Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z podwójnie rezonansowym koherentnym rozpraszaniem Ramana antystokesa (CARS)

Podsumowanie

Kombinacja trzech laserów o krótkich impulsach o pojedynczej długości fali jest używana do generowania spójnego rozpraszania Ramana anty-Stokesa (CARS) i podwójnie rezonansowych CARS (DR-CARS). Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość dla trudnych do wykrycia spójnych sygnałów Ramana, umożliwiając obrazowanie słabych rozpraszaczy Ramana.

Streszczenie

Techniki spójnego obrazowania ramanowskiego odnotowały dramatyczny wzrost aktywności w ciągu ostatniej dekady ze względu na ich obietnicę umożliwienia bezznacznikowego obrazowania optycznego o wysokiej specyficzności molekularnej ¹. Czułość tych technik jest jednak o wiele rzędów wielkości słabsza niż fluorescencji, co wymaga milimolowych stężeń molekularnych ^1,2. W tym miejscu opisujemy technikę, która może umożliwić wykrycie słabych lub niskich stężeń cząsteczek aktywnych Ramana poprzez wzmocnienie ich sygnału sygnałem uzyskanym z silnych lub licznych rozpraszaczy Ramana. Interakcja laserów o krótkich impulsach w próbce biologicznej generuje różnorodne spójne sygnały rozpraszania Ramana, z których każdy niesie ze sobą unikalne informacje chemiczne o próbce. Zazwyczaj tylko jeden z tych sygnałów, np. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), jest używany do generowania obrazu, podczas gdy inne są odrzucane. Jednakże, gdy te inne sygnały, w tym 3-kolorowe CARS i mieszanie czterofalowe (FWM), są zbierane i porównywane z sygnałem CARS, w przeciwnym razie można wydobyć trudne do wykrycia informacje ³. Na przykład podwójnie rezonansowe CARS (DR-CARS) jest wynikiem konstruktywnej interferencji między dwoma sygnałami rezonansowymi ⁴. Pokazujemy, w jaki sposób dostrojenie trzech laserów wymaganych do wytwarzania sygnałów DR-CARS do wibracji rozciągających 2845 ^cm-1 CH w lipidach i wibracji rozciągających 2120 ^cm-1 CD cząsteczki deuterowanej (np. cukrów deuterowanych, kwasów tłuszczowych itp.) można wykorzystać do jednoczesnego badania obu rezonansów Ramana. W tych warunkach, oprócz sygnałów CARS z każdego rezonansu, generowany jest również połączony sygnał DR-CARS sondujący oba rezonanse. Pokazujemy, w jaki sposób wykrywanie różnicy między sygnałem DR-CARS a sygnałem wzmacniającym z wibracji dużej cząsteczki może być wykorzystane do zwiększenia czułości słabszego sygnału. Dalej wykazujemy, że podejście to rozciąga się nawet na zastosowania, w których oba sygnały są generowane z różnych cząsteczek, tak że np. użycie silnego sygnału Ramana rozpuszczalnika może wzmocnić słaby sygnał Ramanowski rozcieńczonej substancji rozpuszczonej.

Protokół

1. Generowanie sygnałów CARS i DR-CARS

Aby jednocześnie generować sygnały CARS i DR-CARS, potrzebne są trzy przestrajalne i zsynchronizowane źródła laserów o krótkich impulsach.

