Artykuł metodologiczny

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

66.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2096

⸱

13 kwietnia 2011

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biochemistry, Center for Molecular Neurobiology, The Ohio State University, 2Integrated Biomedical Science Graduate Program, The Ohio State University, 3Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Streszczenie

Od czasu pionierskich prac Ballingera i Reckarda, które wykazały, że przeszczepienie wysepek Langerhansa u gryzoni z cukrzycą może znormalizować poziom glukozy we krwi, transplantacja wysepek jest rozważana jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1 1,2. W ostatnim czasie postępy w transplantacji ludzkich wysepek dodatkowo wzmocniły ten pogląd 1,3. Istnieją jednak dwa główne ograniczenia, które sprawiają, że transplantacja wysepek nie jest powszechną rzeczywistością kliniczną: (a) zapotrzebowanie na dużą liczbę wysepek na jednego pacjenta, co drastycznie redukuje liczbę potencjalnych biorców, oraz (b) konieczność intensywnej immunosupresji, która znacząco wpływa na pediatriczną populację pacjentów ze względu na ich podatność na długoterminowe skutki immunosupresji. Strategie pozwalające przezwyciężyć te ograniczenia mają potencjał zwiększenia użyteczności terapeutycznej transplantacji wysepek.

Przeszczepianie wysepek pod torebkę nerki myszy jest powszechnie akceptowanym modelem do badania różnych strategii mających na celu usprawnienie transplantacji wysepek. Eksperyment ten wymaga wyizolowania wysokiej jakości wysepek oraz ich implantacji u biorców z cukrzycą. Obie procedury obejmują kroki chirurgiczne, które można lepiej zaprezentować za pomocą filmu niż tekstu. W niniejszym materiale dokumentujemy szczegółowe etapy tych procedur zarówno w formie wideo, jak i protokołu pisemnego. Omówiliśmy również krótko różne modele transplantacji: syngeniczne, allogeniczne, syngeniczne autoimmunologiczne oraz allogeniczne autoimmunologiczne.

Protokół

1. Przygotowanie i kalibracja odczynnika Liberase

  1. W niniejszym protokole do trawienia trzustki wykorzystuje się enzym Liberase TL (Roche, Cat# 05 401 020 001).
  2. Należy zakupić jednorazowo 100-200mg i przygotować dużą partię. Liofilizowany proszek należy resuspenderować w sterylnej wodzie klasy HPLC tak, aby stężenie wynosiło około 26 jednostek Wünscha na ml. Powinno to odpowiadać stężeniu około 5 mg/ml. Szczegółowe informacje dotyczące liczby jednostek Wünscha w konkretnej partii znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania. Fiolki należy umieścić na lodzie na 30 minut, delikatnie mieszając je okrężnymi ruchami co kilka minut. Po 30 minutach należy sprawdzić, czy proszek całkowicie się rozpuścił.
  3. Wszystkie rozpuszczone roztwory Liberase należy połączyć i wymieszać, delikatnie mieszając okrężnymi ruchami (NIE stosować wirówki typu vortex ani nie wstrząsać). Należy odmierzyć alikwoty zawierające 24,3 jednostki Wünscha do schłodzonych wcześniej probówek Eppendorph, szybko zamrozić w ciekłym azocie (podobnie jak w przypadku innych enzymów) i przechowywać w temperaturze -80°C. Powinno to być około 0,935ml na probówkę Eppendorph. Każda alikwota jest przeznaczona do jednorazowego użycia (wystarcza na 11 myszy) i nie powinna być przechowywana ani zamrażana ponownie po rozmrożeniu. Zazwyczaj roztwór zapasowy jest stabilny przez co najmniej 6 miesięcy.
  4. Dla każdej nowej partii należy skalibrować optymalny czas inkubacji. Do kalibracji należy użyć zamrożonego roztworu zapasowego, a nie świeżo rozpuszczonego, aby w maksymalnym stopniu odwzorować rzeczywiste warunki eksperymentalne.
    1. Kąpiel wodną, której zamierza się użyć, należy skalibrować dokładnie do 37°C za pomocą termometru rtęciowego. W przyszłych eksperymentach należy używać tego samego inkubatora.
    2. Przed użyciem należy rozmrozić probówkę z Liberase na lodzie i dodać ją (0,935ml) do 21,6ml bezsurowiczego medium RPMI, uzyskując końcowe stężenie robocze 1,08 jednostki Wünscha na ml. Surowica, BAS i EDTA hamują działanie Liberase. Kofaktorami są cynk i wapń. Roztwór należy przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 1,5 godziny. Taka ilość wystarcza dla około 11 myszy (2ml/mysz).
    3. Perfuzję trzustki należy przeprowadzić zgodnie z krokiem 2.3. W ciągu jednej godziny należy przeprowadzić perfuzję u jak największej liczby myszy. Następnie należy wykorzystać jedną lub dwie myszy dla każdego czasu inkubacji i przetestować czasy: 10, 12, 14, 16 oraz 18 minut. Jeśli to możliwe, należy uwzględnić 30-sekundowe odstępy między czasami, ponieważ moment zakończenia trawienia jest bardzo istotny.
    4. Należy dokończyć protokół izolacji wysepek i przeanalizować wydajność oraz jakość wysepek dla każdego punktu czasowego inkubacji. Docelowo wydajność nie powinna znacząco różnić się w okresach szczytowych, ale jakość wysepek w tych odstępach może być różna. W kolejnych eksperymentach należy stosować warunki, które dają największą liczbę wysepek pozostających zdrowymi 48 godzin po izolacji. Wiek myszy wydaje się wpływać na optymalny czas inkubacji, dlatego należy używać myszy w podobnym przedziale wiekowym. Idealnie jest stosować myszy w wieku 8-12 tygodni; jednak nawet myszy w wieku 8-10 miesięcy mogą dostarczyć dobrych wysepek. Do celów kalibracji należy używać młodszych myszy.

