McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization. Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).
- Cardiovascular implants - Vascular graft protheses. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).
- McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomater. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Wytwarzanie przeszczepów tętniczychpolikaprolakton elastyna kolagenjednowymiarowe badanie rozciąganiaanaliza podatności dynamicznejbadanie wytrzymałości na wyrwanie szwówpomiar ciśnienia krytycznego rozrywaniamodelowanie matematycznemieszaniny PCL elastyny i kolagenuoptymalizacja parametrów elektroprzędzenia
