Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Podsumowanie

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Streszczenie

Techniki obrazowania spójnego ramanowskiego odnotowały w ciągu ostatniej dekady gwałtowny wzrost aktywności ze względu na perspektywę umożliwienia bezznacznikowego obrazowania optycznego o wysokiej specyficzności molekularnej ¹. Czułość tych technik jest jednak o wiele rzędów wielkości słabsza niż w przypadku fluorescencji, co wymaga mili-molarnych stężeń cząsteczek ^1,2. W niniejszej pracy opisujemy technikę, która może umożliwić detekcję słabych lub niskich stężeń cząsteczek aktywnych ramanowsko poprzez wzmocnienie ich sygnału sygnałem uzyskanym z silnych lub obfitych rozpraszaczy ramanowskich. Oddziaływanie krótkich impulsów laserowych w próbce biologicznej generuje szereg sygnałów spójnego rozpraszania ramanowskiego, z których każdy niesie unikalne informacje chemiczne o próbce. Zazwyczaj tylko jeden z tych sygnałów, np. spójne rozpraszanie ramanowskie anty-Stokesa (CARS), jest wykorzystywany do generowania obrazu, podczas gdy pozostałe są odrzucane. Jednakże, gdy te inne sygnały, w tym 3-kolorowy CARS oraz mieszanie czterofalowe (FWM), są zbierane i porównywane z sygnałem CARS, można wyekstrahować informacje, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia ³. Na przykład dwukrotnie rezonansowy CARS (DR-CARS) jest wynikiem konstruktywnej interferencji dwóch sygnałów rezonansowych ⁴. Wykazujemy, w jaki sposób dostrojenie trzech laserów wymaganych do wytworzenia sygnałów DR-CARS do wibracji rozciągającej CH przy 2845 cm^-1 w lipidach oraz wibracji rozciągającej CD przy 2120 cm^-1 w cząsteczce deuterowanej (np. deuterowanych cukrach, kwasach tłuszczowych itp.) może zostać wykorzystane do jednoczesnego badania obu rezonansów ramanowskich. W tych warunkach, oprócz sygnałów CARS z każdego rezonansu, generowany jest również połączony sygnał DR-CARS badający oba rezonanse. Wykazujemy, że wykrywanie różnicy między sygnałem DR-CARS a sygnałem wzmacniającym z wibracji obfitej cząsteczki może służyć do zwiększenia czułości dla sygnału słabszego. Ponadto demonstrujemy, że podejście to rozciąga się nawet na zastosowania, w których oba sygnały są generowane przez różne cząsteczki, tak że np. wykorzystanie silnego sygnału ramanowskiego rozpuszczalnika może wzmocnić słaby sygnał ramanowski rozcieńczonej substancji rozpuszczonej.

Protokół

1. Generowanie sygnałów CARS i DR-CARS

Aby jednocześnie generować sygnały CARS i DR-CARS, wymagane są trzy strojone i zsynchronizowane krótkopulsujące źródła laserowe.

