Metoda izolacji mysich wysp trzustkowych i podtorebkowego przeszczepu nerki

Summary

Przeszczep izolowanych wysp trzustkowych został zaproponowany jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. Tutaj opisujemy metodę izolowania wysp trzustkowych myszy i przeszczepiania ich do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Abstract

Od czasu wczesnej pionierskiej pracy Ballingera i Reckarda, która wykazała, że przeszczepienie wysp Langerhansa gryzoniom z cukrzycą może normalizować ich poziom glukozy we krwi, przeszczep wysp trzustkowych został zaproponowany jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1 ^1,2. Niedawne postępy w transplantacji ludzkich wysp trzustkowych jeszcze bardziej wzmocniły ten pogląd ^1,3. Jednak dwa główne ograniczenia sprawiają, że przeszczepianie wysp trzustkowych nie jest powszechną rzeczywistością kliniczną: (a) wymóg dużej liczby wysp trzustkowych na pacjenta, co znacznie zmniejsza liczbę potencjalnych biorców, oraz (b) potrzeba silnej immunosupresji, która znacząco wpływa na populację pediatryczną pacjentów ze względu na ich podatność na długotrwałą immunosupresję. Strategie, które mogą przezwyciężyć te ograniczenia, mogą potencjalnie zwiększyć użyteczność terapeutyczną przeszczepu wysp trzustkowych.

Przeszczep wysp trzustkowych pod mysią torebką nerkową jest powszechnie akceptowanym modelem do badania różnych strategii poprawy przeszczepu wysp trzustkowych. Eksperyment ten wymaga izolacji wysokiej jakości wysp trzustkowych i implantacji wysp trzustkowych biorcom z cukrzycą. Obie procedury wymagają kroków chirurgicznych, które można lepiej zademonstrować za pomocą wideo niż tekstu. Tutaj dokumentujemy szczegółowe kroki dotyczące tych procedur zarówno za pomocą wideo, jak i pisemnego protokołu. Pokrótce omówiono również różne modele transplantacji: syngenetyczny, allogeniczny, syngeniczny autoimmunologiczny i allogeniczny autoimmunologiczny.

Protocol

1. Przygotowanie i kalibracja odczynnika Liberase

1. Protokół ten wykorzystuje enzym Liberase TL (Roche, Cat# 05 401 020 001) do trawienia trzustki.
2. Kupuj 100-200mg na raz i zrób dużą partię. Ponownie zawiesić liofilizowany proszek w sterylnej wodzie klasy HPLC, tak aby stężenie wynosiło około 26 jednostek Wünsch na ml. Powinno to wynosić około 5 mg/ml. Szczegółowe informacje na temat jednostek Wünsch zawartych w danej partii znajdują się w ulotce dołączonej do opakowania. Umieść fiolki na lodzie na 30 minut, delikatnie mieszając co kilka minut. Sprawdzić, czy proszek całkowicie rozpuścił się po upływie 30 minut.
3. Zbierz wszystkie rozpuszczone Liberazy razem i wymieszaj delikatnie mieszając (NIE wirować ani nie wstrząsać). Porcja 24,3 Wünsch do wstępnie schłodzonych probówek Eppendorph, szybkie zamrożenie na ciekłym azocie (traktuj go jak dowolne enzymy) i przechowuj w temperaturze -80°C. Powinno to być około 0,935 ml na probówkę Eppendorph. Każda porcja jest przeznaczona do jednorazowego użytku (wystarcza dla 11 myszy) i nie powinna być przechowywana ani ponownie zamrażana po rozmrożeniu. Ogólnie rzecz biorąc, stado jest stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.
4. Dla każdej nowej partii należy skalibrować optymalny czas inkubacji. Do kalibracji należy użyć zamrożonego wywaru, a nie świeżo rozpuszczonego, aby w jak największym stopniu naśladować rzeczywiste warunki eksperymentalne.
   1. Skalibruj łaźnię wodną, której zamierzasz użyć, dokładnie do 37°C za pomocą termometru rtęciowego. Użyj tego samego inkubatora w przyszłych eksperymentach.
   2. Przed użyciem rozmrozić tubkę Liberazy na lodzie i dodać ją (0,935 ml) do 21,6 ml surowicy wolnej od RPMI, uzyskując końcowe stężenie robocze 1,08 jednostki Wünsch na ml. Surowica, BAS i EDTA hamują Liberazę. i wapń są kofaktorami. Przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 1,5 godziny. To wystarcza dla około 11 myszy (2 ml / mysz).
   3. Patrz krok 2.3, aby zapoznać się z perfuzją trzustki. Perfekuj jak najwięcej myszy w ciągu 1 godziny. Następnie użyj jednej lub dwóch myszy na każdy czas inkubacji i przetestuj czas inkubacji 10, 12, 14, 16, 18 minut. Jeśli to możliwe, uwzględnij 30-sekundowe odstępy między czasami, ponieważ czas trawienia jest bardzo ważny.
   4. Wypełnij protokół izolacji wysp trzustkowych i przeanalizuj wydajność i jakość wysp z każdego punktu inkubacji. Ostatecznie plony nie powinny się zbytnio zmieniać między okresami szczytu, ale jakość wysepek w tych odstępach czasu może się różnić. Do kolejnych eksperymentów należy użyć warunków, w wyniku których największa liczba wysepek jest zdrowa 48 godzin po izolacji. Wydaje się, że wiek myszy wpływa na optymalny czas inkubacji. Używaj więc myszy w podobnym przedziale wiekowym. Najlepiej użyć 8-12 tygodniowych myszy; Jednak nawet 8-10 miesięczne myszy mogą dać dobre wysepki. Do celów kalibracji użyj młodszych myszy.