1. Aby uzyskać trzy zsynchronizowane impulsy zaczynamy od pojedynczego lasera o mocy 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Laser ten ma stałą długość fali 1064 nm, stałą długość impulsu 7 ps i stałą częstotliwość powtarzania 76 MHz.
2. Za pomocą szeregu płytek półfalowych i kostek rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej wiązka jest dzielona na trzy części. Płytka półfalowa w połączeniu z polaryzacyjną kostką rozdzielacza wiązki pozwala nam na regulację ilości mocy w każdym składowym wiązki bez zmiany jej kierunku. Zazwyczaj dwie wiązki są ustawione na ~ 4,5 W każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały 1 W.
3. Dwie wiązki o dużej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych (OPO, Avante, APE GmbH, Berlin, Niemcy). OPO wykorzystują generowanie częstotliwości różnicowych do przekształcania fotonu o wyższej energii w dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fal. Kontrolując temperaturę kryształu użytego do osiągnięcia tego efektu, długości fal powstałych fotonów mogą być kontrolowane z dokładnością do 0,1 nm. Dzięki podwojeniu częstotliwości tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nm może zostać przekształcony w wiązkę laserową, którą można dostroić w dowolnym miejscu w zakresie od 780 nm do 910 nm. Pompując dwa oddzielne OPO z tym samym źródłem 1064 nm, uzyskujemy dwa niezależnie przestrajalne źródła lasera, które są automatycznie synchronizowane z naszym oryginalnym laserem pompującym.
4. Trzecia (najniższa moc) wiązka z lasera pompującego o długości fali 1064 nm jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji zwierciadeł dichroicznych, dzięki czemu wszystkie trzy wiązki (2 z OPO, 1 z lasera pompującego) mogą być później ponownie połączone. Aby efektywnie wytworzyć koherentne fotony sygnału Ramana, rekombinowane impulsy muszą nakładać się na siebie zarówno czasowo, jak i przestrzennie. Ponieważ OPO zawierają wnęki pierścieniowe, dzięki czemu każdy impuls laserowy przechodzi przez kryształ wiele razy, wiązki wysyłane przez OPO pokonują dodatkową odległość, co powoduje znaczne opóźnienie w stosunku do oryginalnej wiązki pompy. Odległość ta musi być skompensowana trzecią wiązką poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które zmuszają tę wiązkę do pokonania tej samej odległości co pozostałe dwie, zanim zostaną one ponownie połączone za pomocą zwierciadeł dichroicznych.
5. Aby zapewnić precyzyjną regulację długości ścieżki, po której porusza się każda wiązka, do każdej ścieżki wiązki wprowadzane są regulowane stopnie opóźniające za pomocą retroreflektorów pryzmatycznych.
6. Do każdej wiązki dodawany jest kolejny zestaw płytek półfalowych i kostek rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej, aby umożliwić nam niezależną regulację mocy każdej wiązki bez wpływu na dane wejściowe OPO.
7. Zwierciadła dichroiczne służą najpierw do łączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie z wiązką 1064 nm. Należy zwrócić uwagę, aby belki dokładnie zachodziły na siebie (tzn. były współliniowe i miały podobną rozbieżność). Można to sprawdzić, porównując nakładanie się belek blisko (w granicach kilku centymetrów) i daleko od (~ 1 m) zwierciadła dichroicznego.
8. Zaletą stosowania laserów impulsowych jest to, że każdy impuls może mieć wysoką energię szczytową na próbce, co pozwala na efektywne generowanie koherentnych sygnałów Ramanowskich, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej średniej intensywności. Wysoka średnia intensywność może uszkodzić próbkę. Dlatego, aby dalej kontrolować średnią intensywność bez poświęcania energii szczytowej, trzy połączone wiązki są wysyłane przez modulator elektrooptyczny (komórka Pockela, ConOptics) działający jako selektor impulsów, który pozwala nam dostosować częstotliwość powtarzania impulsów, które docierają do naszej próbki, a tym samym średnią intensywność.
9. Połączone wiązki laserowe są następnie sprzęgane z odwróconym mikroskopem z obiektywem o wysokiej NA. Obiektyw jest zazwyczaj soczewką do soczewek wodnych 60 X z aperturą numeryczną (NA) 1,2, która została skorygowana o aberrację chromatyczną w całym zakresie przestrajania naszych OPO i wiązki 1064 nm. Ścisłe ogniskowanie generowane przez soczewkę obiektywową o wysokiej NA pozwala na najbardziej efektywne generowanie koherentnych sygnałów Ramana w skali mikronów.
10. Połączone wiązki są rozszerzane w celu przepełnienia tylnego otworu obiektywu mikroskopu. Poprzez przepełnienie tylnej części obiektywu mikroskopu możemy osiągnąć najlepsze warunki ustawiania ostrości, a tym samym najlepszą rozdzielczość przestrzenną w naszym systemie mikroskopowym.
11. Soczewka obiektywu w naszym mikroskopie jest zamontowana na stoliku piezoelektrycznym XYZ, który pozwala nam uzyskać obrazy poprzez skanowanie rastrowe wiązek w poprzek próbki, podobnie jak w komercyjnych mikroskopach konfokalnych ze skanowaniem wiązki.