2. Procedura chirurgiczna

  1. Przygotuj cały sprzęt i podłoża przed uśmierceniem myszy będących dawcami wysepek.
    1. Przed użyciem wysterylizuj narzędzia w autoklawie lub nad płomieniem. Wszystkie odczynniki i instrumenty (stykające się z próbkami) powinny być sterylne. Izolacja i ręczne wybiery wysepek mogą być wykonywane poza komorą z laminarnym przepływem powietrza bez znacznego zwiększenia ryzyka kontaminacji. Jednak sterylizacja narzędzi mających kontakt z trzustką lub wysepkami jest kluczowa dla uniknięcia zanieczyszczeń. Potrzebne są następujące narzędzia:
      • 1 para nożyczek sekcyjnych do nacięcia brzucha.
      • 2 pary pincet.
      • 1 kleszczyk hemostatyczny do zaklemowania przewodu żółciowego.
      • Siatka druciana o średząciu oczek 0,419 mm.
      • Siatka nylonowa o średnicy oczek 0,1 mm.
    2. Zegnij kilka igieł o rozmiarze 27 G tak, aby w połowie długości igły powstał kąt około 70 stopni. Ścięte ostrze igły powinno być skierowane w stronę wewnętrznej strony zgięcia.
    3. Napełnij butelkę z atomizerem 70% etanolem.
    4. Przygotuj mikroskop sekcyjny z odpowiednim źródłem światła na stole laboratoryjnym lub w komorze.
    5. Wychłodź wirówkę do 4°C. Wirówka musi posiadać rotor z koszyczkami (swing bucket), możliwość wirowania z prędkością 900xG, chłodzenie oraz możliwość wyłączenia hamulca. W przypadku modelu Sorvall RT6000D z rotorem Sorvall H1000B prędkość 900xG odpowiada 2400 RPM. Wolniejsze wirowanie wykonuje się przy 800 RPM.
    6. Umieść następujące odczynniki na lodzie:
      • RPMI (1 litr z 10% surowicy)
      • RPMI (200 ml bez surowicy)
      • Probówki stożkowe 50 ml (1 dla każdej trzustki)
      • Strzykawka 5 ml.
    7. Dostosuj temperaturę Histopaque1077 do temperatury pokojowej.
    8. Rozmroź na lodzie jednorazową aalikwot skalibrowanej Liberazy i rozcieńcz w 22,5 ml RPMI bez surowicy. Surowica, BAS i EDTA hamują działanie Liberazy. Kofaktorami są cynk i wapń. Przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 1,5 godziny. Ilość ta wystarczy dla około 11 myszy (2 ml/mysz).
    9. Rozgrzej kąpiel wodną do 37°C.
    10. Przygotuj tyle myszy, ile jesteś w stanie kaniulować w ciągu 1 godziny (około 10–18 myszy).
  2. Przygotuj mysz do kaniulacji. Najpierw uśmierć mysz poprzez zwichnięcie karku lub uduszenie CO2. Podczas zamierania myszy napełnij strzykawkę 5 ml 2 ml roztworu roboczego Liberazy (1,08 jednostek Wünscha /ml).
    1. Umieść mysz w pozycji na plecach na ręczniku papierowym pod mikroskopem sekcyjnym i spryskaj brzuch 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia brzucha w kształcie litery V, od okolicy łonowej w stronę obu przednich łap. Odchyl skórę nad klatką piersiową, aby odsłonić jamę brzuszną.
    2. Ustaw mysz głową w stronę operatora. Zlokalizuj wejście wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy, zgodnie z oznaczeniem na RYS.1. Można to zrobić bez patrzenia przez obiektyw mikroskopu sekcyjnego.
    3. Zaklemuj otwór w dwunastnicy kleszczykiem hemostatycznym, jak pokazano na RYS.2. Położenie kleszczyka jest krytyczne dla zablokowania przepływu Liberazy do jelit. Jeśli kleszczyk znajduje się zbyt wysoko lub zbyt nisko, Liberaza nie przeperfunduje trzustki. Ustaw kleszczyk tak, aby po zaciśnięciu przebiegał dokładnie wzdłuż granicy trzustki i jelita.
  3. Przed kaniulacją wspólnego przewodu żółciowego może być konieczne przesunięcie wątroby poprzez dociśnięcie jej do przepony, aby odsłonić całą długość wspólnego przewodu żółciowego (RYS.3). Po odsłonięciu przewodu żółciowego użyj zgiętej igły 27 G przymocowanej do strzykawki z Liberazą do kaniulacji. Istnieją dwie techniki kaniulacji przewodu żółciowego.
    1. W pierwszej technice, tzw. metodzie „wolnej ręki”, kleszczyk zaklemowany na dwunastnicy jest odciągany od głowy myszy w stronę ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy został napięty. W przewodzie żółciowym, blisko wątroby, znajduje się miejsce zbiegu, gdzie żółć odpływająca z pęcherzyka żółciowego oraz enzymy z wątroby łączą się przed wejściem do jelit. Wnętrze litery V utworzonej przez ten zbieg zostaje odsłonięte po napięciu przewodu żółciowego i jest to idealne miejsce do rozpoczęcia kaniulacji przewodu (RYS.4). Przy prawidłowym ustawieniu igła prześlizgnie się przez literę V i bezpośrednio skaniuluje dolną część przewodu. Wprowadź igłę na kilka milimetrów do przewodu przed podaniem Liberazy. Optymalne umieszczenie igły jest ważne, aby zapobiec cofaniu się preparatu do wątroby i pęcherzyka żółciowego. Ponadto ważne jest, aby nie wprowadzać igły zbyt głęboko, co mogłoby zablokować przewód śledzionowy. Przewód śledzionowy jest trudną do zauważenia odgałęzieniem wspólnego przewodu żółciowego i odprowadza ogon śledzionowy trzustki, obszar bogaty w wysepki. Jeśli igła przejdzie poza otwór przewodu śledzionowego, perfuzja ogona śledzionowego będzie niepełna, co potencjalnie ograniczy trawienie w tym obszarze. Optymalna wydajność wysepek jest osiągana, gdy głębokość wprowadzenia igły jest wystarczająca, aby Liberaza nie przedostała się do wątroby/pęcherzyka żółciowego, ale nie na tyle duża, by minąć przewód śledzionowy. Pomyślną kaniulację można sprawdzić, podając niewielką ilość Liberazy. Jeśli zobaczysz, że Liberaza wypełnia przewód, podaj pozostałe 2 ml. Jeśli obszar wokół przewodu zacznie się wypełniać, przerwij podawanie, przesuń igłę i spróbuj ponownie.
    2. W drugiej technice, tzw. metodzie „z pomocą pincety”, kleszczyk zaklemowany na dwunastnicy jest odciągany od głowy myszy w stronę ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy został napięty. Następnie, używając zgiętej igły 27 G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przebij powięź poniżej wspólnego przewodu żółciowego blisko wątroby. Użyj igły, aby oddzielić powięź od przewodu (RYS.5). Pozostawiając igłę w miejscu, odłóż kleszczyk i weź pincetę. Użyj jednego ramienia otwartej pincety, aby unieść przewód żółciowy w miejscu, gdzie igła oddzieliła powięź. Rowki w pincie tworzą prowadnicę, którą można wykorzystać do wprowadzenia igły do przewodu. Przyciągając przewód i pincetę w swoją stronę, wsuń igłę do przewodu, używając pincety jako ogranicznika. Sprawdź kaniulację, podając niewielką ilość Liberazy. Jeśli przewód zacznie się wypełniać (RYS.5 Strzałka), podaj pozostałe 2 ml. Jeśli obszar wokół przewodu zacznie się wypełniać, przerwij podawanie, przesuń igłę i spróbuj ponownie.
  4. W miarę jak 2 ml Liberazy wypełnia trzustkę, najpierw zaczyna rozszerzać się obszar w pobliżu dwunastnicy, następnie region nad żołądkiem, a na końcu ogon śledzionowy (RYS.6). Obserwuj, czy trzustka rozszerza się równomiernie (RYS.6). Jeśli jeden obszar zaczyna się rozszerzać, a biała tkanka nie rozszerza się i nie rozprzestrzenia równomiernie, prawdopodobnie wspólny przewód żółciowy nie został skaniulowany, a igła znajduje się wewnątrz torebki trzustki. Wypełnienie torebki Liberazą nie zapewni wysokiej wydajności wysepek, ponieważ powierzchnia wystawiona na działanie enzymu będzie mała. W takim przypadku przerwij perfuzję i przesuń igłę.
  5. Po przeperfundowaniu trzustkę można usunąć z organizmu myszy, oddzielając ją od punktów styku z jelitami, żołądkiem i śledzioną. Zacznij od usunięcia kleszczyka z dwunastnicy. Następnie użyj pincety do uniesienia dwunastnicy i oddziel trzustkę od jelit drugą parą pincet (RYS.7A-B). Robi się to, trzymając drugą parę pincet nieruchomo i wyciągając jelita z jamy brzusznej. Następnie oddziel trzustkę od górnej części żołądka i śledziony (RYS.7C-D). Na koniec wyjmij trzustkę z jamy brzusznej i przetnij pozostałe połączenia z powięzią (RYS.7E-F).
  6. Umieść trzustkę w probówce stożkowej 50 ml i pozostaw ją na lodzie podczas pracy z pozostałymi myszami. Uruchom timer na 1 godzinę. Aby uzyskać maksymalną wydajność wysepek, umieszczaj tylko jedną trzustkę w każdej probówce. Nie zaleca się pozostawiania przeperfundowanych trzustek na lodzie przez więcej niż 1 godzinę, ponieważ Liberaza zacznie degradować tkankę. Po upływie godziny niezwłocznie przejdź do kroku 3.0 dla wszystkich przeperfundowanych trzustek.
  7. Powtórz kroki 2.3 – 2.6 dla pozostałych myszy lub aż do upływu 1 godziny od startu timera w kroku 2.6.