2. Zabieg chirurgiczny

1. Przygotuj cały sprzęt i pożywki przed eutanazją myszy dawców wysp trzustkowych.
   1. Autoklaw lub sterylizacja płomieniowa narzędzi przed użyciem. Wszystkie odczynniki i narzędzia (mające kontakt z próbkami) powinny być sterylne. Izolowanie i ręczne pobieranie wysepek można przeprowadzić na zewnątrz okapu z przepływem laminarnym bez znacznego zwiększania częstości występowania zanieczyszczeń. Jednak sterylizacja narzędzi, które mają kontakt z trzustką lub wyspami trzustkowymi, ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia. Potrzebne są następujące narzędzia:
      • 1 para nożyczek preparacyjnych do nacięcia brzucha.
      • 2 pary kleszczy.
      • 1 kleszcze hemostatyczne do zaciskania przewodu żółciowego.
      • Siatka druciana o średnicy 0,419 mm.
      • Siatka nylonowa o średnicy 0,1 mm.
   2. Zegnij kilka igieł o rozmiarze 27 tak, aby kąt 70 stopni został wprowadzony mniej więcej w połowie długości igły. Ścięta krawędź igły powinna być skierowana do wewnętrznej strony łokcia.
   3. Napełnij butelkę z rozpylaczem 70% etanolem.
   4. Ustaw mikroskop preparacyjny z odpowiednim źródłem światła na stole laboratoryjnym lub w kapturze.
   5. Wirówka ze wstępnym schładzaniem do 4°C. Wirówka musi mieć obracający się wirnik kubełkowy, być zdolna do 900 x G, być schłodzona i mieć przerwę, którą można odłączyć. W RT6000D Sorvall z wirnikiem Sorvall H1000B prędkość 900xG wynosi 2400 obr./min. Wolniejsze obroty są wykonywane przy 800 obr./min.
   6. Umieść następujące odczynniki na lodzie.
      • RPMI (1 litr z 10% surowicy)
      • RPMI (200ml bez serum)
      • Probówki stożkowe 50 ml (po 1 na każdą trzustkę)
      • Strzykawka o pojemności 5 ml.
   7. Zrównoważyć histopakę1077 do temperatury pokojowej.
   8. Rozmrozić jednorazową porcję skalibrowanej liberazy na lodzie i rozcieńczyć w 22,5 ml RPMI bez surowicy. Surowica, BAS i EDTA hamują Liberazę. i wapń są kofaktorami. Przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 1,5 godziny. To wystarcza dla około 11 myszy (2 ml / mysz).
   9. Ciepła kąpiel wodna o temperaturze 37°C.
   10. Miej pod ręką tyle myszy, ile możesz kanniulować w ciągu 1 godziny (około 10 - 18 myszy).
2. Przygotuj mysz do kaniulacji. Najpierw poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie_CO2. Gdy mysz traci ważność, napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml zapasem roboczym Liberazy o pojemności 2 ml (1,08 jednostki Wünsch / ml).
   1. Umieść mysz w pozycji leżącej na ręczniku papierowym przy lunecie sekcyjnej i spryskaj brzuch 70% etanolem przed otwarciem brzucha z nacięciem w kształcie litery V od okolicy łonowej do obu przednich nóg. Zawiń skórę na klatce piersiowej, aby odsłonić jamę brzuszną.
   2. Ustaw mysz tak, aby głowa była skierowana w Twoją stronę. Zlokalizuj wejście dwunastnicy do wspólnego przewodu żółciowego, jak pokazano na RYC.1. Można to zrobić bez patrzenia przez cel zakresu analizy.
   3. Zacisnąć otwór dwunastnicy hemostatem, jak pokazano na RYS.2. Pozycja zacisku ma kluczowe znaczenie dla zablokowania przepływu Liberazy do jelit. Jeśli zacisk jest zbyt wysoki lub zbyt niski, Liberase nie będzie przenikać przez trzustkę. Ustaw hemostat tak, aby po ściśnięciu przebiegał dokładnie wzdłuż granicy trzustki/jelita.
3. Przed kaniulacją przewodu żółciowego wspólnego może być konieczna zmiana położenia wątroby poprzez dociśnięcie jej do przepony, tak aby cała długość przewodu żółciowego wspólnego była odsłonięta (RYC.3). Po odsłonięciu przewodu żółciowego należy użyć wygiętej igły z 27 szczelinami dołączonej do strzykawki wypełnionej produktem Liberase w celu kanelulacji. Istnieją dwie techniki kaniulacji przewodu żółciowego.
