Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Podsumowanie

Opisano nowy system in vitro do jednoczesnego obciążania czterech ścięgien w hodowli.

Streszczenie

Urazy ścięgien (np. zapalenie ścięgna nadgarstka, zapalenie nadkłykcia) wynikające z przeciążenia są powszechne w działalności sportowej oraz w środowisku pracy. Większość z nich wiąże się z powtarzalnymi czynnościami rąk wymagającymi użycia dużej siły. Mechanizmy uszkodzeń komórkowych i strukturalnych wywołanych cyklicznym obciążaniem nie są dobrze znane. Celem niniejszego filmu jest prezentacja nowego systemu, który umożliwia jednoczesne obciążanie czterech ścięgien w hodowli tkankowej. W filmie opisano metody sterylnego pobierania tkanek oraz sposób mocowania ścięgien w systemie zaciskowym, który następnie jest zanurzony w pożywce i utrzymywany w temperaturze 37°C. Jeden zacisk pozostaje nieruchomy, podczas gdy drugi jest przemieszczany za pomocą siłownika liniowego. Siła rozciągająca ścięgna jest monitorowana za pomocą ogniwa pomiarowego połączonego szeregowo z ruchomym zaciskiem. Siłowniki są sterowane za pomocą programu LabView. Cztery ścięgna mogą być poddawane powtarzalnemu obciążaniu z różnymi wzorcami obciążenia, częstotliwością powtórzeń, szybkością nakładania obciążenia oraz czasem trwania. Obciążanie może trwać od kilku minut do 48 godzin. Po zakończeniu procesu obciążania ścięgna są usuwane, a fragmenty ich części środkowej pobierane do analiz biochemicznych. System ten pozwala na badanie wpływu wzorców obciążania na ekspresję genów oraz zmiany strukturalne w ścięgnach. W ostateczności pozwala to na badanie mechanizmów urazów spowodowanych przeciążeniem, z zastosowaniem uzyskanych wyników w leczeniu i profilaktyce.

Protokół

1. Uzupełnić  pożywkę niezależną od CO₂ płtką bydlęcą (FBS), l-glutaminą, antybiotykami i kwasem askorbinowym
2. Odmiarzyć 40 ml do probówek wiriówek 50 ml (jedna dla każdego ścięgna)
3. Odmiarzyć 10 ml do probówek wiriówek 15 ml (jedna dla każdego ścięgna)
4. Sterylizować narzędzia chirurgiczne, prześcieradła autoklawowe, pęsety i klucz dynamometryczny w autoklawie
5. Sterylizować zaciski i końcówki mikrometru siłowego poprzez moczenie w 70% etanolu przez noc
6. Pobrać ścięgna z tylnych łap królika. Królik powinien zostać uśpiony nie więcej niż 2 godziny wcześniej.
7. Umieścić ścięgna w probówce wirówkowej 15 ml wypełnionej pożywką
8. Rozłożyć sterylną tkaninę autoklawową w celu utworzenia pola sterylnego
9. Zmierzyć pole przekroju poprzecznego ścięgna
   1. Zamocować końcówki mikrometru w mikrometrze, odpowiednio je wyrównując
   2. Chwycić ścięgno za końce
   3. Umieścić najcieńszą sekcję ścięgna w rowku
   4. Poprosić asystenta o położenie obciążnika 50g
   5. Odczekać 30 sekund i odczytać grubość (CSA = grubość x 1,3)
10. Umieścić ścięgno z powrotem w probówce wirówkowej 15 ml
11. Powtórzyć czynność dla każdego ścięgna przeznaczonego do załadowania
12. Zdjąć siłownik z podstawy
13. Wyciąć dwa paski gazy sterylnej o wymiarach 15mm na 40mm oraz jeden kawałek 3mm na 5mm dla każdego ścięgna
14. Mocno zwinąć każdy pasek i umieścić go pomiędzy rowkami dystalnego zacisku
15. Wyjąć ścięgno z probówki wirówkowej i umieścić na zaciskach: koniec dystalny ścięgna w zacisku dystalnym, a region włóknistochrząstkowy ścięgna w zacisku proksymalnym
16. Położyć kawałek gazy 3x5 na górnej części końca dystalnego ścięgna i zabezpieczyć zacisk
17. Zabezpieczyć zacisk proksymalny, upewniając się, że ścięgno pozostaje wyrównane pomiędzy zaciskami i posiada wystarczający luz, aby nie było pod napięciem podczas dokręcania zacisków. Dokręcić zaciski do 1N-m
18. Umieścić probówkę wirówkową 50ml z pożywką w podstawie
19. Zamontować siłownik w podstawie
20. Powtórzyć czynność dla każdego ścięgna przeznaczonego do załadowania
21. Umieścić podstawę nad kąpielą wodną
22. Protokół obciążania
    1. Wykonać kondycjonowanie wstępne ścięgien
    2. Przyłożyć obciążenie 0,5N, zmierzyć długość ścięgna (jest to długość pomiarowa)
    3. Przyłożyć obciążenie cykliczne
23. Zdjąć siłownik z podstawy
24. Zwolnić ścięgno z zacisków
25. Przetworzyć ścięgno

Dyskusja

Film prezentuje nowy system do jednoczesnego obciążania do czterech żywych ścięgien w hodowli tkankowej. Typowy czas obciążania wynosi od 2 do 48 godzin. Po obciążeniu ścięgna są usuwane i poddawane analizie ekspresji genów. System ten umożliwia badanie wpływu wzorca obciążenia na zmiany w genach związanych z procesami degeneracyjnymi w ścięgnie. Eksperymenty te mogą dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów urazów związanych z powtarzalnym obciążeniem. Pozwalają one również zidentyfikować obciążenia mogące powodować uszkod...