$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół pozwala na izolację aksoplazmy z minimalizacją zanieczyszczenia tkanki glejowej i naczyniowej. Metoda daje około 70-100 μg całkowitego białka aksoplazmy na jednego 8-10-tygodniowego szczura rasy Wistar.
1. Wypreparuj nerwy kulszowe
- Poddaj eutanazji dwa szczury przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Potwierdź zgon przez badanie palpacyjne z powodu braku bicia serca przed rozpoczęciem sekcji.
- Przetrzyj obszar sekcji 70% etanolem.
- Przetnij skórę, oddziel mięśnie i ostrożnie wyizoluj nerw kulszowy za pomocą nożyczek i kleszczy, nie uszkadzając naczyń krwionośnych. Wypreparuj oba nerwy kulszowe (około 1,5 cm każdy) od każdego zwierzęcia i zbierz wszystkie cztery nerwy w eppendorfie z 500 μl PBS 0,2X + inhibitorami, trzymanymi na lodzie.
- Przenieś segmenty nerwowe do plastikowych naczyń zawierających co najmniej 2 ml inhibitorów proteazy PBS 0,2X +
.
- Usuń epineurium z nerwów za pomocą cienkich kleszczy pod lornetką. Bardzo ostrożnie oddziel pęczki, aż staną się mętne i zaczną unosić się na powierzchni roztworu. Ten krok należy ćwiczyć, dopóki nie będzie można go wykonać szybko i dokładnie (nie zajmuje więcej niż 10 minut na nerw).
2. Inkubacja, mycie i elucja
- Przenieść oddzielone pęczki do świeżej probówki eppendorfa z 500 μl PBS 0,2X zawierającej inhibitory proteazy w celu inkubacji przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Przemyć co najmniej 3 razy 1 ml tego samego buforu, przenosząc pęczki z probówki eppendorfa do probówki eppendorfa i wstrząsając przez 5 minut po przeniesieniu.
- Aby usunąć nadmiar płynu, umieść pęczki w nowej pustej probówce eppendorfa, a następnie przenieś pęczki do nowej probówki eppendorfa z 300 μl PBS 1X zawierającej inhibitor proteazy do inkubacji przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
- Wirować 10 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4°C.
- Weź supernatant i zmierz stężenie białka. To jest twoje przygotowanie aksoplazmy.
3. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Western blot porównujący aksoplazmę wyizolowaną metodą ręcznego wyciskania z próbkami aksoplazmy wyizolowanymi taksomatycznie, jak pokazano w niniejszym protokole. Zwróć uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP, reprezentujące odpowiednio zanieczyszczenie białka krwi i komórek glejowych. Natomiast tubulina aksonalna b3 jest wzbogacona w tym preparacie, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.