1. Aby uzyskać trzy zsynchronizowane impulsy, zaczynamy od pojedynczego lasera o mocy 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Laser ten ma stałą długość fali 1064 nm, stałą długość impulsu 7 ps oraz stałą częstotliwość repetycji 76 MHz.
2. Za pomocą serii płytek ćwierćfalowych i kostek polaryzacyjnych rozdzielaczy wiązki wiązka zostaje rozdzielona na trzy części. Płytka ćwierćfalowa w połączeniu z kostką polaryzacyjnym rozdzielaczem wiązki pozwala na regulację mocy każdego składnika wiązki bez zmiany jej kierunku. Typowo dwie wiązki są dostrajane do około 4,5 W każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały 1 W.
3. Dwie wiązki o wysokiej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych (OPO, Avante, APE GmbH, Berlin, Niemcy). OPO wykorzystują generowanie różnicy częstotliwości do konwersji fotonu o wyższej energii na dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fal. Poprzez kontrolę temperatury kryształu wykorzystywanego do uzyskania tego efektu, długości fal powstałych fotonów mogą być kontrolowane z dokładnością do 0,1 nm. Dzięki podwojeniu częstotliwości tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nm może zostać przekształcony w wiązkę laserową, którą można dostrajać w zakresie od 780 nm do 910 nm. Pompowanie dwóch oddzielnych OPO tym samym źródłem 1064 nm pozwala uzyskać dwa niezależnie strojone źródła laserowe, które są automatycznie zsynchronizowane z pierwotnym laserem pompującym.
4. Trzecia (najsłabsza) wiązka z lasera pompującego 1064 nm jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji luster dichroicznych, tak aby wszystkie trzy wiązki (2 z OPO, 1 z lasera pompującego) mogły zostać później ponownie połączone. Aby efektywnie generować koherentne fotony sygnału Raman, połączone impulsy muszą nakładać się zarówno czasowo, jak i przestrzennie. Ponieważ OPO zawierają rezonatory pierścieniowe, co pozwala każdemu impulsowi laserowemu przejść przez kryształ wielokrotnie, wiązki przechodzące przez OPO pokonują dodatkową drogę, co skutkuje znacznym opóźnieniem w stosunku do pierwotnej wiązki pompującej. Odległość ta musi zostać skompensowana w trzeciej wiązce poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które wymuszają przebycie przez tę wiązkę takiej samej drogi jak przez dwie pozostałe przed ich ponownym połączeniem za pomocą luster dichroicznych.
5. W celu precyzyjnej regulacji długości drogi każdej wiązki, w torze każdej z nich zastosowano regulowane stopnie opóźniające z wykorzystaniem retroreflektorów pryzmatycznych.
6. Do każdej wiązki dodano kolejny zestaw płytek ćwierćfalowych i kostek polaryzacyjnych rozdzielaczy wiązki, co pozwala na niezależną regulację mocy każdej wiązki bez wpływu na wejście do OPO.
7. Lustra dichroiczne są wykorzystywane do najpierw połączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie z wiązką 1064 nm. Należy zadbać o to, aby wiązki precyzyjnie się nakładały (tzn. były współliniowe i miały podobną rozbieżność). Można to sprawdzić, porównując nakładanie się wiązek blisko (w odległości kilku centymetrów) i daleko (około 1 m) od lustra dichroicznego.
8. Zaletą stosowania laserów impulsowych jest to, że każdy impuls może mieć wysoką energię szczytową w próbce, co umożliwia efektywne generowanie koherentnych sygnałów Raman, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej średniej intensywności. Wysoka średnia intensywność może uszkodzić próbkę. Dlatego w celu dalszej kontroli średniej intensywności bez poświęcania energii szczytowej, trzy połączone wiązki są kierowane przez modulator elektrooptyczny (komórka Pockelsa, ConOptics) działający jako selektor impulsów (pulse picker), który pozwala dostosować częstotliwość repetycji impulsów docierających do próbki, a tym samym średnią intensywność.
9. Połączone wiązki laserowe są następnie wprowadzane do mikroskopu odwróconego z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (NA). Obiektywem jest zazwyczaj obiektyw wodny 60X o aperturze numerycznej (NA) 1,2, który został skorygowany pod kątem aberracji chromatycznej w zakresie strojenia naszych OPO oraz wiązki 1064 nm. Silne ogniskowanie generowane przez obiektyw o wysokim NA umożliwia najefektywniejsze generowanie koherentnych sygnałów Raman w skali mikronowej.
10. Połączone wiązki są rozszerzone, aby przepełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopu. Przepełniając tył obiektywu mikroskopu, możemy uzyskać najlepsze warunki ogniskowania, a tym samym najlepszą rozdzielczość przestrzenną w naszym systemie mikroskopowym.
11. Obiektyw w naszym mikroskopie jest zamontowany na piezo-stoliku XYZ, co pozwala na uzyskanie obrazów poprzez rastrowanie wiązek w poprzek próbki, podobnie jak w komercyjnych konfokalnych mikroskopach skaningowych.

2. Zastosowanie trzech laserów krótkopulsacyjnych

Zastosowanie trzech laserów impulsowych o krótkim czasie trwania prowadzi do generowania kilku sygnałów CARS, pochodzących z różnych kombinacji dwóch laserów, a także sygnałów 3-Color CARS i DR-FWM, powstających w wyniku kombinacji wszystkich trzech laserów.