   1. W pierwszej technice, czyli metodzie "wolnej ręki", hemostat zaciśnięty na dwunastnicy jest odciągany od głowy myszy w kierunku ogona, tak że wspólny przewód żółciowy staje się napięty. W przewodzie żółciowym w pobliżu wątroby dochodzi do zbiegu, w którym żółć spływająca z pęcherzyka żółciowego i enzymy z wątroby łączą się przed dostaniem się do jelit. Wnętrze litery V utworzonej przez to zbieg jest odsłaniane poprzez szczelne naciągnięcie przewodu żółciowego i jest idealnym miejscem do zainicjowania kaniulacji przewodu (RYC.4). Jeśli zostanie prawidłowo ustawiona, igła przesunie się w prawo przez literę V i bezpośrednio kaniuluje dolną część kanału. Wbić igłę na kilka milimetrów do kanału przed wydaniem leku Liberase. Optymalne umieszczenie igły jest ważne, aby zapobiec cofaniu się do wątroby i pęcherzyka żółciowego. Ponadto ważne jest, aby igła nie była wprowadzana tak daleko, że zatyka przewód śledziony. Przewód śledziony jest trudną do zauważenia gałęzią wspólnego przewodu żółciowego i odprowadza wodę z ogona śledziony trzustki, obszaru bogatego w wyspy trzustkowe. Jeśli igła przesunie się przez otwór przewodu śledzionowego, nastąpi mniej niż pełna perfuzja ogona śledziony i potencjalnie zmniejszone trawienie tego obszaru. Optymalna wydajność wysp trzustkowych występuje, gdy głębokość igły jest na tyle duża, że żaden Liberase nie ucieka do wątroby/pęcherzyka żółciowego, ale nie tak daleko, aby przejść przez przewód śledziony. Możesz sprawdzić, czy kaniulacja jest udana, dozując niewielką ilość Liberase. Jeśli zauważysz, że Liberase wypełnia kanał, dozuj resztę 2 ml. Jeśli obszar wokół kanału zacznie się wypełniać, przerwij dozowanie, zmień położenie igły i spróbuj ponownie.
   2. W drugiej technice, czyli metodzie "wspomagania kleszczy", hemostat zaciśnięty na dwunastnicy jest odciągany od głowy myszy w kierunku ogona, tak że wspólny przewód żółciowy staje się napięty. Następnie, za pomocą wygiętej igły 27-gague dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml, nakłuć powięź poniżej wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu wątroby. Użyj igły, aby usunąć powięź z kanału (RYS.5). Trzymając igłę nadal na miejscu, odłóż hemostat i podnieś parę kleszczy. Użyj jednego ramienia otwartych kleszczy, aby podnieść przewód żółciowy, w którym igła oczyściła powięź. Grzbiety w kleszczach tworzą drogę, której można użyć do wprowadzenia igły do kanału. Ciągnąc kanał i kleszcze do siebie, wsuń igłę do kanału, używając kleszczyków jako zabezpieczenia. Przetestuj kaniulację, dozując niewielką ilość leku Liberase. Jeśli kanał zacznie się wypełniać (RYS.5 Strzałka), dozuj resztę 2 ml. Jeśli obszar wokół kanału zacznie się wypełniać, przerwij dozowanie, zmień położenie igły i spróbuj ponownie.
4. Gdy 2 ml Liberazy wypełniają trzustkę, obszar w pobliżu dwunastnicy zaczyna się najpierw rozszerzać, następnie obszar na szczycie żołądka, a na końcu ogon śledziony (RYC.6). Zwróć uwagę na równomierne rozciągnięcie trzustki (RYC.6). Jeśli jeden obszar zaczyna się rozszerzać i nie widzisz, jak biała tkanka równomiernie rozszerza się i rozprzestrzenia, prawdopodobnie wspólny przewód żółciowy nie został kaniulowany, ale igła znajduje się wewnątrz torebki trzustkowej. Wypełnienie kapsułki Liberazą nie spowoduje wysokiego plonu wysp trzustkowych, ponieważ powierzchnia narażona na działanie enzymu będzie niewielka. W takim przypadku należy przerwać perfuzję i zmienić położenie igły.
5. Po perfuzji trzustki można ją usunąć z myszy, odciągając ją od punktów styku z jelitami, żołądkiem i śledzioną. Zacznij od usunięcia hemostatu z dwunastnicy. Następnie za pomocą kleszczy unieś dwunastnicę i oddziel trzustkę od jelit drugą parą kleszczy (RYC.7A-B). Odbywa się to poprzez stabilne trzymanie drugiej pary kleszczy podczas wyciągania jelit z brzucha. Następnie wyciągnij trzustkę z górnej części żołądka i śledziony (RYC.7C-D). Na koniec wyjmij trzustkę z brzucha i odetnij ją od pozostałych połączeń powięziowych (RYC.7E-F).
6. Umieść trzustkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pozostaw ją na lodzie podczas pracy na innych myszach. Uruchom 1-godzinny timer. Aby uzyskać maksymalną wydajność wysp trzustkowych, umieść tylko 1 trzustkę w każdej probówce. Nie zaleca się pozostawiania perfundowanej trzustki na lodzie na dłużej niż 1 godzinę, ponieważ Liberase zacznie degradować tkankę. Pod koniec godziny niezwłocznie przejdź do kroku 3.0 dla wszystkich trzustek, które zostały ukrwione.
7. Powtarzaj kroki 2.3 - 2.6 dla pozostałych myszy lub do momentu upływu 1-godzinnego timera rozpoczętego w kroku 2.6.