2. Użycie trzech laserów o krótkich impulsach

Użycie trzech laserów o krótkich impulsach powoduje produkcję kilku sygnałów CARS z różnych kombinacji dwóch laserów, a także 3-kolorowych sygnałów CARS i DR-FWM z połączenia wszystkich trzech laserów.

1. Długości fal sygnałów mogą leżeć widmowo blisko siebie. Gdy sygnały znajdują się blisko siebie, może być trudno rozdzielić je do analizy przy użyciu filtrów pasmowoprzepustowych o stałej długości fali i zwierciadeł dichroicznych. Z tego powodu nasze sygnały są przekazywane do spektrometru obrazującego (SpectraPro 2300i, Acton Research), który służy również jako wydajny monochromator do przestrzennego rozdzielania sygnałów o różnych długościach fal.
2. Elektronicznie uruchamiane lustro obrotowe w spektrometrze w opuszczonej pozycji wysyła sygnał do podświetlanej wstecznie kamery CCD (Deep Depletion Charge-Coupled Device), która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału i pozwala nam zidentyfikować i zoptymalizować różne spójne sygnały Ramana.
3. Aby wybrać sygnał, za pomocą którego chcemy obrazować, po prostu obracamy siatkę w spektrometrze, korzystając z dostarczonego przez dostawcę oprogramowania do sterowania i akwizycji danych (WinSpec, Princeton Instruments), aby wyśrodkować interesujący nas pik na kamerze CCD, a następnie zmienić położenie lustra odchylanego, aby przekierować ten sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego podłączona została fotodioda lawinowa zliczająca pojedyncze fotony (APD).
4. Soczewka obiektywu jest następnie skanowana rasterowo, a sygnały zarejestrowane na APD są wykorzystywane do generowania obrazu poprzez wyświetlanie szybkości zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Niemcy).
5. Powtarzamy tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego spójnego sygnału Ramanowskiego, co pozwala nam porównać sygnały podczas przetwarzania końcowego.

3. Przygotowanie próbki

Aby uzyskać wyraźne, powtarzalne obrazy, należy zachować ostrożność podczas przygotowywania próbki.

1. Próbki są zwykle przygotowywane na szkiełkach nakrywkowych o grubości ~150 mikronów. Te szkiełka nakrywkowe są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą zwykle używanych obiektywów 1,2 NA.
2. Optyczne uwięzienie obiektów dielektrycznych może wystąpić, gdy światło lasera ulega dyfrakcji przez małe przezroczyste obiekty. Użycie ściśle skoncentrowanych, o dużej mocy szczytowej, krótkich impulsowych wiązek laserowych może następnie ciągnąć za sobą małe komórki lub bakterie, powodując rozmyte lub rozmazane obrazy. Aby tego uniknąć, może być konieczne unieruchomienie próbki na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego poprzez uprzednie nałożenie cienkiej warstwy poli-L-lizyny przez wirowanie.
3. W przypadku komórek w hodowli można zastosować szalki hodowlane ze szklanym dnem, które umożliwiają obrazowanie bez konieczności odłączania komórek od szalek wzrostu kultur komórkowych.
4. W celu zademonstrowania tego wkładu najpierw umieszczamy na szklanym szkiełku nakrywkowym utrwalonego w formaldehydzie nicienie C. elegans.
5. Następnie dodaj do robaka 20 μl kropli 5 M deuterowanego roztworu glukozy. Deuterowany roztwór glukozy zapewnia unikalną i silną sygnaturę tła Ramana.

4. Przykładowa analiza

Aby prawidłowo wykorzystać efekt wzmocnienia podwójnie rezonansowego, muszą być znane widma Ramana obu substancji rezonujących z Ramanem.