3. Oczyszczanie wysepek z perfundowanych trzustek

  1. Przed oczyszczeniem wysepek z trzustki tkanka musi zostać poddana trawieniu w temperaturze 37°C. Prośki 50ml zawierające perfundowane wysepki należy umieścić w statywie z otwartym dnem pasującym do kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Należy upewnić się, że wszystkie nakrętki są szczelnie zamknięte, a następnie zanurzyć probówki w kąpieli wodnej 37°C na dokładny czas określony dla aktualnej partii Liberazy (patrz krok 1.4). Po zakończeniu inkubacji probówki należy przenieść na lód i dodać do każdej z nich 20ml pożywki RPMI1640 z 10% surowicą. Pożywka zawierająca surowicę zatrzyma proces trawienia Liberazą.
  2. Należy rozdzielić tkankę, energicznie potrząsając probówkami 40 razy w ciągu 10 sekund. Krok ten jest kluczowy dla optymalnego odzysku wysepek. Nawet przy optymalnej perfuzji Liberazą i precyzyjnie skalibrowanym czasie trawienia, wydajność wysepek będzie niska, jeśli tkanka nie zostanie rozbita. Intensywne traktowanie próbek na tym etapie nie wydaje się uszkadzać wysepek mysich i jest niezbędne do uwolnienia ich z klastrów komórek egzokrynnych.
  3. Aby oddzielić wysepki od strawionej trzustki, należy wykonać następujące kroki:
    1. Połączyć strawione trzustki tak, aby w jednej probówce znalazło się około 2,5 trzustki. W ten sposób dziesięć probówek zostanie zredukowane do 4 probówek zawierających po 50ml pożywki.
    2. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800RPM i 4°C.
    3. Odlać supernatant i resuspendować osady w 15-25ml pożywki z 10% FBS, delikatnie mieszając na wortexie (ustawiając intensywność wortexowania na około 50% maksimum) przez kilka sekund.
    4. Przećpą resuspendowaną zawiesinę przez siatkę drucianą 0,419mm do nowej probówki stożkowej 50ml. Pozwala to na oddzielenie niestrawionej tkanki, tłuszczu i limfy. Przepłukać pierwszą probówkę dodatkowymi 10ml pożywki zawierającej 10% FBS i przelać przez siatkę. Powtórzyć ten proces dla pozostałych probówek.
    5. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800RPM i 4°C.
    6. Odlać supernatant i ostrożnie odwrócić probówki do góry dnem na ręczniku papierowym. Należy pilnować, aby wysepki nie wysunęły się z probówek. Przetrzeć wnętrze probówek ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki pożywki, uważając, by nie naruszyć osadu komórkowego. Ustawić probówki w pozycji pionowej.
    7. Resuspendować osady w 5ml histopaque1077 o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na wortexie przez kilka sekund. Przed dodaniem kolejnych 5ml histopaque wzdłuż ścianki probówki należy upewnić się, że zawiesina jest jednorodna. Pozwala to na wypłukanie wysepek ze ścianek probówki.
    8. Nałożyć na histopaque 10ml bezsurowiczej pożywki RPMI, dbając o zachowanie wyraźnej granicy między histopaque a pożywką. Pożywkę należy dodawać powoli, pipetując wzdłuż ścianki probówki w tempie 1ml na 10 sekund. Pożywka powinna znajdować się na górze, a histopaque na dole. Surowica wpływa na gęstość pożywki i nie powinna być stosowana na tym etapie.
    9. Wirować próbki w wirówce zrównoważonej do 20°C przy 2400RPM (900xG) przez 20 minut, przy bardzo powolnym przyspieszaniu i bez hamowania. Ten krok oddziela wysepki od komórek egzokrynnych. Wysepki przemieszczą się do granicy między pożywką bezsurowiczą a Histopaque, natomiast komórki egzokrynne utworzą osad na dnie probówki.
    10. Zebrać wysepki z granicy histopaque/pożywka za pomocą jednorazowej pipety serologicznej 10ml. Wysepki przylegają do szkła, dlatego nie należy używać pipet szklanych, chyba że zostały one zsilikonizowane. Przenieść wysepki do nowej probówki stożkowej 50ml. Na tym etapie można połączyć zawartość kilku probówek. Dopełnić probówki do 50ml pożywką RPMI z surowicą.
    11. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800RPM i 4°C.
    12. Odlać supernatant i resuspendować wysepki w 50ml pożywki RPMI z surowicą, delikatnie mieszając na wortexie.
    13. Wirować probówki przez 90 sekund przy 800RPM i 4°C.
    14. Odlać supernatant i powtórzyć etap płukania jeszcze raz.
    15. Odlać supernatant i przenieść probówki pod dygestorium do hodowli tkankowych. Dodać pen/strep do pożywki RPMI zawierającej 10% FBS do stężenia końcowego 1%, aby przygotować pożywkę do hodowli wysepek. Resuspendować wysepki w 5ml tej pożywki hodowlanej.
    16. Odwrócić nylonowe sito komórkowe 0,1mm i umieścić je na probówce stożkowej 15ml. Powoli przelać resuspendowaną zawiesinę wysepek przez sito. Wysepki zostaną zatrzymane na sicie, natomiast komórki egzokrynne przejdą do probówki stożkowej 15ml. Krok ten znacznie zwiększa czystość wysepek w odniesieniu do zanieczyszczenia komórkami egzokrynnymi na koniec protokołu.
    17. Przepłukać probówkę stożkową 50ml dodatkowymi 6ml pożywki i przelać ją przez sito.
    18. Nanieść 3ml pożywki hodowlanej w postaci dużej kropli na szalkę Petriego o średnicy 10 cm. Odwrócić sito komórkowe stroną górną do dołu, tak aby powierzchnia służąca do wychwytywania wysepek mogła zostać zanurzona w kropli pożywki. Dotknięcie filtra pożywką przeniesie większość wysepek do szalki Petriego, która nie była traktowana do hodowli tkankowych. Użycie nietraktowanej szalki jest kluczowe, aby uniknąć adhezji wysepek i ich rozprzestrzeniania się po powierzchni płytki. Swobodnie pływające wysepki są znacznie łatwiejsze do pobrania w celu podziału na grupy eksperymentalne.
    19. Przelać dodatkowe 5-7ml pożywki hodowlanej przez sito do szalki Petriego, aby wypłukać wszelkie pozostałe wysepki z sita do szalki.
    20. Sprawdzić wydajność i jakość wysepek pod obiektywem 4x w mikroskopie odwróconym. Kręcenie szalką po ciasnej elipsie spowoduje zebranie wysepek w centrum szalki. Jeśli wysepki wyglądają prawidłowo, można je natychmiast pobrać do użytku eksperymentalnego lub równomiernie rozdzielić pomiędzy 4-6 szalek Petriego 10 cm (na 10 myszy). Hodowanie zbyt wielu wysepek w jednej szalce prowadzi do ich nekrozy i degradacji. W przypadku eksperymentów 250-300 wysepek na szalkę 6 cm z 2-3ml pożywki nie wydaje się obciążać wysepek.
    21. W probówce stożkowej 15ml, do której spłynął materiał z nylonowego sita komórkowego 0,1mm, znajdzie się część użytecznych wysepek. Można je odzyskać po trzech lub czterech cyklach sedymentacji grawitacyjnej. Po około 4 minutach sedymentacji odessać całą pożywkę z probówki, pozostawiając około 1ml, a następnie ponownie napełnić ją pożywką hodowlaną po brzegi. Zamknąć probówkę i odwrócić w celu wymieszania. Powtarzanie tego procesu kilka razy usuwa wiele pojedynczych komórek egzokrynnych, które sedymentują powoli, i wzbogaca zawartość o cięższe agregaty komórek endokrynnych (wysepek), które szybko opadają na dno. Po ostatnim odessaniu resuspendować w 7ml pożywki hodowlanej i przenieść do nowej szalki Petriego.