3. Oczyszczanie wysepek z perfundowanej trzustki

1. Zanim wysepki będą mogły zostać oczyszczone z trzustki, tkanka musi zostać strawiona w temperaturze 37°C. Zgrupuj probówki o pojemności 50 ml z perfundowanymi wysepkami w stojaku z otwartym dnem, który pasuje do łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Upewnij się, że wszystkie nakrętki są dobrze zabezpieczone i zanurz probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na dokładnie taki czas, jaki jest wcześniej określony dla bieżącej partii Liberazy (patrz krok 1.4). Pod koniec inkubacji przenieś probówki do lodu i dodaj RPMI1640 z 10% surowicy do 20 ml na probówkę. Surowica zawierająca pożywkę zatrzyma trawienie Liberazy.
2. Odłącz tkankę, energicznie potrząsając rurkami 40 razy w ciągu 10 sekund. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla optymalnej regeneracji wysp trzustkowych. Nawet przy optymalnej perfuzji Liberazy i ściśle skalibrowanym czasie trawienia, wydajność wysp trzustkowych będzie niska, jeśli tkanka nie zostanie rozbita. Wydaje się, że agresywne obchodzenie się z próbkami na tym etapie nie uszkadza wysepek myszy i jest konieczne do uwolnienia ich od zewnątrzwydzielniczych skupisk komórek.
3. Aby oddzielić wyspy trzustkowe od strawionej trzustki, wykonaj następujące czynności.
   1. Pula strawionej trzustki tak, że na probówkę przypada około 2,5 trzustki. W ten sposób dziesięć probówek zostanie skondensowanych do 4 probówek z 50 ml pożywki każda.
   2. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800 obr./min i 4°C.
   3. Odlej supernatant i ponownie zawieś granulki w 15-25 ml pożywki z 10% FBS, delikatnie wirując (dostosuj intensywność wiru do około 50% maksimum) przez kilka sekund.
   4. Przelej zawieszoną gnojowicę przez siatkę drucianą o średnicy 0,419 mm i przelej do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 ml. To oddziela niestrawioną tkankę, tłuszcz i limfę. Przepłucz początkową probówkę dodatkowymi 10 ml pożywki zawierającej 10% FBS i przelej przez drucianą siatkę. Powtórz ten proces dla pozostałych probówek.
   5. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800 obr./min i 4°C.
   6. Odlej supernatant i ostrożnie odwróć probówki na ręczniku papierowym. Uważaj, aby wysepki się nie zsunęły. Wytrzyj wnętrze probówek ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki mediów, uważając, aby nie naruszyć granulki komórek. Ustaw rury w pozycji pionowej.
   7. Ponownie zawiesić granulki w 5 ml histopakału o temperaturze pokojowej1077, delikatnie wirując przez kilka sekund. Upewnij się, że zawiesina jest jednorodna przed dodaniem dodatkowych 5 ml histopaku wokół wnętrza probówki. To zmywa wysepki ze ścianki rury.
   8. Pokryj histopak 10 ml RPMI bez surowicy, uważając, aby zachować ostrą powierzchnię styku między histopakiem a podłożem. Dodać pożywkę, pipetując powoli wzdłuż boku probówki z szybkością 1 ml na 10 sekund. Pożywka powinna znajdować się na górze, a histopaczna na dole. Surowica wpływa na gęstość pożywki i nie powinna być stosowana na tym etapie.
   9. Wiruj próbki w wirówce zrównoważonej do 20 °C przy 2400 obr./min (900 x G) przez 20 minut z bardzo wolnym przyspieszaniem i bez hamowania. Ten etap oddziela wyspy trzustkowe od komórek zewnątrzwydzielniczych. Wysepki będą migrować do granicy między pożywką wolną od surowicy a histopakiem, podczas gdy komórki zewnątrzwydzielnicze utworzą osad na dnie probówki.
   10. Zebrać wysepki z granicy faz histopaka/podłoże za pomocą jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Wysepki będą przyklejać się do szkła, dlatego nie należy używać szklanych pipet, chyba że zostały silikonowane. Umieść wysepki w świeżej stożkowej tubie o pojemności 50 ml. W tym momencie można połączyć kilka rur. Napełnij probówki do 50 ml serum zawierającym RPMI.
   11. Wirować probówki przez 2 minuty przy 800 obr./min i 4°C.
   12. Odlej supernatant i ponownie zawieś wyspy w 50 ml surowicy zawierającej RPMI, delikatnie wirując.
   13. Wirować probówki przez 90 sekund przy 800 obr./min i 4°C.
   14. Odlej supernatant i powtórz mycie jeszcze 1 raz.
   15. Odlewać sklarowany osad i przenosić probówki do okapu do hodowli tkankowej. Dodać pióro/paciorkowiec do RPMI zawierający 10% FBS do końcowego stężenia 1%, aby uzyskać pożywkę do hodowli wysp trzustkowych. Ponownie zawiesić wysepki w 5 ml tej pożywki hodowlanej.
   16. Odwróć sitko z nylonu o średnicy 0,1 mm i umieść je na stożkowej tubie o pojemności 15 ml. Powoli przepuścić zawiesinę z wysepek przez sitko. Wysepki zostaną zatrzymane przez sitko, podczas gdy komórki zewnątrzwydzielnicze przejdą do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Ten krok radykalnie zwiększa czystość wysp trzustkowych w odniesieniu do zanieczyszczenia komórkami zewnątrzwydzielniczymi na końcu protokołu.
   17. Przepłucz stożkową probówkę o pojemności 50 ml dodatkowymi 6 ml pożywki i odpipetuj ją przez sitko.
   18. Umieść 3 ml pożywki hodowlanej jako dużą kroplę na 10-centymetrowej szalce Petriego. Odwróć sitko komórkowe prawą stroną do góry, tak aby powierzchnia używana do wychwytywania wysepek mogła zostać zanurzona w kropli podłoża. Dotknięcie filtra pożywką spowoduje przeniesienie większości wysepek na szalkę Petriego poddaną działaniu kultur nietkankowych. Używanie niepoddanej obróbce szalki Petriego ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia przylegania wysepek i rozpraszania się na powierzchni płytki. Swobodnie pływające wysepki są znacznie łatwiejsze do wydzielenia na grupy eksperymentalne.
   19. Odpipetować dodatkowe 5-7 ml pożywki hodowlanej przez sitko do szalki Petriego, aby zmyć wszelkie resztki wysepek z sitka do naczynia.
   20. Sprawdź wydajność i jakość wysepek pod obiektywem 4x pod mikroskopem odwróconym. Obracanie naczynia w ciasnym owalu zbierze wysepki na środku naczynia. Jeśli wysepki wyglądają dobrze, można je albo natychmiast zebrać do użytku eksperymentalnego, albo równomiernie rozdzielić na 4-6 10-centymetrowych płytek Petriego (na 10 myszy). Hodowla zbyt wielu wysepek w tym samym naczyniu powoduje, że wysepki stają się nekrotyczne i ulegają degradacji. W przypadku eksperymentów 250-300 wysepek na 6-centymetrowe naczynie z 2-3 ml pożywki nie wydaje się obciążać wysepek.
   21. W stożkowej tubie o pojemności 15 ml będzie kilka użytecznych wysepek, przez które przepływa sitko z nylonu o średnicy 0,1 mm. Wysepki te można odzyskać po trzech do czterech rundach sedymentacji grawitacyjnej. Po około 4 minutach sedymentacji odessać z probówki wszystko, z wyjątkiem około 1 ml pożywki i ponownie napełnić ją do góry pożywką hodowlaną. Zakryj probówkę i odwróć, aby wymieszać. Kilkukrotne powtórzenie tego procesu usuwa wiele jednokomórkowych komórek zewnątrzwydzielniczych, które powoli się osadzają, i wzbogaca cięższe agregaty komórek endokrynnych (wysepki), które szybko toną. Po końcowej aspiracji ponownie zamieszać w 7 ml pożywki hodowlanej i umieścić na świeżej szalce Petriego.