1. Po przygotowaniu próbki na szkiełku nakrywkowym jest ona analizowana przy użyciu konfokalnego mikroskopu Ramana w celu uzyskania odpowiedniego spontanicznego widma Ramana i zidentyfikowania odpowiednich pików.
2. Aby wykonać DR-CARS, identyfikujemy lokalizacje spektralne trybu rozciągania CH, zwykle związanego z lipidami, oraz trybu rozciągania CD, związanego z deuterowaną glukozą, wynoszące odpowiednio 2845 ^cm-1 i 2121 ^cm-1.
3. Koherentne rozpraszanie Ramana uzyskuje się, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgań molekularnych. Dostrajając jeden OPO do 817 nm, będzie sondował tryb 2845 ^cm-1 CH w połączeniu z wiązką laserową 1064 nm, a dostrajając drugi OPO do 868 nm, będzie sondował szczyt 2121 ^cm-1 w połączeniu z wiązką 1064 nm.
4. Skanując raster próbki pod mikroskopem CARS, możemy teraz zaobserwować trzy interesujące nas spójne sygnały ramanowskie. Sygnał CARS sondujący drgania rozciągające CO, sygnał CARS sondujący tryb rozciągania CD oraz sygnał DR-CARS sondujący oba te tryby.
5. Wybieramy każdy pik zgodnie z opisem w sekcji 2.3 i wykonujemy zdjęcie zgodnie z powyższym opisem.

5. Przetwarzanie obrazu

Wydobycie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech obrazów wymaga teraz dość prostego przetwarzania obrazu.

1. Najpierw obrazy muszą zostać znormalizowane. Teoretycznie normalizację można osiągnąć, biorąc pod uwagę intensywność każdego lasera biorącego udział w każdym procesie generowania sygnału. W praktyce jednak nie zawsze się to udaje, głównie ze względu na niejednorodną odpowiedź spektralną dichroicznych luster, detektorów i siatek.
2. Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że w regionach, w których sygnał dominuje czyste lipidy, rezonans CD nie powinien przyczyniać się do żadnego sygnału. Podobnie, w regionach czystego roztworu glukozy rezonans CH nie powinien przyczyniać się do żadnego sygnału. Mając to na uwadze, normalizujemy obraz DR-CARS i obraz CARS uzyskany na rezonansie CD deuterowanego roztworu glukozy do obszaru znacznie poza robakiem C. elegans, który nie powinien wykazywać rezonansu CH.
3. Następnie identyfikujemy region wewnątrz robaka na obrazie CARS z rezonansem CH, który jest bogaty w lipidy i normalizujemy go do odpowiedniego regionu w znormalizowanym obrazie DR-CARS. Aby ta metoda działała poprawnie, zakładamy, że głęboko w tym regionie nie ma deuterowanej glukozy. Jest to bezpieczne założenie, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie mieszają się z roztworem.
4. Teraz, odejmując znormalizowany obraz CARS z rezonansem CH, od znormalizowanego obrazu DR-CARS, otrzymujemy tylko wzmocniony sygnał rezonansowy CD.
5. Podobnie, odejmując znormalizowany obraz CARS z rezonansem CD od znormalizowanego obrazu DR-FWM, otrzymujemy tylko wzmocniony sygnał rezonansowy CH.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Schemat systemu mikroskopowego DR-CARS opisany powyżej.

Rycina 2: Obraz w świetle białym robaka C. elegans w deuterowanym roztworze glukozy przygotowanym na szklanym szkiełku nakrywkowym i gotowym do obrazowania.

Rysunek 3: Widmo Ramana zmodyfikowanego kwasu oleinowego (nienasyconego kwasu tłuszczowego), które obejmuje modyfikację alkinową (grupa węglowa o potrójnym wiązaniu węglowym). Silne rezonanse CH na wysokości 2845 ^cm-1 i rezonans alkinowy na wysokości 2100 ^cm-1 są dobrze odizolowane od obszaru odcisków palców (obszaru gęsto upakowanych pików), co czyni je idealnymi markerami do spójnego obrazowania ramanowskiego.