1. Długości fal sygnałów mogą znajdować się blisko siebie w widmie. Gdy sygnały są położone blisko siebie, ich rozdzielenie w celu analizy przy użyciu filtrów pasmowych o stałej długości fali i luster dichroicznych może być trudne. Z tego powodu nasze sygnały są kierowane do spektrometru obrazującego (SpectraPro 2300i, Acton Research), który służy również jako wydajny monochromator do przestrzennego rozdzielania sygnałów o różnych długościach fal.
2. Elektronicznie sterowane lustro odchylające wewnątrz spektrometru, znajdując się w pozycji opuszczonej, kieruje sygnał do kamery z urządzeniem ładunkowym (CCD) o głębokim drenowaniu z podświetleniem tylnym, która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału i pozwala nam zidentyfikować oraz zoptymalizować poszczególne koherentne sygnały Ramana.
3. Aby wybrać sygnał, który chcemy obrazować, po prostu obracamy siatkę wewnątrz spektrometru, korzystając z dostarczonego przez producenta oprogramowania sterującego i akwizycyjnego (WinSpec, Princeton Instruments), aby wycentrować interesujący nas pik na kamerze CCD, a następnie zmieniamy położenie lustra odchylającego, by przekierować ten sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego podłączona jest lawinowa fotodioda (APD) z licznikiem pojedynczych fotonów.
4. Następnie obiektyw jest skanowany rastrowo, a sygnały rejestrowane przez APD są wykorzystywane do wygenerowania obrazu poprzez wyświetlenie szybkości zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Niemcy).
5. Powtarzamy tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego koherentnego sygnału Ramana, co pozwala nam na porównanie sygnałów podczas przetwarzania końcowego.

3. Przygotowanie próbek

Aby uzyskać wyraźne i powtarzalne obrazy, należy zachować należytą staranność podczas przygotowania próbki.

1. Próbki przygotowuje się zazwyczaj na szklanych szkiełkach nakrywkowych o grubości ~150 micron. Szkiełka te są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z użyciem obiektywów o aperturze numerycznej 1.2 NA, które są powszechnie stosowane.
2. Optyczne więzienie obiektów dielektrycznych może zachodzić, gdy światło laserowe ulega dyfrakcji na małych przezroczystych obiektach. Zastosowanie silnie skupionych, krótkich impulsów laserowych o wysokiej mocy szczytowej może powodować przemieszczanie małych komórek lub bakterii, co skutkuje rozmytymi lub rozmazanymi obrazami. Aby tego uniknąć, konieczne może być unieruchomienie próbki na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego poprzez uprzednie naniesienie cienkiej warstwy poli-L-lizyny metodą spin-coatingu.
3. W przypadku komórek w hodowli można zastosować szalki hodowlane z szklanym dnem, co umożliwia obrazowanie bez konieczności odrywania komórek od naczyń hodowlanych.
4. W ramach demonstracji w niniejszym opracowaniu najpierw osadzamy utrwalonego formaldehydem nicienia C. elegans na szklanym szkiełku nakrywkowym.
5. Następnie dodajemy do nicienia 20 μL kropli 5 M roztworu glukozy deuterowanej. Roztwór glukozy deuterowanej zapewnia unikalny i silny sygnał tła w widmie Ramanowskim.

4. Analiza próbek

Aby właściwie wykorzystać efekt wzmocnienia podwójnego rezonansu, znane muszą być widma Ramana obu substancji rezonansowych.