4. Praca z izolowanymi wysepkami

1. Proces izolacji jest dość stresujący dla wysepek; histopak jest toksyczny, etapy wstrząsania i wirowania wywołują czysty stres, a usunięcie z dopływu krwi gospodarza, jak również hodowla in vitro, może wywołać niedotlenienie. My i inni wykazaliśmy, że izolacja indukuje śmierć komórki beta ^4-5. Efekt tych naprężeń jest widoczny w złuszczaniu się komórek z obrzeży wysepki oraz ciemnieniu i wydalaniu centralnego rdzenia wysepki (martwica centralna). Podczas gdy złuszczanie się komórek z obrzeży może być tolerowane, centralna martwica wysepki dyskwalifikuje ją do wykorzystania w eksperymentach. Zazwyczaj im większa wysepka, tym większa szansa, że martwica centralna będzie problemem. Wysiłki mające na celu zmniejszenie reakcji wysepek na stres po izolacji zwiększą wydajność użytecznych wysepek.
2. Dlatego stosujemy wcześniej opisaną technikę inkubacji wysp trzustkowych w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 22-27°C przez pierwsze 48-72 godziny po izolacji ^6-8. Ta obniżona temperatura tłumi reakcję wysp trzustkowych na stres i ułatwia ich przejście do hodowli in vitro. Jeśli inkubator do hodowli tkankowych o temperaturze 22-27°C nie jest dostępny, możliwe jest osiągnięcie pożądanego zakresu temperatur w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych poprzez wyłączenie kontroli ciepła i umieszczenie około 20 funtów cegieł zamrażarki w temperaturze -80°C. Powoduje to około 16-24 godzin obniżonej temperatury w inkubatorze. W razie potrzeby wymień cegły zamrażarki w temperaturze -80°C. Nie zaobserwowaliśmy dodatkowych korzyści z inkubacji w tej niższej temperaturze dłuższej niż 72 godziny.
3. Oprócz inkubacji w niskiej temperaturze zalecamy wymianę pożywki 24-48 godzin po izolacji. Czynniki wydzielane przez zestresowane i martwe wysepki gromadzą się w pożywce po izolacji i mogą sprzyjać dodatkowemu stresowi wysp trzustkowych. Aby zmienić nośnik, wykonaj następujące czynności.
   1. Przenieść podłoże i wysepki z płytki Petriego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą plastikowej pipety.
   2. Umyj płytkę dodatkowymi 3 ml pożywki hodowlanej, aby zebrać resztki wysepek.
   3. Dodaj te dodatkowe 3 ml do stożkowej rurki o pojemności 15 ml i pozwól wysepkom osadzać się grawitacyjnie przez 5 minut.
   4. Odessać wszystkie oprócz 1 ml pożywki ze stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie ponownie zawiesić wyspy trzustkowe w 4 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych.
   5. Przenieś wysepki i podłoże na świeżą płytkę Petriego. Dodaj dodatkowe 3 ml pożywki hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby zebrać wszelkie pozostałe wysepki i dodaj je do płytki Petriego.
   6. Następnie zmieniaj podłoże wysepek co trzy do pięciu dni.
4. Podczas wybierania wysepek do eksperymentu nie zaleca się mieszania wysepek z różnych izolacji. Na molekularną linię bazową wysepek wpływa wiele czynników, w tym czas, przez jaki przebywały w hodowli i stres izolacyjny, który różni się w zależności od przygotowania. Aby zmniejszyć zmienność, eksperymenty z wysepkami muszą być przeprowadzane na wysepkach, które zostały wyizolowane w tym samym czasie. Jeśli jednak nie jest to możliwe, zdecydowanie zalecamy zebranie wszystkich wysepek w jedną grupę przed wybraniem ich do eksperymentów. Aby wybrać wysepki do eksperymentów, wykonaj następujące kroki.
   1. Jeśli wysepki inkubują się w więcej niż jednym naczyniu, zbierz wszystkie wysepki w jednym naczyniu, wykonując kroki od 4.3.1 do 4.3.5 wymienione powyżej. Jeśli w grę wchodzi wiele szalek z wysepkami, zamiast probówki o pojemności 15 ml należy użyć stożkowej rurki o pojemności 50 ml. Może to zmniejszyć zmienność wywołaną subtelnymi różnicami w warunkach hodowli między płytkami w okresie rekonwalescencji po izolacji.
   2. Podczas osadzania się grawitacyjnie wysepek ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w obiektyw 4x lub 10x. Weź mikropipetę p200 i pudełko sterylnych końcówek p200.
   3. Przenieść osadzone wysepki na pojedynczą płytkę i przenieść płytkę do mikroskopu. Zakręć talerzem, aby zebrać wysepki do środka. Zdejmij pokrywkę z płytki i użyj pipety p200, aby wybrać zdrowe wysepki. Zdrowe wysepki mają gładkie granice i nie mają ciemnych obszarów środkowych (ryc. 8). Należy starać się utrzymać równomierny rozkład rozmiarów wysp trzustkowych w naczyniach eksperymentalnych, ponieważ rozmiar wysp może zmienić odpowiedź na leczenie.
   4. Liczba wysepek na grupę eksperymentalną może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentu. Szacujemy, że jedna wysepka ma około 1000-2000 komórek i da 0,3-1 μg białka i 25 ng całkowitego RNA. W przypadku testów in vitro typowa grupa doświadczalna może składać się z od 100 do 250 wysepek platerowanych w szalkach o średnicy 35 mm lub 6 cm z 1-3 ml pożywki. Do przeszczepu każda mysz biorca będzie potrzebować od 150 do 400 wysepek, w zależności od projektu eksperymentalnego (więcej szczegółów można znaleźć w kroku 5.2.2 i Dyskusji).
   5. Aby zminimalizować odchylenia wprowadzone przez proces ręcznego wybierania, używamy otworu końcówki pipety p200 jako wskazówki do oszacowania rozmiaru wysp trzustkowych. Większość wysepek ma średnicę w przybliżeniu połowy średnicy otworu, a każdą z nich liczymy jako jedną standardową wysepkę. Wszelkie wysepki większe lub mniejsze od tej liczby, przypisujemy odpowiednio inną liczbę wysepek. Zbieramy wysepki w partiach po 20-50 sztuk i przenosimy je do wyznaczonych naczyń doświadczalnych. Jeśli pipeta p200 jest ustawiona na objętość 180 mikrolitrów, można zebrać wiele wysepek (zwykle więcej niż 50 wysepek) do jednej końcówki. Tak więc, mimo że wysepki są wybierane pojedynczo, można zebrać wiele wysepek w obrębie każdej końcówki p200, sterując mechanizmem zwalniającym pipetmana. Ułatwia to wybieranie setek, a nawet ponad tysiąca wysepek potrzebnych do eksperymentów. Używamy również tej operacji wsadowej, aby pomóc wyrównać rozmieszczenie wysepek o podobnej jakości i wielkości.