4. Praca z izolowanymi wysepkami

  1. Proces izolacji jest dość stresujący dla wysepek; histopaque jest toksyczny, a etapy mieszania i wirowania wywołują stres ścinający, natomiast usunięcie z krwiobiegu gospodarza oraz hodowla in vitro mogą prowadzić do hipoksji. My oraz inni autorzy wykazaliśmy, że izolacja indukuje śmierć komórek beta 4-5. Efekt tych stresów objawia się odwarstwianiem komórek z peryferii wysepki oraz ciemnieniem i wydalaniem rdzenia centralnego wysepki (martwica centralna). O ile odwarstwianie komórek z peryferii jest dopuszczalne, o tyle martwica centralna wysepki dyskwalifikuje ją z użycia w eksperymentach. Zazwyczaj im większa wysepka, tym większa szansa, że martwica centralna stanie się problemem. Działania mające na celu zmniejszenie stresowej odpowiedzi wysepek po izolacji zwiększą uzysk użytecznych wysepek.
  2. W związku z tym stosujemy wcześniej opisaną technikę inkubowania wysepek w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 22-27°C przez pierwsze 48-72 godziny po izolacji 6-8. Obniżona temperatura tłumi odpowiedź stresową wysepek i łagodzi ich przejście do hodowli in vitro. Jeśli inkubator do hodowli tkanek z temperaturą 22-27°C nie jest dostępny, można uzyskać pożądany zakres temperatur w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek, wyłączając kontrolę ciepła i umieszczając około 20 funtów wkładów chłodzących wyrównanych do -80°C. Skutkuje to około 16-24 godzinami obniżonej temperatury w inkubatorze. Wkłady chłodzące -80°C należy wymieniać w razie potrzeby. Nie zaobserwowaliśmy dodatkowych korzyści z inkubacji w tej niższej temperaturze dłużej niż przez 72 godziny.
  3. Oprócz inkubacji w niskiej temperaturze zalecamy wymianę pożywki 24-48 godzin po izolacji. Czynniki wydzielane przez zestresowane i martwe wysepki kumulują się w pożywce po izolacji i mogą promować dodatkowy stres wysepek. Aby wymienić pożywkę, wykonaj następujące kroki:
    1. Przenieś pożywkę i wysepki z dania Petriego do probówki stożkowej 15ml za pomocą plastikowej pipety.
    2. Przemyj płytkę dodatkowymi 3ml pożywki hodowlanej, aby zebrać pozostałe wysepki.
    3. Dodaj te dodatkowe 3ml do probówki stożkowej 15ml i pozwól wysepkom osiaść grawitacyjnie przez 5min.
    4. Odsuń całą pożywkę z probówki stożkowej 15ml z wyjątkiem 1ml, a następnie resuspenduj wysepki w 4ml pożywki do hodowli wysepek.
    5. Przenieś wysepki i pożywkę na nową płytkę Petriego. Dodaj dodatkowe 3ml pożywki hodowlanej do probówki stożkowej 15ml, aby zebrać wszelkie pozostałe wysepki, i dodaj je do płytki Petriego.
    6. Wymieniaj pożywkę wysepek co trzy do pięciu dni w dalszym ciągu.
  4. Podczas wyboru wysepek do eksperymentu nie zaleca się mieszania wysepek z różnych izolacji. Poziom bazowy cząsteczkowy wysepek jest wpływany przez wiele czynników, w tym przez czas przebywania w hodowli oraz stres izolacyjny, który różni się od preparatu do preparatu. Aby zmniejszyć zmienność, eksperymenty na wysepkach muszą być przeprowadzane na wysepkach izolowanych w tym samym czasie. Jeśli jednak nie jest to możliwe, zdecydowanie sugerujemy połączenie wszystkich wysepek w jedną grupę przed ich wyborem do eksperymentów. Aby wybrać wysepki do eksperymentów, wykonaj następujące kroki:
    1. Jeśli wysepki inkubują się w więcej niż jednej płytce, połącz wszystkie wysepki w jednej płytce, postępując zgodnie z krokami od 4.3.1 do 4.3.5 wymienionymi powyżej. Jeśli zaangażowanych jest wiele płytek z wysepkami, zamiast probówki 15ml należy użyć probówki stożkowej 50ml. Może to zmniejszyć zmienność wywołaną subtelnymi różnicami w warunkach hodowli między płytkami w okresie regeneracji po izolacji.
    2. Podczas sedymentacji grawitacyjnej wysepek przygotuj mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw 4x lub 10x. Przygotuj mikropipetę p200 i pudełko sterylnych końcówek p200.
    3. Przenieś osadzone wysepki na jedną płytkę i przesuń płytkę pod mikroskop. Zakręć płytką, aby zebrać wysepki w centrum. Zdejmij pokrywkę płytki i użyj pipety p200, aby wybrać zdrowe wysepki. Zdrowe wysepki mają gładkie brzegi i brak ciemnych obszarów centralnych (Rycina 8). Staraj się zachować równomierny rozkład wielkości wysepek we wszystkich naczyniach eksperymentalnych, ponieważ wielkość wysepek może zmieniać odpowiedź na leczenie.
    4. Liczba wysepek na grupę eksperymentalną może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentu. Szacujemy, że jedna wysepka zawiera około 1000-2000 komórek i dostarczy 0,3-1μg białka oraz 25ng całkowitego RNA. Dla analiz in vitro typowa grupa eksperymentalna może składać się z 100 do 250 wysepek wysianych w naczyniach 35mm lub 6cm z 1-3ml pożywki. W przypadku transplantacji każda mysz biorca będzie wymagać od 150 do 400 wysepek, w zależności od projektu eksperymentalnego (zobacz krok 5.2.2 oraz Dyskusję dla uzyskania szczegółowych informacji).
    5. Aby zminimalizować różnice wprowadzone przez proces ręcznego wyboru, używamy otworu końcówki pipety p200 jako wskazówki do szacowania wielkości wysepki. Większość wysepek ma średnicę wynoszącą około połowy średnicy otworu i każdą z nich liczymy jako jedną standardową wysepkę. W przypadku wysepek większych lub mniejszych przypisujemy im odpowiednio inną liczbę wysepek. Zbieramy wysepki w partiach po 20-50 i przenosimy je do wyznaczonych naczyń eksperymentalnych. Jeśli pipeta p200 jest ustawiona na objętość 180 mikrolitrów, można zebrać wiele wysepek (zazwyczaj więcej niż 50 wysepek) do jednej końcówki. Zatem, mimo że wysepki są wybierane pojedynczo, można zebrać wiele wysepek w każdej końcówce p200, kontrolując mechanizm wypuszczania pipetmana. Ułatwia to wybór setek, a nawet ponad tysiąca wysepek potrzebnych do eksperymentów. Stosujemy również tę operację partiami, aby pomóc wyrównać rozkład wysepek o podobnej jakości i wielkości.

5. Podtorebkowy przeszczep wysepek trzustkowych do nerki

  1. Indukcja cukrzycy u myszy biorców przeszczepu.
    1. Poddać myszy 4- do 6-godzinnego postu. Optymalni biorcy przeszczepu powinni mieć od 6 do 10 tygodni i ważyć od 20 do 25 gramów w momencie rozpoczęcia postu. Aby przeprowadzić post, należy usunąć pokarm z karmnika i zawsze umieścić myszy w świeżej klatce. Zapewnia to rzetelność postu poprzez odseparowanie myszy od wszelkich pozostałości pokarmu, które mogły wcześniej wypaść do klatki. Należy przyjąć, że cukrzyca rozwinie się u 80% do 90% myszy.
    2. W trzeciej godzinie postu przygotować bufor cytrynianu sodu. Odważyć 0,735 g cytrynianu sodu klasy enzymatycznej (Na Citrate, Mr 294,10 g/mol) i rozpuścić go w 25 ml sterylnej wody dejonizowanej. Dostosować pH do 4,5 za pomocą HCl. Bufor ten należy przygotowywać na świeżo dla każdej serii eksperymentów.
    3. Umieścić 0,05 g streptozotocyny (STZ, Mr 265,2 g/mol) w probówce Eppendorph o pojemności 1,5 ml. Ilość ta jest wystarczająca do indukcji cukrzycy u około 8 myszy. Przygotować odpowiednią liczbę probówek 1,5 ml dla liczby myszy przeznaczonych do iniekcji. STZ jest światłoczuła, dlatego każdą probówkę należy owinąć folią aluminiową.
    4. Po 4 godzinach postu resuspendować jedną probówkę STZ w 1 ml świeżo przygotowanego buforu Na Citrate. Po resuspensji roztwór STZ-Na Citrate traci aktywność w ciągu 15 do 20 minut, dlatego ten krok należy wykonać bezpośrednio przed iniekcją myszy.
    5. Każdej myszy wstrzyknąć dootrzewnowo odpowiednią objętość roztworu STZ-Na Citrate, aby uzyskać dawkę końcową 190 mg/kg masy ciała myszy. Dawka ta może się różnić w zależności od szczepu i wieku myszy; w związku z tym może być konieczna optymalizacja dawki, jeśli częstość występowania cukrzycy jest zbyt niska lub jeśli zbyt wiele myszy ginie w ciągu 3 do 5 dni po iniekcji. Typowe stosowane dawki mieszczą się w przedziale od 150 mg/kg do 250 mg/kg masy ciała myszy.
    6. Po wstrzyknięciu wszystkich myszy zapewnić im dostęp do pokarmu i wody.
    7. Od 2 do 4 dni po iniekcji sprawdzić u myszy występowanie hiperglikemii na czczo (>350 mg/kg). Myszy wykazujące hiperglikemię przez 3 kolejne dni mogą zostać wykorzystane jako biorcy przeszczepu.
  2. Przygotowanie wysepek do transplantacji
    1. Wyizolować wyspki zgodnie z opisem w krokach od 2.0 do 4.0. W razie potrzeby wyspki można izolować w dniu transplantacji lub wcześniej.
    2. Podzielić wyspki na grupy do transplantacji, umieszczając je w sterylnych probówkach Eppendorph 1,5 ml. Probówki przechowywać w lodzie. Liczba wyspek potrzebna do przywrócenia normoglikemii może się różnić w zależności od warunków eksperymentu (szczep dawcy wyspek, waga i szczep biorcy oraz wszelkie dodatkowe zabiegi zastosowane u biorcy) oraz osoby selekcjonującej wyspki. Rozmiar myszy biorcy jest jedną z głównych zmiennych wpływających na minimalną liczbę wyspek, ponieważ większe myszy wymagają ich większej liczby. Spójnie obserwujemy, że 150 do 250 wyspek przywraca normoglikemię jedynie w niewielkim stopniu, podczas gdy 300 wyspek lub więcej ma działanie lecznicze u myszy biorcy C57BL/6 o wadze 18 do 20 g. W tych eksperymentach myszami dawcami wyspek były myszy szczepu C57BL/6 lub Balb/c.
  3. Transplantacja wyspek do podtorebkowej kieszeni nerkowej
    1. Przygotować następujące materiały (wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą być wysterylizowane):