Rysunek 4: Typowe widmo koherentnych sygnałów ramanowskich generowanych, gdy trzy lasery o krótkich impulsach nakładają się na siebie w próbce. Strzałki wskazują procesy odpowiedzialne za każdy sygnał przedstawione na wykresach energetycznych. Na pokazanych tutaj schematach strzałki przerywane wskazują fotony z lasera, a strzałki OPO i strzałki ciągłe wskazują sygnał wynikowy. Ciągłe poziome linie wskazują energię wibracji Ramana i dają wizualną reprezentację, że w DR-CARS mieszanie tych samych 3 fotonów wejściowych jednocześnie bada dwie różne wibracje Ramana.

Rycina 5: Typowe wyniki obrazowania robaków C. elegans za pomocą DR-CARS i CARS. W górnym rzędzie wykorzystano trzy sygnały wskazane na rysunku 4 do zobrazowania robaka w roztworze deuterowanej glukozy. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie obrazy różnicowe zostały uzyskane poprzez odjęcie każdego z obrazów CARS od obrazu DR-CARS.

Dyskusja

Spektroskopia Ramana i obrazowanie oparte na Ramanie to potężne narzędzia pojawiające się w naukach biologicznych. Obecnie dotyczy to w szczególności badań in vivo i in vitro metabolizmu komórkowego i zaburzeń metabolicznych w przetwarzaniu i magazynowaniu lipidów. Większość biomakrocząsteczek zawiera dużą liczbę podobnych, głównie opartych na węglu wiązań molekularnych, tak że widma Ramana uzyskane z komórek i organizmów są zazwyczaj splotem wkładów lipidów, białek, kwasów nukleinowych, cukrów itp. Lipidy są stosunkowo łatwe do wyizolowania z tych złożonych widm, ze względu na ich tendencję do tworzenia gęstych kropelek lub dwuwarstw oraz dlatego, że zawierają wydłużone łańcuchy z dużą liczbą alifatycznych wiązań CH. Nasza zdolność do izolowania określonych białek, aminokwasów, RNA lub DNA w złożonym środowisku komórkowym jest jednak bardzo ograniczona. Jest to szczególnie ważne, jeśli te interesujące cząsteczki są obecne tylko w stężeniach μM i niższych. W tym przypadku możliwość sondowania słabych rezonansów Ramanowskich przy użyciu naszej nowo wprowadzonej techniki obrazowania różnicowego DR-CARS zapewnia potencjalnie potężne podejście do ich chemicznej mikroanalizy i obrazowania. Trzeba przyznać, że najbardziej skomplikowaną częścią tego protokołu jest wyrównanie i synchronizacja systemu laserowego. Zaczynając od zera, synchronizacja impulsów, czyli zapewnienie, że impulsy nakładają się na siebie w czasie, pomimo różnych ścieżek, którymi podążają, może być ułatwiona dzięki zastosowaniu autokorelatora impulsów. Po uzyskaniu nakładania się przestrzennego i czasowego sygnały CARS i DR-CARS powinny być łatwo wykrywalne. Jednak pierwsze wyrównanie jest często surowe, co skutkuje słabymi sygnałami. Najlepszą praktyką dobrego dopasowania tego systemu jest początkowe generowanie słabych sygnałów, a następnie poprawa siły sygnału poprzez delikatne dostrajanie luster wzdłuż każdej ścieżki i regulację czasowego nakładania się za pomocą stopni opóźniających. Chociaż spektrometr/monochromator działa jak bardzo wydajna przegroda dla światła w pomieszczeniu, najczystsze wyniki można osiągnąć, obsługując system przy wyłączonym oświetleniu pomieszczenia i zasłonach lub rurkach soczewek, aby zminimalizować tło wprowadzane przez różne inne źródła światła (np. monitory komputerowe, lampki kontrolne, diody LED itp.).