1. Po przygotowaniu próbki na szkiełku nakrywce analizuje się ją za pomocą konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego, aby uzyskać odpowiednie spontaniczne widmo Ramanowskie i zidentyfikować właściwe piki.
2. Aby przeprowadzić DR-CARS, identyfikujemy położenia widmowe modu rozciągającego CH, typowo kojarzonego z lipidami, oraz modu rozciągającego CD, kojarzonego z deuterowaną glukozą, które wynoszą odpowiednio 2845 cm^-1 i 2121 cm^-1.
3. Koherentne rozpraszanie Ramanowskie występuje, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgań cząsteczkowych. Poprzez dostrojenie jednego OPO do 817 nm, w połączeniu z wiązką lasera o długości 1064 nm, bada on mod CH o wartości 2845 cm^-1, a poprzez dostrojenie drugiego OPO do 868 nm, w połączeniu z wiązką 1064 nm, bada on pik o wartości 2121 cm^-1.
4. Dzięki skanowaniu rastrowemu próbki w mikroskopie CARS możemy teraz zaobserwować trzy interesujące sygnały koherentnego rozpraszania Ramanowskiego: sygnał CARS badający drgania rozciągające CH, sygnał CARS badający mod rozciągający CD oraz sygnał DR-CARS badający oba te mody.
5. Wybieramy każdy pik zgodnie z opisem w sekcji 2.3 i wykonujemy obraz zgodnie z powyższym opisem.

5. Przetwarzanie obrazów

Wyodrębnienie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech obrazów wymaga teraz zastosowania dość prostego przetwarzania obrazu.

1. W pierwszej kolejności obrazy muszą zostać znormalizowane. Teoretycznie normalizację można osiągnąć poprzez uwzględnienie intensywności każdego lasera biorącego udział w procesie generowania poszczególnych sygnałów. W praktyce jednak nie zawsze jest to skuteczne, głównie ze względu na niejednorodną odpowiedź spektralną luster dichroicznych, detektorów i siatek dyfrakcyjnych.
2. Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że w obszarach, w których sygnał jest zdominowany przez czyste lipidy, rezonans CD nie powinien wnosić żadnego wkładu do sygnału. Analogicznie, w obszarach czystego roztworu glukozy rezonans CH nie powinien wpływać na sygnał. Mając to na uwadze, normalizujemy obraz DR-CARS oraz obraz CARS uzyskany dla rezonansu CD deuterowanego roztworu glukozy do obszaru znajdującego się wyraźnie poza organizmem nicienia C. elegans, w którym nie powinien wystąpić rezonans CH.
3. Następnie w obrazie CARS z rezonansem CH identyfikujemy obszar wewnątrz nicienia bogaty w lipidy i normalizujemy go do odpowiadającego mu obszaru w znormalizowanym obrazie DR-CARS. Aby ta metoda działała prawidłowo, przyjmujemy założenie, że w głębi tego obszaru nie występuje deuterowana glukoza. Jest to bezpieczne założenie, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie będą mieszać się z roztworem.
4. Teraz, odejmując znormalizowany obraz CARS z rezonansem CH od znormalizowanego obrazu DR-CARS, otrzymujemy wyłącznie wzmocniony sygnał z rezonansu CD.
5. Podobnie, odejmując znormalizowany obraz CARS z rezonansem CD od znormalizowanego obrazu DR-FWM, otrzymujemy wyłącznie wzmocniony sygnał z rezonansu CH.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Schemat systemu mikroskopii DR-CARS opisanego powyżej.

Rysunek 2: Obraz w świetle białym nicienia C. elegans w roztworze glukozy deuterowanej, przygotowany na szkiełku nakrywkowym i gotowy do obrazowania.

Rycina 3: Widmo Ramana zmodyfikowanego kwasu oleinowego (nienasyconego kwasu tłuszczowego), który zawiera modyfikację alkinową (grupę z potrójnym wiązaniem węgiel-węgiel). Silne rezonanse CH przy 2845 cm^-1 oraz rezonans alkinowy przy 2100 cm^-1 są dobrze odseparowane od obszaru odcisków palców (regionu o dużym zagęszczeniu pików), co czyni je idealnymi markerami dla koherentnego obrazowania Ramanowskiego.

Rycina 4: Typowe widmo koherentnych sygnałów Ramana generowanych podczas nakładania trzech laserów krótkopulsujących w próbce. Strzałki wskazują proces(y) odpowiedzialne za każdy sygnał, przedstawione na schematach poziomów energetycznych. Na schematach strzałki przerywane oznaczają fotony z laserów i OPO, a strzałki ciągłe wskazują powstały sygnał. Ciągłe linie poziome wskazują energię wibracji Ramana i obrazują, że w DR-CARS jednoczesne mieszanie tych samych 3 fotonów wejściowych pozwala na badanie dwóch różnych wibracji Ramana.