5. Podtorebkowy przeszczep wysp trzustkowych nerki

1. Indukuj cukrzycę u myszy biorców przeszczepu.
   1. Umieść myszy na 4 do 6 godzinnym poście. Optymalni biorcy przeszczepu powinni mieć od 6 do 10 tygodni i ważyć od 20 do 25 gramów w czasie postu. Aby pościć myszy, wyjmij karmę z rusztu do karmienia i zawsze umieszczaj myszy w nowej klatce. Zapewnia to prawdziwy post poprzez oddzielenie myszy od wszelkich resztek jedzenia, które mogły wcześniej wpaść do ich klatki. Zaplanuj, aby od 80% do 90% myszy zachorowało na cukrzycę.
   2. Trzy godziny po rozpoczęciu postu przygotuj bufor cytrynianu sodu. Odważ 0,735 g enzymatycznego cytrynianu sodu (cytrynian Na, Mr 294,10 g/mol) i rozpuść go w 25 ml sterylnej wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 4,5 za pomocą HCl. Bufor ten powinien być aktualizowany dla każdej rundy eksperymentów.
   3. Umieścić 0,05 g streptozotocyny (STZ, M_r 265,2 g/mol) w 1,5 ml probówki Eppendorph. Ta ilość wystarcza do wywołania cukrzycy u około 8 myszy. Przygotuj odpowiednią liczbę probówek o pojemności 1,5 ml w stosunku do liczby myszy, które mają zostać wstrzyknięte. STZ jest wrażliwy na światło, więc przykryj każdą tubkę folią aluminiową.
   4. Po 4 godzinach postu ponownie zamieszaj jedną tubkę STZ z 1 ml świeżo przygotowanego buforu cytrynianu Na. Po ponownym zawieszeniu roztwór cytrynianu STZ-Na traci aktywność w ciągu 15 do 20 minut, dlatego ten krok należy wykonać tylko bezpośrednio przed wstrzyknięciem myszy.
   5. Każdej myszy wstrzyknąć dootrzewnowo odpowiednią objętość roztworu cytrynianu STZ-Na, aby osiągnąć ostateczną dawkę 190 mg/kg myszy. Dawka ta może się różnić w zależności od odmiany i wieku myszy; Dlatego może być konieczne przeprowadzenie optymalizacji dawki, jeśli częstość występowania cukrzycy jest zbyt mała lub jeśli zbyt wiele myszy umiera w ciągu 3 do 5 dni po wstrzyknięciu. Najczęściej stosowane dawki wahają się od 150 mg / kg myszy do 250 mg / kg myszy.
   6. Zaopatrz się w jedzenie i wodę po wstrzyknięciu wszystkim myszom.
   7. Przetestuj myszy pod kątem hiperglikemii na czczo (>350 mg / kg) 2 do 4 dni po wstrzyknięciu. Myszy, które wykazują 3 kolejne dni hiperglikemii bez postu, mogą być używane jako biorcy przeszczepu.
2. Przygotuj wysepki do przeszczepu
   1. Izoluj wysepki zgodnie z powyższym opisem w krokach od 2.0 do 4.0. W razie potrzeby wysepki można odizolować w dniu przeszczepu lub wcześniej.
   2. Zbieraj wysepki w grupy do przeszczepu, umieszczając je w sterylnych probówkach Eppendorph o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówki na lodzie. Liczba wysp trzustkowych potrzebnych do przywrócenia normoglikemii może się różnić w zależności od warunków eksperymentu (szczep dawcy wysp trzustkowych, waga i szczep biorcy oraz wszelkie dodatkowe zabiegi podane biorcy) oraz osoby, która wybiera wyspy. Rozmiar myszy odbiorcy jest jedną z głównych zmiennych, która wpływa na minimalną liczbę wysepek, ponieważ większe myszy będą wymagały więcej wysepek. Konsekwentnie stwierdzamy, że od 150 do 250 wysepek tylko nieznacznie przywraca normoglikemię, podczas gdy 300 lub więcej wysp jest lecznicze u myszy biorcy C57BL / 6 o wadze od 18 do 20 gramów. W tych eksperymentach myszy dawcami wysp trzustkowych miały C57BL / 6 lub Balb / c.
3. Przeszczep wysp trzustkowych do podtorebkowej torebki nerkowej
   1. Zbierz następujące materiały (wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być wysterylizowane):
      
      Tabela 1. Sprzęt do transplantacji
      

      Strzykawka Hamilton 25 μl	6" elastycznej rurki PE 50 przyciętej tak, aby jedna strona była fazowana
      Ładowanie żelu i końcówki do pipet p200	Sterylne probówki Eppendorph (1 na odbiorcę)
      Izofluran i waporyzator Isoflurane	Stojak na probówki Eppendorph
      Nożyczki McPherson-Vannas (1)	Kleszcze do zgiętych ramion (2)
      Hemostatyki (1)	Klips do nawijania z klipsami
      Igła o rozmiarze 27	Sondy kapilarne ze szkła ciągniętego płomieniem*
      Aplikatory z bawełnianą końcówką	50 ml stożkowa probówka sterylnego PBS
      szwy	Nożyce elektryczne
      Butelka z rozpylaczem 70% etanolu	Długopis
      Betadine (Betadyna)	przezroczysta sterylna serweta z tworzywa sztucznego

      
      