      Tabela 1. Sprzęt do transplantacji
      Strzykawka Hamiltona 25 μl6 cali elastycznej rurki PE 50 przeciętej pod kątem z jednej strony
      Końcówki do nakładania żelu i końcówki do pipety p200Sterylne probówki Eppendorph (1 na biorcę)
      Izofluran i waporyzator do izofluranuStatyw na probówki Eppendorph
      Nożyczki McPhersona-Vannasa (1)Pinceta z giętym ramieniem (2)
      Kleszczyki hemostatyczne (1)Klipser chirurgiczny z klipsami
      Igła 27GSzklarne kapilary wyciągane ogniowo*
      Aplikatory z bawełnianą końcówkąSterylny PBS w probówce stożkowej 50 ml
      SzwyMaszynka elektryczna
      Butelka z atomizerem 70% etanoluDługopis
      BetadynaPrzezroczysta sterylna stylażka


      * Uwaga: Przygotowując te sondy, należy starać się nadać im łuk odpowiadający kątowi nachylenia nerki myszy. Ponadto należy upewnić się, że koniec sondy jest odpowiednio wypolerowany ogniowo, aby nie było ostrych krawędzi.
    2. Zważyć i oznakować wszystkie cukrzycowe myszy biorcy. Przed transplantacją przypisać każdą mysz do grupy eksperymentalnej w taki sposób, aby każda grupa miała zbliżoną masę ciała.
    3. Przygotować pole operacyjne w dygestorium z otwartym frontem, wyposażonym w wylot gazu z waporyzatora do izofluranu.
    4. Zznieczulić mysz biorcę izofluranem, a następnie ogolić jej bok maszynką elektryczną. Golić mysz poza obszarem, w którym będą wykonywane przeszczepy.
    5. Ponownie wprowadzić mysz w stan znieczulenia i ułożyć ją prostopadle i bezpośrednio nad trzoniem szklanego pręta, tak aby ogolony bok był skierowany do góry. Spryskać bok 70% etanolem. Miejsce operacyjne należy przygotować poprzez naprzemienne przemywanie betadyną i alkoholem, powtórzone trzy razy. Przykryć mysz przezroczystą sterylną stylażką, pozostawiając dostęp do ogolonego boku.
    6. Przygotować wyspki do transplantacji podczas znieczulania myszy, wykonując następujące kroki:
      1. Włożyć sterylną końcówkę do nakładania żelu do otworu probówki Eppendorph 1,5 ml tak, aby w wąskim końcu końcówki powstało łagodne zgięcie w kształcie litery U. Otwór końcówki powinien być skierowany bezpośrednio w górę, na zewnątrz probówki Eppendorph. Nie wolno doprowadzić do załamania końcówki w żadnym miejscu, ponieważ spowoduje to ścinanie wyspek i zmniejszenie ich liczby w transplantacie.
      2. Ostrożnie wyjąć z lodu probówkę z wyspkami przygotowaną w kroku 5.2.2. Wszystkie wyspki powinny osiąść na dnie probówki. Używając pipety p200, ostrożnie zebrać wyspki w minimalnej objętości z dna probówki. Przenieść te wyspki przez szeroki otwór końcówki do nakładania żelu przygotowanej w kroku 5.3.6.1. Wyspki powinny osiąść w wąskiej części końcówki do nakładania żelu.
      3. Po osadzeniu się wyspek usunąć z końcówki do nakładania żelu jak najwięcej medium. Można to zrobić za pomocą nowej końcówki do nakładania żelu zamocowanej do pipety p200, aspirując medium przez szeroki otwór końcówki zawierającej wyspki.
      4. Przenieść osadzone wyspki do elastycznej rurki PE 50 (długość ok. 15 cm). Można to zrobić, przymocowując najpierw nieścięty koniec rurki do wąskiego otworu końcówki zawierającej wyspki, a następnie mocując końcówkę do pipety p200. Wyspki można następnie przepchnąć przez 60% długości rurki.
      5. Przenieść rurkę PE 50 z wyspkami do strzykawki Hamiltona 25 μl. Przed przeniesieniem rurki upewnić się, że tłok strzykawki został wycofany. Połączyć nieścięty koniec rurki PE 50 z igłą strzykawki.
      6. Docisnąć tłok strzykawki, aż wyspki znajdą się w odległości około 0,5 cm od ściętego otworu.
      7. Odstawić strzykawkę, aby wyspki mogły osiąść w jedną masę w pobliżu ściętego otworu rurki podczas przygotowania nerki do przyjęcia wyspek.
    7. Za pomocą palców zlokalizować nerkę przez skórę myszy pod narkozą. Trzon długopisu powinien znajdować się bezpośrednio pod obszarem, w którym znajduje się nerka, i być ułożony prostopadle do rdzenia kręgowego.
    8. Po zlokalizowaniu nerki użyć nożyczek McPhersona-Vannasa, aby wykonać 2-centymetrowe nacięcie przez skórę bezpośrednio nad nią, w kierunku prostopadłym do rdzenia kręgowego. Nacięcie to odsłoni ścianę otrzewnej.
    9. Za pomocą nożyczek McPhersona-Vannasa wykonać 1-centymetrowe nacięcie przez ścianę otrzewnej w tym samym kierunku, w którym wykonano nacięcie skóry. Ważne jest, aby otwór powstały w wyniku tego nacięcia był mniejszy niż odsłonięta nerka.
    10. Używając trzonia szklanego pręta jako podparcia, wypchnąć nerkę przez otwór w otrzewnej, naciskając na sąsiednią powierzchnię. Jeśli otwór jest nieco mniejszy od nerki, zostanie ona przecisnięta przez otwór i spocznie stabilnie na powierzchni myszy bez żadnych dodatkowych manipulacji ani kontaktu. Takie ułożenie jest optymalne dla kolejnych kroków transplantacji. Jeśli otwór jest zbyt duży, nerka wpadnie z powrotem do jamy otrzewnej, co utrudni wykonanie kolejnych etapów.
    11. Zwilżyć powierzchnię odsłoniętej nerki lodowatym sterylnym PBS za pomocą nasączonego aplikatora z bawełnianą końcówką. Powtarzać ten krok co kilka minut lub w razie potrzeby, aby zapobiec wyschnięciu torebki nerkowej.
    12. Używając igły 27G, wykonać nacięcie o długości 0,2 cm przez torebkę nerkową na przedniej powierzchni nerki, przesuwając się od lewej strony bocznej w stronę prawej strony bocznej.
    13. Używając szklanej kapilary wyciąganej ogniowo, utworzyć kieszeń między torebką nerkową a miąższem nerki. Należy to zrobić, wprowadzając sondę przez nacięcie wykonane w kroku 5.3.12 i przesuwając ją w kierunku tylnym wzdłuż powierzchni grzbietowo-bocznej nerki. Idealna sonda powinna mieć zgięcie odpowiadające naturalnemu łukowi tej powierzchni nerki. Pozwoli to sondzie dotrzeć do najbardziej tylnego końca nerki bez rozrywania dużego otworu przedniego. Ważne jest, aby kieszeń ta była jak najdłuższa i jak najwęższa. Krótkie i szerokie kieszenie nie są idealne, ponieważ umożliwiają ucieczkę wyspek z torebki. Długie i wąskie kieszenie pozwalają na osadzenie wyspek w stronę tylnego końca nerki przy minimalnej stracie z kieszeni podtorebkowej.
    14. Pobrać strzykawkę Hamiltona 25 μl przygotowaną w kroku 5.3.6 i przesunąć wyspki do samej krawędzi ściętego otworu elastycznej rurki.
    15. Wprowadzić ścięty koniec elastycznej rurki do kieszeni podtorebkowej przygotowanej w kroku 5.3.13. Ścięty koniec powinien być skierowany do góry, tak aby długa krawędź stykała się z miąższem nerki. Przesunąć rurkę do najbardziej tylnego końca torebki.
    16. Powoli przenieść wyspki z rurki PE 50 do kieszeni podtorebkowej, dociskając tłok strzykawki. W miarę wypełniania kieszeni przez wyspki, powoli wycofywać elastyczną rurkę, robiąc więcej miejsca na osadzanie wyspek. Upewnić się, że wszystkie wyspki zostały przeniesione z rurki do kieszeni. Nie wypełniać kieszeni powietrzem ani nadmierną ilością płynu.
    17. Po usunięciu rurki PE 50 z kieszeni, użyć szklanej kapilary wyciąganej ogniowo, aby delikatnie upchnąć wyspki w proksymalnym końcu kieszeni. Należy to zrobić, przesuwając szklaną sondę wzdłuż zewnętrznej powierzchni nerki w kierunku od przedniego do tylnego. Należy uważać, aby nie upchnąć wyspek zbyt ciasno, ponieważ tylny koniec kieszeni podtorebkowej może pęknąć i uwolnić wyspki. Krok ten minimalizuje utratę wyspek z przedniego otworu kieszeni podczas umieszczania nerki z powrotem w jamie otrzewnej.
    18. Używając pincety z giętym ramieniem, unieść wyściółkę otrzewnej sąsiadującą z otworem wykonanym dla nerki, a następnie za pomocą nasączonego PBS aplikatora z bawełnianą końcówką delikatnie wprowadzić nerkę z powrotem do jamy otrzewnej.
    19. Zamknąć ranę myszy, nakładając szwy na ścianę otrzewnej i klipsery chirurgiczne na warstwę skóry.
    20. Wrócić mysz do klatki i powtórzyć kroki od 5.3.4 do 5.3.19 dla pozostałych myszy. Myszy należy utrzymywać w cieple za pomocą podkładki grzewczej pod klatką lub lampy grzewczej z osłoniętymi oczami, aż do pełnego wybudzenia z narkozy. Zwierzętom należy podać paracetamol w wodzie (6 mg/mL).
    21. Sprawdzić poziom glukozy we krwi na czczo 24 godziny później. Wszystkie myszy powinny wykazywać normoglikemię (glukoza we krwi <200 mg/dl) w 1. dniu po operacji (POD 1).