Rysunek 5: Typowe wyniki obrazowania nicieni C. elegans przy użyciu DR-CARS i CARS. W górnym rzędzie wykorzystano trzy sygnały wskazane na Rysunku 4 do obrazowania nicienia w roztworze deuterowanej glukozy. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie uzyskano obrazy różnicowe poprzez odjęcie każdego z obrazów CARS od obrazu DR-CARS.

Dyskusja

Spektroskopia Ramana oraz obrazowanie oparte na rozproszeniu Ramana to potężne, rozwijające się narzędzia w naukach biologicznych. Obecnie znajduje to szczególne zastosowanie w badaniach in vivo i in vitro metabolizmu komórkowego oraz zaburzeń metabolicznych w procesach przetwarzania i magazynowania lipidów. Większość biomakrocząsteczek zawiera dużą liczbę podobnych, głównie węglowych wiązań molekularnych, przez co widma Ramana otrzymywane z komórek i organizmów są zazwyczaj splotem sygnałów pochodzących z lipidów, białek, kwasów nukleinowych, cukrów itp. Lipidy są stosunkowo łatwe do wyodrębnienia z tych złożonych widm ze względu na ich tendencję do tworzenia gęstych kropel lub dwuwarstw oraz zawartość rozbudowanych łańcuchów z dużą liczbą alifatycznych wiązań CH. Możliwość wyizolowania konkretnych białek, aminokwasów, RNA lub DNA w złożonym środowisku komórkowym jest jednak bardzo ograniczona. Dotyczy to szczególnie sytuacji, gdy interesujące cząsteczki występują w stężeniach rzędu μM lub niższych. W tym kontekście możliwość badania słabych rezonansów Ramana z wykorzystaniem nowej techniki obrazowania różnicowego DR-CARS stanowi potencjalnie potężne podejście do ich mikroanalizy chemicznej i obrazowania. Należy przyznać, że najtrudniejszą częścią tego protokołu jest wyrównanie i synchronizacja systemu laserowego. Przy konfiguracji od podstaw synchronizacja impulsów, czyli zapewnienie ich nakładania się w czasie pomimo różnych dróg przejścia, może zostać ułatwiona dzięki zastosowaniu autokorelatora impulsów. Po osiągnięciu nakładania się przestrzennego i czasowego sygnały CARS i DR-CARS powinny być łatwo wykrywalne. Jednakże pierwsze wyrównanie jest często niedokładne, co skutkuje słabymi sygnałami. Najlepszą praktyką w celu precyzyjnego wyrównania tego systemu jest początkowe wygenerowanie słabych sygnałów, a następnie zwiększenie ich natężenia poprzez delikatne korygowanie luster na każdej z dróg i regulowanie nakładania się czasowego za pomocą stopni opóźnienia. Choć spektrometr/monochromator działa jako bardzo wydajna przesłona dla światła pokojowego, najczystsze wyniki można uzyskać, pracując przy wyłączonym świetle w pomieszczeniu i korzystając z zasłon lub tubusów na obiektywy, aby zminimalizować tło wprowadzane przez inne źródła światła (np. monitory komputerowe, lampki kontrolne, diody LED itp.).

W naszej konfiguracji wykorzystujemy detektory lawinowe (APD) do zliczania pojedynczych fotonów oraz sprzęt do czasowo-skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) w celu detekcji ⁵. Pozwala nam to na wykrywanie niezwykle słabych sygnałów przy stosunkowo niskim poziomie szumów, jednak wiele grup uznało za korzystne zastosowanie fotopowielaczy (PMT) ze zmiennym wzmocnieniem podczas wykonywania podobnych pomiarów. Przewagą fotopowielaczy jest to, że oferują one zmienne wzmocnienie i posiadają znacznie większą powierzchnię detekcji, co może ułatwić ustawienie detektora. Dodatkowo w naszym układzie wykorzystujemy stoliki piezoelektryczne do przesuwania obiektywu w celu skanowania wiązki. Zaletą tego rozwiązania jest możliwość powrotu do dowolnego punktu w uprzednio zeskanowanym obrazie z wysoką dokładnością i wykonania dodatkowych pomiarów, w tym spontanicznych widm Ramana. Inne grupy z sukcesem stosowały zestawy luster skanujących, a nawet całe jednostki skanowania konfokalnego, takie jak system Olympus FluoView, który oferuje znacznie szybsze obrazowanie, ale ma ograniczone możliwości precyzyjnego powrotu do dowolnych lokalizacji w obrębie obrazu.