      * Uwaga: Przygotowując te sondy, spróbuj utworzyć łuk w sondzie, który naśladuje kąt nerki myszy. Ponadto upewnij się, że końcówka sondy jest odpowiednio wypolerowana, wypolerowana, aby nie było ostrych krawędzi.
   2. Zważ i oznacz wszystkie myszy biorców z cukrzycą. Przypisz każdą mysz do grupy eksperymentalnej przed przeszczepem, tak aby każda grupa miała podobnie dopasowaną masę ciała.
   3. Ustaw pole operacyjne w otwartej przedniej masce wyposażonej w wylot gazu z parownika Isoflurane.
   4. Znieczulij mysz biorcy izofluranem, a następnie ogol jej bok nożycami elektrycznymi. Ogol mysz poza obszarem, w którym będą wykonywane przeszczepy.
   5. Przywróć mysz do znieczulenia i ustaw ją prostopadle do i bezpośrednio nad trzonem szklanego pręta, tak aby ogolony bok był skierowany do góry. Spryskaj bok 70% etanolem. Mysz ma być przygotowana za pomocą chirurgicznego peelingu z naprzemiennej betadyny i alkoholu, powtórzonego trzykrotnie. Ułóż mysz przezroczystą, sterylną serwetą umożliwiającą dostęp do ogolonego boku.
   6. Przygotuj wyspy trzustkowe do przeszczepu, podczas gdy mysz jest znieczulana. Zrób to, wykonując następujące kroki.
      1. Umieść sterylną końcówkę ładującą żel w otworze probówki Eppendorph o pojemności 1,5 ml tak, aby nastąpiło delikatne zagięcie, które tworzy kształt litery U na wąskim końcu końcówki. Otwór końcówki powinien być skierowany bezpośrednio do góry na zewnątrz rurki Eppendorph. Nie wprowadzaj załamania w żadnym momencie końcówki ładującej żel, ponieważ spowoduje to ścinanie wysp trzustkowych i zmniejszenie liczby przeszczepianych wysp.
      2. Delikatnie usunąć z lodu tubkę z wysepkami, która została przygotowana w kroku 5.2.2. Wszystkie wysepki powinny być osadzone na dnie rurki. Za pomocą pipety p200 delikatnie zbierz wysepki w minimalnej objętości od dna probówki. Przełóż te wysepki przez duży otwór końcówki ładującej żel przygotowanej w kroku 5.3.6.1. Wysepki powinny osiąść w wąskim lub wąskim ograniczeniu końcówki ładującej żel.
      3. Po osadzeniu się wysepek usuń jak najwięcej pożywki z końcówki ładującej żel. Można to osiągnąć za pomocą świeżej końcówki ładującej żel dołączonej do pipety p200 poprzez zasysanie medium przez duży otwór końcówki ładującej żel z wysepką.
      4. Przenieś osadzone wysepki do elastycznej rurki PE 50 (~ 15 cm długości). Można to zrobić, najpierw przymocowując nieskośny koniec rurki do wąskiego otworu końcówki ładującej żel z łożyskiem wysepki przed przymocowaniem końcówki do pipety p200. Wysepki można następnie przepchnąć przez 60% długości rurki.
      5. Przenieś rurkę PE 50 z łożyskiem wysepki do strzykawki Hamiltona o pojemności 25 μl. Upewnij się, że tłok strzykawki został wyjęty przed przeniesieniem rurki. Połączyć nieskośną krawędź rurki PE 50 z igłą strzykawki.
      6. Wcisnąć tłok strzykawki tak długo, aż wysepki znajdą się w odległości około 0,5 cm od skośnego otworu.
      7. Odłożyć strzykawkę na bok tak, aby wyspy trzasnkowe mogły osiąść w jedną masę w pobliżu skośnego otworu probówki, podczas gdy nerka jest przygotowywana do przyjęcia wysepek.
   7. Palcami zlokalizuj nerkę przez skórę myszy w znieczuleniu. Trzon długopisu powinien znajdować się bezpośrednio pod obszarem, w którym znajduje się nerka i być ustawiony prostopadle do rdzenia kręgowego.
   8. Po zlokalizowaniu nerki użyj nożyczek McPhersona-Vannasa, aby wykonać 2-centymetrowe nacięcie w skórze właściwej bezpośrednio nad nią w kierunku prostopadłym do rdzenia kręgowego. To nacięcie odsłoni ścianę otrzewnej.
   9. Nożyczkami McPherson-Vannas wykonaj 1 cm nacięcie przez ścianę otrzewnej w tym samym kierunku, co cięcie przez warstwę skórną. Ważne jest, aby otwór powstały w wyniku tego nacięcia był mniejszy niż odsłonięta nerka.
   10. Używając trzonu szklanego pręta jako zabezpieczenia, wepchnij nerkę przez otwór otrzewnowy, naciskając na sąsiednią powierzchnię. Jeśli otwór jest nieco mniejszy niż nerka, nerka przeciśnie się przez otwór i stabilnie spocznie na powierzchni myszy bez dodatkowej manipulacji lub kontaktu. Takie ustawienie jest optymalne dla kolejnych etapów przeszczepu. Jeśli otwór jest zbyt duży, nerka opadnie z powrotem do jamy otrzewnej, co utrudni wykonywanie kolejnych kroków.
   11. Zwilż powierzchnię odsłoniętej nerki lodowatym sterylnym PBS za pomocą nasączonego bawełnianej końcówki aplikatora. Powtarzaj ten krok co kilka minut lub w razie potrzeby, aby zapobiec wysychaniu torebki nerkowej.
   12. Za pomocą igły o rozmiarze 27 wykonaj 0,2 cm nacięcie przez torebkę nerkową w poprzek przedniej powierzchni nerki, przesuwając się od lewej strony bocznej w kierunku prawej strony bocznej.
   13. Za pomocą sondy szklanej rurki kapilarnej ciągniętej płomieniem utwórz torebkę między torebką nerkową a miąższem nerki. W tym celu należy wprowadzić sondę przez nacięcie wykonane w kroku 5.3.12 i przesunąć ją w kierunku tylnym wzdłuż grzbietowo-bocznej powierzchni nerki. Idealna sonda będzie miała w sobie zagięcie, które pasuje do naturalnego łuku tej powierzchni nerki. Umożliwi to sondzie dotarcie do najbardziej tylnego końca nerki bez rozrywania dużego przedniego otworu. Ważne jest, aby ta torebka była jak najdłuższa i węższa. Krótkie, szerokie woreczki nie są idealne, ponieważ umożliwiają wysepki wydostające się z kapsuły. Długie i wąskie woreczki umożliwiają osadzanie się wysp trzustkowych w kierunku tylnego końca nerki przy minimalnej utracie z torebki torebkowej.
   14. Pobrać strzykawkę Hamiltona o pojemności 25 μl przygotowaną w kroku 5.3.6 i przesunąć wysepki do samej krawędzi skośnego otworu elastycznej rurki.
   15. Włożyć skośną krawędź elastycznej rurki do torebki podkapsułkowej przygotowanej w kroku 5.3.13. Ścięta krawędź powinna być skierowana do góry, tak aby długa krawędź stykała się z miąższem nerki. Przesunąć rurkę do najbardziej wysuniętego do tyłu końca kapsułki.
   16. Powoli przenieść wysepki z rurki PE 50 do torebki podtorebkowej, naciskając tłok strzykawki. Gdy wysepki wypełniają woreczek, powoli wysuwaj elastyczną rurkę, robiąc więcej miejsca na osadzenie wysepek. Upewnij się, że wszystkie wysepki zostały przeniesione z rurki do torebki. Nie napełniaj saszetki powietrzem ani nadmiarem płynu.
   17. Po wyjęciu rurki PE 50 z torebki, użyj sondy szklanej rurki kapilarnej ciągniętej płomieniem, aby delikatnie wepchnąć wysepki do bliższego końca torebki. W tym celu przesuwaj szklaną sondę wzdłuż zewnętrznej powierzchni nerki, poruszając się w kierunku od przodu do tyłu. Należy uważać, aby nie pakować wysepek zbyt ciasno, ponieważ tylny koniec torebki podtorebkowej może pęknąć i uwolnić wysepki. Ten krok minimalizuje utratę wysp trzustkowych z przedniego otworu torebki, gdy nerka jest umieszczana z powrotem w jamie otrzewnej.
   18. Za pomocą kleszczyków do zgiętych ramion podnieś wyściółkę otrzewnej przylegającą do otworu wykonanego dla nerki, a następnie użyj aplikatora nasączonego bawełnianą końcówką PBS, aby delikatnie wepchnąć nerkę z powrotem do jamy otrzewnej.
   19. Zamknij mysz, zakładając szwy na ścianę otrzewnej i klipsy do rany na warstwę skórną.
   20. Umieść mysz z powrotem w klatce i powtórz kroki od 5.3.4 do 5.3.19 dla pozostałych myszy. Myszy powinny być utrzymywane w cieple za pomocą poduszki grzewczej pod klatką lub lampy grzewczej z chronionymi oczami, dopóki mysz w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Zwierzętom należy podawać acetominofinę w wodzie (6 mg/ml).
   21. Sprawdź poziom glukozy we krwi na czczo 24 godziny później. Wszystkie myszy powinny mieć normoglikemię (stężenie glukozy we krwi <200 mg / dl) w dniu po operacji (POD) 1.