6. Reprezentatywne wyniki

W niniejszym protokole opisano dwie główne procedury: (1) izolację wysepek oraz (2) transplantację wysepek pod torebkę nerki. W procedurze izolacji wysepek uzyskiwana liczba wysepek wynosi zazwyczaj od 100 do 150 na mysz, w zależności od wieku i szczepu. Czystość tych wysepek w odniesieniu do ich oddzielenia od komórek egzokrynnych trzustki może znacznie różnić się pomiędzy poszczególnymi preparatami. Jednak zastosowanie Histopaque1077 w temperaturze pokojowej w kroku 3.3.7 oraz filtra nylonowego 0,1 mm w kroku 3.3.17 zazwyczaj pozwala na uzyskanie czystości wysepek przekraczającej 99%. Czystość ta jest osiągana przed jakimkolwiek dodatkowym ręcznym sortowaniem wysepek. Reprezentatywne obrazy wysepek po izolacji przedstawiono na rysunku 8D. Jak widać na tych obrazach, wysepki bezpośrednio po izolacji mają zazwyczaj chropowaty brzeg obwodowy. Jednak z czasem w kulturze zdrowe wysepki nabierają i utrzymują gładki brzeg (rysunek 8D). W niektórych wysepkach rozwija się centralny obszar nekrotyczny, widoczny jako ciemna strefa w jądrze. To nekrotyczne centrum jest często usuwane z wysepki, co zarejestrowano w obrazowaniu time-lapse (Wideo uzupełniające 1). Pozostałe wysepki wydają się puste w środku (dane nie pokazane) i prawdopodobnie nie są funkcjonalne. Dlatego podczas procesu ręcznego sortowania wykluczamy wysepki z ciemnym centrum. Co istotne, stwierdzono, że inkubacja w niskiej temperaturze po procedurze izolacji (krok 4.2) może drastycznie zmniejszyć liczbę wysepek, w których z czasem w kulturze rozwinie się nekroza centralna.

W procedurze transplantacji wysepek kluczowe są dwa etapy: chemiczna indukcja cukrzycy oraz wprowadzenie wysepek do obszaru podtorebkowy nerki. W przypadku indukcji cukrzycy celem jest uzyskanie hiperglikemii u ponad 90% myszy po wstrzyknięciu STZ. Myszy te przeżyją bez transplantacji przez kilka tygodni. Optymalna dawka STZ niezbędna do osiągnięcia tego celu różni się w zależności od szczepu i wieku myszy i powinna zostać ustalona drogą eksperymentalną. Stwierdziliśmy, że różnica tak niewielka jak 20mg/kg masy ciała może mieć duże znaczenie. W związku z tym należy przeprowadzić miareczkowanie w wąskich odstępach. W przypadku transplantacji wysepek kluczowym aspektem jest dobór modeli, które mogą obejmować cztery konteksty immunologiczne: syngeneiczny, allogeniczny, syngeneiczny autoimmunologiczny oraz allogeniczny autoimmunologiczny. W modelu syngeneicznym szczep dawcy jest taki sam jak szczep biorcy. W związku z tym wysepki nie wywołują adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej u biorców. Pozwala to badaczom na analizę kwestii związanych z „pierwotnym brakiem funkcji” (primary non-function), terminem odnoszącym się do dysfunkcji i utraty wysepek z przyczyn innych niż specyficzne odrzucenie immunologiczne przez biorców. Przypuszcza się, że pierwotny brak funkcji jest główną przyczyną niepowodzenia transplantacji wysepek we wczesnym stadium oraz powodem konieczności zastosowania dużej liczby wysepek (≥2 trzustek/pacjent) w celu osiągnięcia euglikemii. Jest to zatem krytyczna kwestia w transplantacji wysepek. W tym modelu należy zastosować marginalną masę wysepek, która nie przywraca w pełni normoglikemii, a poziom glukozy we krwi u myszy należy badać we wczesnej fazie po transplantacji, zazwyczaj między POD 1 a POD 7. W naszym doświadczeniu marginalna masa wysepek u biorcy o wadze 20 gramów szczepu C57BL/6 wynosi zazwyczaj od 150 do 250 wysepek o średniej wielkości. Korzystając z modelu syngeneicznego, można użyć wysepek zmodyfikowanych genetycznie lub farmakologicznie, aby sprawdzić, czy określona modulacja wpływa na skuteczność terapeutyczną wysepek we wczesnym stadium po transplantacji.

W modelach allogenicznych i autoimmunologicznych przeszczepy wysepek są narażone na specyficzny atak immunologiczny adaptacyjnej odpowiedzi odpornościowej gospodarza, w którą zaangażowane są limfocyty T, limfocyty B oraz inne komórki odpornościowe. Odpowiedź adaptacyjna jest opóźnioną reakcją immunologiczną; aby ocenić tę odpowiedź, konieczne jest przeszczepienie nasycającej liczby wysepek, która skutecznie przywróci normoglikemię we wczesnej fazie po transplantacji, aby zminimalizować wpływ pierwotnego braku funkcji. Można następnie monitorować czas do momentu odrzucenia wysepek, co objawia się utratą normoglikemii, aby określić wpływ jakiejkolwiek modyfikacji wysepek na odrzucenie przeszczepu. W naszym doświadczeniu na mysz o masie 20 g wymagane jest więcej niż 300 wysepek, a czas odrzucenia przeszczepu allogenicznego z użyciem dawców Balb/c (H-2d) i biorców C57BL/6 (H-2b) wynosi od 15 do 21 dni.