Nasza szczególna konfiguracja wykorzystuje detektory fotodiody lawinowej (APD) zliczające pojedyncze fotony oraz skorelowany w czasie sprzęt do zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) do wykrywania ⁵. Pozwala nam to na wykrywanie ekstremalnie słabych sygnałów o stosunkowo niskim poziomie szumów, ale wiele grup uznało, że lampy fotopowielaczy (PMT) ze zmiennym wzmocnieniem są korzystne przy wykonywaniu podobnych pomiarów. Zaletą PMT jest to, że oferują one zmienne wzmocnienie i mają znacznie większy obszar wykrywania, co może uprościć ustawienie detektora. Dodatkowo nasza konfiguracja wykorzystuje stopnie piezoelektryczne do translacji celu w celu uzyskania skanowania wiązki. Zaletą tego rozwiązania jest to, że mamy możliwość powrotu do dowolnego miejsca w obrębie wcześniej zeskanowanego obrazu z dużą dokładnością i wykonania dodatkowych pomiarów, w tym spontanicznych widm Ramana. Inne grupy odniosły sukces, wykorzystując zespoły luster skanujących, a nawet całe konfokalne jednostki skanujące, takie jak system Olympus FluoView, który oferuje znacznie szybsze obrazowanie, ale ma ograniczoną zdolność do precyzyjnego powrotu do dowolnych miejsc na obrazie.

Dostrojenie laserów do rezonansu Ramana jest również krytycznym krokiem, który może wymagać pewnej optymalizacji. Chociaż piki Ramana mogą być znane, maksymalna intensywność pików widmowych uzyskana z DR-CARS i CARS niekoniecznie odpowiada maksimum spontanicznego piku Ramana. Wynika to z wewnętrznej interferencji sygnałów generowanych przez mieszanie czterech fal, co prowadzi do nierezonansowego sygnału tła i CARS, co zniekształca widma CARS w stosunku do spontanicznych widm Ramana. Lokalizację spektralną piku sygnału CARS można obliczyć, ale bardziej praktycznym podejściem jest dostrojenie OPO w kilku, małych krokach spektralnych w poprzek oczekiwanej lokalizacji rezonansu Ramana. Proces ten powinien przynieść wyraźne maksimum. W rzeczywistości, aby uzyskać największą czułość DR-FWM, oba rezonanse muszą być dostrojone do tego maksimum.

Konieczne jest również przedyskutowanie ostatniego potencjalnego problemu związanego z podejściem DR-CARS, tj. sygnał DR-CARS będzie zależał od jednorodnego rozkładu aktywnej cząsteczki wzmacniającej Ramana. W przypadku większości obiektów biologicznych może to być szeroki rezonans OH od wody, który jest obfity i prawie wszechobecny. Woda jest jednak wykluczona z hydrofobowych regionów z komórką, takich jak kropelki lipidów, co prowadzi do zniekształcenia sygnałów uzyskanych podczas wykorzystania rezonansu wody do wzmocnienia modów lipidowych. W naszym przykładzie użyliśmy roztworu deuterowanej glukozy, aby wygenerować łatwo wykrywalny i obfity sygnał dla naszej próbki biologicznej. Podobnie można zastosować wodę deuterowaną lub deuterowane biologiczne, takie jak d-HEPES. W naszym przykładzie kropelki lipidów w robaku C. elegans były na tyle małe, że zawsze zawierały zarówno deuterowany roztwór glukozy, jak i lipidy w skupionej plamce lasera naszego systemu. Nie jest to jednak na ogół prawdą. Szczególnym przykładem mogą być adipocyty, które generują dość duże kropelki lipidów w swojej cytoplazmie. Oznacza to, że każdy eksperyment przeprowadzony techniką DR-CARS wymaga starannego przygotowania i eksperymentów kontrolnych w celu weryfikacji wyników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw 60X do zanurzenia w wodzie	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Mikroskop odwrócony	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Pompa Picotrain Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optyczny oscylator parametryczny	APE	Levante IR
1.5 Szkiełka nakrywkowe	szklane Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Talerze półfalowe	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 lub PBS053
Spektrometr/monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
Kamera CCD	Princeton Instruments/Acton	100B
	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	Jest to połączenie stolika XY i uchwytu obiektywu Z
Lustra dichroiczne	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	Te specyficzne dichroiki nie są krytyczne, wystarczy dowolny zestaw o odpowiedniej charakterystyce transmisji/odbicia.
Lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	Do łączenia różnych wiązek laserowych bliskiej podczerwieni
Płyta TCSPC	PicoQuant	Timeharp 200
Oprogramowanie do obrazowania Symphotime	PicoQuant
Matlab	Mathworks