Dostrojenie laserów tak, aby odpowiadały rezonansowi Ramana, jest również krytycznym krokiem, który może wymagać optymalizacji. Chociaż piki Ramana mogą być znane, maksymalna intensywność piku widmowego uzyskanego z DR-CARS i CARS niekoniecznie odpowiada maksimum piku spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego. Wynika to z wewnętrznej interferencji sygnałów generowanych przez mieszanie czterofalowe, co prowadzi do powstania nierozdzielonego sygnału tła i CARS, co zniekształca widma CARS w stosunku do widm spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego. Położenie widmowe maksimum sygnału CARS można obliczyć, jednak bardziej praktycznym podejściem jest dostrajanie OPO w kilku małych krokach widmowych w obrębie oczekiwanego położenia rezonansu Ramana. Proces ten powinien przynieść wyraźne maksimum. W rzeczywistości, dla uzyskania największej czułości DR-FWM oba rezonanse muszą być dostrojone do tego maksimum.

Należy również omówić jeszcze jeden potencjalny problem podejścia DR-CARS, mianowicie fakt, że sygnał DR-CARS zależy od jednorodnego rozkładu aktywnej ramanowsko cząsteczki wzmacniającej. W przypadku większości obiektów biologicznych może to być szeroki rezonans grupy OH pochodzącej z wody, która występuje powszechnie i niemal wszędzie. Woda jest jednak wykluczona z regionów hydrofobowych w komórce, takich jak kropelki lipidowe, co prowadzi do zniekształcenia sygnałów otrzymywanych podczas wykorzystania rezonansu wody do wzmocnienia modów lipidowych. W naszym przykładzie zastosowaliśmy roztwór deuterowanej glukozy, aby wygenerować łatwo wykrywalny i obfity sygnał dla naszej próbki biologicznej. Podobnie można by zastosować deuterowaną wodę lub deuterowane bufory biologiczne, takie jak d-HEPES. W naszym przykładzie kropelki lipidowe wewnątrz nicieni C. elegans były na tyle małe, że w obszarze ogniskowania wiązki lasera naszego systemu zawsze znajdowały się zarówno roztwór deuterowanej glukozy, jak i lipidy. Nie jest to jednak prawdą w każdym przypadku. Szczególnym przykładem byłyby adipocyty, które tworzą w swojej cytoplazmie dość duże kropelki lipidowe. Oznacza to, że każdy eksperyment przeprowadzany techniką DR-CARS wymaga starannego przygotowania i przeprowadzenia doświadczeń kontrolnych w celu weryfikacji wyników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
obiektyw 60X z imersją wodną	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Mikroskop odwrócony	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Kryształ Pockelsa	ConOptics	350-160
Pompa Picotrain Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optyczny oscylator parametryczny	APE	Levante IR
1,5 szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-545-102 25 cm-1
Płytki półfalowe	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Kostki polaryzacyjnego dzielnika wiązki	Thorlabs Inc.	PBS052 lub PBS053
Spektrometr/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
Kamera CCD	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Fotodioda lawinowa	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
Stolik piezoelektryczny XYZ	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	Jest to połączenie stolika XY oraz uchwytu obiektywu Z.
Lustra dichroiczne	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	Wybór tych konkretnych filtrów dichroicznych nie jest krytyczny; wystarczy dowolny zestaw o odpowiednich charakterystykach transmisji i odbicia.
Lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	Aby połączyć różne wiązki laserowe w bliskiej podczerwieni
płyta TCSPC	PicoQuant	Timeharp 200
Oprogramowanie do obrazowania Symphotime	PicoQuant
Matlab	Mathworks