Wlot do dwunastnicy i wspólny przewód żółciowy na obrazie z mikroskopu anatomicznego, badanie układu trawiennego.
Rysunek 1. Lokalizacja ujścia wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy. Endogenne enzymy trawienne odpływające z wątroby, trzustki i pęcherzyka żółciowego przechodzą przez wspólny przewód żółciowy przed wejściem do przewodu pokarmowego w obrębie dwunastnicy. Kierunek przepływu w tym przewodzie może zostać odwrócony, jeśli do układu zostanie przyłożone ciśnienie poprzez dodanie zewnętrznego płynu. Spowoduje to wypełnienie i rozszerzenie trzustki.

Technika zaciskania tkanek miękkich za pomocą kleszczyków chirurgicznych; schemat z bliska do celów edukacyjnych.
Rysunek 2. Zaciskanie ujścia dwunastniczego wspólnego przewodu żółciowego. W celu wypełnienia trzustki preparatem Liberase konieczne jest zablokowanie ujścia dwunastniczego wspólnego przewodu żółciowego. Jeśli nie zostanie to wykonane prawidłowo, Liberase wypełni jelita zamiast trzustki.

Anatomia wątroby, zaznaczony przewód żółciowy na obrazie endoskopowym; identyfikacja organów wewnętrznych, badanie medyczne.
Rycina 3. Przesunięcie wątroby w stronę przepony umożliwia wizualizację proksymalnego odcinka wspólnego przewodu żółciowego. Kanulację wspólnego przewodu żółciowego udaje się przeprowadzić najskuteczniej, jeśli próba zostanie podjęta w pobliżu jego końca proksymalnego (w miejscu V-kształtnego złączenia opisanego w punkcie 2.3.1).

Technika mikrochirurgiczna; szczegółowa manipulacja tkanką pokazana w widoku powiększonym z narzędziami chirurgicznymi.
Rycina 4. Kanulacja wspólnego przewodu żółciowego metodą „wolnej ręki”. Zbieg wspólnego przewodu żółciowego staje się widoczny, gdy zacisk hemostatyczny założony na dwunastnicę zostanie przesunięty w stronę tylnego końca myszy. Kanulację przewodu można przeprowadzić, umieszczając igłę 27 G w miejscu tego zbiegu i wprowadzając ją przez niego.

Kanulacja przewodów ślinowych; kroki proceduralne; technika chirurgiczna; metoda insercji endoskopowej.
Rysunek 5. Kanulacja wspólnego przewodu żółciowego metodą „wspomagania kleszczykami”. Jak wspomniano w tekście, tkanka powięziowa otaczająca przewód czasami utrudnia kanulację. (A) W takich przypadkach pomocne jest oczyszczenie warstwy powięziowej za pomocą igły 27 G. (B) Następnie przewód można wyraźnie zwizualizować i podtrzymać za pomocą zakrzywionych kleszczyków. (C) Wykorzystując kleszczyki jako punkt podparcia, igłę 27 G można wprowadzić do przewodu w celu podania Liberase.

Ilustracja procedury chirurgicznej przedstawiająca anatomię żołądka z etykietami do celów edukacyjnych.
Rycina 6. Równomierne rozszerzenie trzustki świadczy o optymalnym umiejscowieniu igły. Ze względu na półprzezroczystość przewodu i otaczających go tkanek powięziowych, w niektórych przypadkach może sprawiać wrażenie, że przewód został zakanulowany, podczas gdy w rzeczywistości tak nie jest. Jeśli tak się stanie i igła przebije torebkę trzustki, obszar dwunastniczy trzustki zacznie pęcznieć po podaniu Liberase. Jednakże cała trzustka nie zostanie przepływowana, co doprowadzi do niskiej wydajności uzyskania wysepek. Aby uniknąć tego problemu, należy obserwować równomierne rozszerzenie trzustki, szukając konkretnie oznak wnikania enzymu do obszaru trzustki przylegającego do przedniej części żołądka.

Kroki procedury chirurgicznej; dyssekcja, obchodzenie się z tkanką; anatomia, edukacja medyczna.
Rysunek 7. Usuwanie perfundowanej trzustki. Aby usunąć trzustkę z myszy, należy przerwać kilka punktów styku z trzewiami. (A-B) Oddzielenie trzustki od jelit. (C) Oddzielenie trzustki od żołądka. (D) Oddzielenie trzustki od jelit. (E-F) Przecięcie wszelkich pozostałych połączeń z jamą otrzewną.

Mikroskopia wysepek trzustkowych, zanieczyszczenie komórkami egzokrynnymi, agregacja komórkowa i nekroza centralna.
Rysunek 8. Reprezentatywne obrazy wysepek. Względną czystość i jakość wysepek można ocenić mikroskopowo po zakończeniu procedury izolacji. (A) Chociaż celem jest oczyszczenie wysepek z trzustki, okazjonalnie obecne są komórki egzokrynne i złuszczone fragmenty tkanki. (B) Stres związany z izolacją wysepek może indukować śmierć komórek, która objawia się ciemnymi obszarami centralnymi wysepek oraz odrywaniem się komórek z peryferii wysepki. (C) Podczas wybierania wysepek do eksperymentu należy unikać wybierania zanieczyszczających komórek egzokrynnych. (D) Wysepki zmieniają swój wygląd wraz z czasem hodowli. W miarę regeneracji po izolacji wysepki zyskują gładką powierzchnię peryferyjną. Okazyjonalnie w większych wysepkach widoczny jest ciemny obszar centralny. Komórki te wykazują pozytywne barwienie na śmierć komórkową.

Wideo uzupełniające 1. Mikroskopia poklatkowa wyizolowanych wysepek. Na tym 16-godzinnym nagraniu poklatkowym widać tworzenie się w wysepkach centrów nekrotycznych, które zostają ostatecznie wydalone. Prosimy kliknąć tutaj, aby obejrzeć wideo.

Dyskusja

W powyższych sekcjach opisaliśmy szczegółowe etapy izolacji i transplantacji wysepek trzustkowych myszy. Poniżej krótko przedstawiamy kroki, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych procedur.

1. Izolacja wysepek

Kluczowe etapy obejmują określenie optymalnego czasu trawienia enzymatycznego (1.4), umieszczenie zacisku hemostatycznego nad otworem dwunastniczym wspólnego przewodu żółciowego (2.2.3), kaniulację wspólnego przewodu żółciowego (2.3), energiczne wstrząsanie trzustki po trawieniu w 37°C (3.2) oraz usunięcie zanieczyszczeń z komórek egzokrynnych (3.3.7 i 3.3.16). Etapy te mają ogromny wpływ na jakość, wydajność i czystość wyizolowanych wysepek. Prawdopodobnie najtrudniejszym technicznie krokiem jest kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego. U wielu myszy wspólny przewód żółciowy może być trudny do zwizualizowania ze względu na otaczającą go powięź. W związku z tym często zdarza się, że próby kaniulacji wspólnego przewodu żółciowego kończą się jedynie przebiciem tkanki powięziowej. W takich przypadkach Liberase zaczyna wypełniać otaczającą tkankę łączną i nie perfunduje trzustki. Jeśli zostanie to zaobserwowane, należy zatrzymać przepływ Liberase i ponownie ustawić igłę tak, aby przebiła ona światło przewodu żółciowego. Dzięki praktyce możliwe jest szybkie zidentyfikowanie optymalnej pozycji igły i przeprowadzenie kaniulacji bez uszkodzenia kruchego przewodu.

2. Transplantacja wysepek

Kluczowymi etapami są indukcja cukrzycy za pomocą STZ (5.1) oraz efektywne wprowadzenie wysepek do kieszonki podtorebkowej (5.3.14-5.3.16). STZ jest naturalnie występującym analogiem glukozy, który wykazuje selektywną toksyczność wobec wydzielających insulinę komórek β wysepek 9. Wyselekcjonowana toksyczność ta występuje jednak w stosunkowo wąskim zakresie stężeń. Świadczy o tym fakt, że wysokie dawki STZ mogą prowadzić do szybkiej (2-3 dni) śmiertelności przy braku hiperglikemii. Dlatego też, przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów na szeroką skalę, należy starannie określić optymalną dawkę STZ dla konkretnej szczepu i wieku używanych myszy. Fizyczne wprowadzenie wysepek do kieszonki podtorebkowej jest również kluczowym krokiem. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, niezbędne jest zminimalizowanie utraty wysepek podczas ich aplikacji. Może ona nastąpić w przypadku wystąpienia defektów lub pęknięć w torebce nerkowej pokrywającej kieszonkę albo gdy wstrzyknięta objętość jest zbyt duża. Uszkodzeń torebki można uniknąć poprzez delikatne i ostrożne manipulowanie oraz użycie gładkiej szklanej sondy do przygotowania kieszonki podtorebkowej. Dodatkowo, objętość wstrzykiwanego roztworu można zminimalizować poprzez dokładne usunięcie nadmiaru cieczy w kroku 5.3.6.3. Jeśli supernatant zostanie usunięty do poziomu osadzonych wysepek, w kieszonce podtorebkowej zazwyczaj znajduje się wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić od 400 do 500 wysepek. Jednakże, jeśli objętość iniekcji jest zbyt duża, istnieje większe prawdopodobieństwo wycieku wysepek z kieszonki podczas procesu transplantacji, co obniża powtarzalność eksperymentu.

