Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Podsumowanie

Prezentujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na wycięciu pęczków nerwowych i inkubacji w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny oraz lizy struktur nieaksonalnych, a następnie ekstrakcji pozostałego materiału wzbogaconego w aksony.

Streszczenie

Izolacja czystej cytoplazmy aksonalnej (aksoplazmy) z nerwu obwodowego jest kluczowa dla badań biochemicznych wielu procesów biologicznych. W niniejszym artykule prezentujemy i opisujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na następujących etapach: (1) wypreparowanie pęczków nerwowych i oddzielenie tkanki łącznej; (2) inkubacja krótkich fragmentów pęczków nerwowych w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny i lizy struktur nieaksonalnych; oraz (3) ekstrakcja pozostałego materiału wzbogaconego w aksony. Charakterystyka proteomiczna i biochemiczna otrzymanego preparatu potwierdziła wysoki stopień wzbogacenia w komponenty aksonalne.

Protokół

Niniejszy protokół umożliwia izolację aksoplazmy przy minimalizacji zanieczyszczeń tkanką glejową i naczyniową. Metoda ta pozwala na uzyskanie około 70-100 μg całkowitego białka aksoplazmy z jednego szczura rasy Wistar w wieku 8-10 tygodni.

1. Disekcja nerwów kulszowych

1. Uśmierć dwa szczury poprzez inhalację CO₂, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych. Przed rozpoczęciem sekcji potwierdź zgon poprzez palpację, sprawdzając brak bicia serca.
2. Przetrzyj obszar sekcji 70% etanolem.
3. Nacnij skórę, rozdziel mięśnie i wyizoluj nerw kulszowy, używając ostrożnie nożyczek i pęsety, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Wypreparuj oba nerwy kulszowe (o długości ok. 1,5 cm każdy) z każdego zwierzęcia i zbierz wszystkie cztery nerwy do probówki typu Eppendorf zawierającej 500 μL PBS 0,2X + inhibitory, utrzymywanej w lodzie.
4. Przenieś segmenty nerwów do plastikowych szalek zawierających co najmniej 2 mL PBS 0,2X + inhibitory proteaz.
5. Usuń epineurium z nerwów za pomocą precyzyjnej pęsety pod mikroskopem binokularnym. Bardzo ostrożnie rozdziel pęczki, aż staną się mętne i zaczną unosić się na powierzchni roztworu. Należy ćwiczyć ten etap, aż będzie można go wykonać szybko i precyzyjnie (nie poświęcając więcej niż 10 min na jeden nerw).

2. Inkubacja, przemywanie i elucja

1. Przenieś odseparowane pęczki do nowej probówki Eppendorf zawierającej 500 μL 0,2X PBS z inhibitorami proteaz i inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej.
2. Przemyj co najmniej 3 razy 1 mL tego samego buforu, przenosząc pęczki z jednej probówki Eppendorf do drugiej i wstrząsając przez 5 min po każdym przeniesieniu.
3. Aby usunąć nadmiar płynu, umieść pęczki w nowej pustej probówce Eppendorf, a następnie przenieś je do nowej probówki Eppendorf z 300 μL 1X PBS z inhibitorem proteaz i inkubuj przez 20-30 min w temperaturze pokojowej.
4. Wiruj przez 10 min przy 10 000 x g w temperaturze 4°C.
5. Odbierz nadsącz i zmierz stężenie białka. Otrzymany roztwór stanowi preparat aksoplazmy.

3. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Western blot porównujący aksoplazmę wyizolowaną metodą ręcznego wyciskania z próbkami aksoplazmy wyizolowanymi zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Zwróć uwagę na obniżone poziomy albuminy i GFAP, reprezentujące odpowiednio zanieczyszczenia białkami krwi i komórkami glejowymi. Przeciwnie, w tym preparacie wzbogacona jest tubulina β3, co wskazuje na wysoki poziom białek aksonalnych.

Dyskusja

Analizy biochemiczne i proteomiczne potwierdziły, że procedura ta zmniejsza zanieczyszczenie surowicą i komórkami glejowymi ³ w porównaniu do wcześniej opisanych metod izolacji aksoplazmy poprzez wyciskanie mechaniczne ¹. Wykorzystaliśmy ten protokół izolacji aksoplazmy do zbadania sygnałów wstecznych opartych na dyneinie po uszkodzeniu nerwu kulszowego² i przewidujemy, że będzie on użyteczny w badaniu wielu innych procesów w dorosłym nerwie obwodowym, w tym oddziaływań akson-glej ^4<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Samce szczurów Wistar (w wieku 8-10 tygodni) Roztwory PBS 0,2X oraz PBS 1X zawierające inhibitory proteaz (Roshe), 2 tabletki na 50 ml Probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml Sterylne plastikowe szalki 35 mm Narzędzia do sekcji, w tym: nożyczki i precyzyjna pęseta Stereomikroskop i lampa stołowa
Przeciwciała
Mysie przeciwciało anty-GFAP klon G-A-5 pochodziło z firmy Sigma (G6171). Królicze przeciwciało anty-albumina pochodziło z firmy Cedarlane (CLAG5140). Mysie przeciwciało anty-tubulina β3 oraz królicze przeciwciało anty-gERK pochodziły z firmy Sigma (odpowiednio T2200 i M5670).