W ramach niniejszego protokołu możliwe jest zmodyfikowanie niektórych etapów przy jednoczesnym uzyskaniu satysfakcjonujących wyników. Obejmują one następujące modyfikacje: (a) zastosowanie innego enzymu do trawienia trzustki, (b) inną metodę dostarczania enzymu do trzustki, (c) zastosowanie ciągłego gradientu Ficoll-sód-diatrizoat (FSD) zamiast pojedynczego stopnia gęstości Histopaque 1077 oraz (d) transplantację wysepek w miejsca inne niż podtorebka nerki.

  1. W niniejszym protokole Liberaza jest wykorzystywana do osłabienia kontaktów międzykomórkowych w trzustce. Liberaza to w zasadzie mieszanina wysoce oczyszczonych kolagenaz, które okazały się użyteczne w uwalnianiu wysepek z trzustki. Jednakże mniej oczyszczone kolagenazy są w stanie osiągnąć podobny rezultat. Zatem możliwe jest stosowanie różnych dostępnych komercyjnie preparatów enzymatycznych do trawienia trzustki, o ile warunki trawienia zostaną zoptymalizowane w celu uzyskania wysokiej jakości, wydajności i czystości wysepek.
  2. Możliwe jest również trawienie trzustki bez perfuzji enzymu przez przewody. Podawanie Liberazy przez wspólny przewód żółciowy pozwala na maksymalne wystawienie powierzchni trzustki na działanie enzymu. Skutkuje to bardziej równomiernym trawieniem trzustki i większym uwalnianiem nienaruszonych wysepek. Można jednak zastosować inne kroki w celu zwiększenia powierzchni kontaktu trzustki z enzymem. Na przykład, do izolacji wysepek można zastosować rozdrobnienie trzustki przed inkubacją w Liberazie lub bezpośrednie wstrzyknięcie Liberazy przez torebkę trzustki. Niemniej jednak żadna inna metoda podawania Liberazy nie jest tak skuteczna, jak perfuzja przez wspólny przewód żółciowy. Dlatego rozdrobnienie lub bezpośrednie wstrzyknięcie należy zarezerwować jako ostateczność, jeśli wspólny przewód żółciowy jest uszkodzony i nie nadaje się do perfuzji.
  3. Alternatywna metoda oddzielania wysepek od komórek egzokrynnych obejmuje zastosowanie gradientu FSD zamiast Histopaque1077 10. Efektywne oddzielenie wysepek od komórek egzokrynnych w tym protokole wynika częściowo z różnicy gęstości między tymi dwoma typami komórek. Histopaque1077 ma gęstość 1,0771 g/ml w temperaturze 25°C. W tej temperaturze Histopaque jest gęstszy od wysepek, ale mniej gęsty od komórek egzokrynnych. W rezultacie, pod wpływem wirowania, Histopaque1077 powoduje osadzanie się komórek egzokrynnych w formie pelletu, podczas gdy wysepki unoszą się na powierzchnię. W zasadzie w tym kroku można zastosować każdą inną substancję o gęstości umożliwiającej oddzielenie wysepek od komórek egzokrynnych, a gradient FSD jest jedną z takich substancji.
  4. W odniesieniu do miejsca transplantacji wysepek, torebka nerkowa zastosowana w tym protokole jest jednym z niewielu możliwych miejsc. Choć przestrzeń podtorebkowa nerki jest najczęściej raportowanym miejscem transplantacji u myszy, stwierdzono, że efektywne są również inne miejsca, w tym żyła wrotna wątroby, przestrzeń podsiatkówkowa, jądra, poduszka tłuszczowa najądrza, śledziona, a nawet trzustka 11-14. Każde z tych miejsc ma swoje zalety i wyzwania. Zatem wybór miejsca transplantacji wysepek powinien być podyktowany stawianymi pytaniami badawczymi oraz specyficznymi okolicznościami eksperymentów.

Uważa się, że strategie pozwalające przezwyciężyć ograniczenia związane z transplantacją wysepek trzustkowych znacząco zwiększą ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym zastosowanie modelu mysiego, szczegółowo opisanego w niniejszym protokole, stanowi atrakcyjną metodę identyfikacji takich strategii.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca jest wspierana przez grant RO1 DK064938 (przyznany T.H.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640OdczynnikGIBCO, by Life Technologies31800-022
Liberase TLOdczynnikRoche Group05401020001
Płodowa surowica bydlęcaOdczynnikGIBCO, by Life Technologies10437-028
Histopaque 1077OdczynnikSigma-Aldrich10771
Penicylina StreptomycynaOdczynnikGIBCO, by Life Technologies15140
Cytrynian soduOdczynnikSigma-AldrichS4641
StreptozotocynaOdczynnikSigma-AldrichS-0130
HClOdczynnikFisher ScientificA144-212
IzofluranOdczynnikVedco, Inc.ISOSOL
Szklane kapilarySprzętFisher Scientific22362574
Strzykawka insulinowaSprzętBD Biosciences329461
Igła do strzykawki 27 GSprzętBD Biosciences305109
Strzykawka Hamilton #1702SprzętFisher Scientific14813133
Szalki Petriego 10 cmSprzętFisher Scientific0875712
Szalki Petriego 6 cmSprzętFisher Scientific07770212
Nici chirurgiczne 6-0SprzętEthicon Inc.8726H
Elastyczny przewód PE 50SprzętFisher ScientificNC9083963
Strzykawka jednorazowa 5 mlSprzętBD Biosciences309603
Probówka stożkowa 50 mlSprzętBD Biosciences352098
Probówka stożkowa 15 mlSprzętBD Biosciences352097
Sito nylonowe 0,1 mmSprzętFisher Scientific22363549
Sito druciane 0,419 mmSprzętNewark Wire Cloth Company0300241
Inkubator z łaźnią wodnąSprzętFisher Scientific15-462-5
Mikroskop sekcyjnySprzętCarl Zeiss, Inc.Stemi SV6
Mikroskop odwróconySprzętNikon InstrumentsTMS
Inkubator do hodowli tkankowychSprzętNapco6300
Nożyczki sekcyjneSprzętKent ScientificINS14393
Nożyczki McPherson-VannasSprzętKent ScientificINS500260
Pinceta zakrzywionaSprzętKent ScientificINS15915
Kleszczyki hemostatyczneSprzętKent ScientificINS 500451
Nebulizator do izofluranuSprzętSmiths MedicalISOTech 4 OHMEDA
Wirówka z koszem wahadłowymSprzętDupont – SorvallRT6000D
Rotor wahadłowySprzętDupont – SorvallH1000B
pH-metrSprzętMettler Toledo09313509
końcówki do nakładania żeluSprzętFisher Scientific05408151
Końcówki p200SprzętUSA Scientific, Inc.111-0730

Bibliografia

  1. Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Islet transplantation as a treatment for diabetes. J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).
  3. Gangemi, A. Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol. Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).
  4. Zmuda, E. Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model. Diabetologia. , Forthcoming (2010).
  5. Bottino, R. Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment. Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).
  6. Markmann, J. F. The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression. Transplantation. 49, 272-277 (1990).
  7. Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts. Diabetes. 35, 83-88 (1986).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).
  9. Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells. Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).
  10. Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets. Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).
  11. Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts. Transplantation. 43, 747-749 (1987).
  12. Nasr, I. W. Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells. J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).
  13. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).
  14. Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats. Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wysepki mysieprzestrze podtorebkowakaniulacja wsp lnego przewodu ciowegoperfuzja trzustkigradient Histopaquefiltracja przez sitko kom rkowetransplantacja wysepekmonitorowanie glikemii
Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.