6. Reprezentatywne wyniki

W tym protokole opisane są dwie główne procedury: (1) izolacja wysp trzustkowych i (2) przeszczepienie wysp trzustkowych pod torebką nerkową. W procedurze izolacji wysepek plony wysepek zwykle wahają się między 100-150 wysepek na mysz, w zależności od wieku i szczepu. Czystość tych wysp pod względem ich oddzielenia od komórek zewnątrzwydzielniczych trzustki może się znacznie różnić w zależności od preparatu. Jednak zastosowanie Histopaque1077 w temperaturze pokojowej w kroku 3.3.7 i nylonowego filtra 0,1 mm w kroku 3.3.17 zazwyczaj pozwala na uzyskanie czystości wysepek większej niż 99%. Czystość tę osiąga się przed dodatkowym ręcznym zbieraniem wysepek. Reprezentatywne obrazy wysepek po odizolowaniu przedstawiono na rysunku 8D. Jak widać na tych zdjęciach, wysepki zazwyczaj mają szorstką granicę obwodową bezpośrednio po izolacji. Jednak z czasem w kulturze zdrowe wysepki uzyskają i utrzymają gładką granicę (ryc. 8D). Na niektórych wysepkach rozwinie się centralny obszar nekrotyczny pojawiający się jako ciemny obszar w jądrze. To nekrotyczne centrum jest często wydalane z wysepki, tak jak zostało to uchwycone przez obrazowanie poklatkowe (Dodatkowe wideo 1). Pozostałe wysepki wydają się puste w środku (dane nie są pokazane) i prawdopodobnie nie działają. W ten sposób wykluczamy wysepki z ciemnym środkiem podczas procesu zbierania ręcznego. Co ważne, odkryliśmy, że inkubacja w niskiej temperaturze po procedurze izolacji (krok 4.2) może radykalnie zmniejszyć liczbę wysepek, które z czasem rozwiną centralną nekrozę w kulturze.

W procedurze przeszczepu wysp trzustkowych kluczowe są dwa etapy: chemiczna indukcja cukrzycy i dostarczenie wysp trzustkowych do obszaru podtorebki nerki. W przypadku indukcji cukrzycy celem jest osiągnięcie hiperglikemii u ponad 90% myszy, którym wstrzyknięto STZ. Myszy te przetrwają bez przeszczepu przez kilka tygodni. Optymalna dawka STZ do osiągnięcia tego celu różni się w zależności od szczepów myszy i wieku i powinna być określona doświadczalnie. Odkryliśmy, że różnica tak mała jak 20 mg/kg masy ciała może mieć duże znaczenie. Dlatego należy przeprowadzić miareczkowanie w wąskich odstępach czasu. W przypadku przeszczepu wysp trzustkowych kluczową kwestią są modele, które mogą mieć cztery konteksty immunologiczne: syngenetyczny, allogeniczny, syngeniczny autoimmunologiczny i allogeniczny autoimmunologiczny. W modelu syngenicznym szczep dawcy jest taki sam jak szczep biorcy. W związku z tym wysepki nie wywoływały adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej u biorców. To pozwala naukowcom na zbadanie kwestii związanych z "pierwotną niefunkcją", terminem odnoszącym się do dysfunkcji i utraty wysp trzustkowych z powodów innych niż specyficzne odrzucenie immunologiczne przez biorców. Uważa się, że pierwotna niefunkcja jest główną przyczyną niewydolności wysp trzustkowych we wczesnym stadium przeszczepu i konieczności dużej liczby wysp trzustkowych (≥2 trzustki na pacjenta) w celu osiągnięcia euglikemii. Dlatego jest to krytyczna kwestia dla przeszczepu wysp trzustkowych. W tym modelu należy użyć brzeżnej masy wysp trzustkowych, która nie przywraca całkowicie normoglikemii, a myszy powinny zostać zbadane pod kątem stężenia glukozy we krwi na wczesnym etapie po przeszczepie, zwykle między POD 1 a POD 7. Z naszego doświadczenia wynika, że marginalna masa wysepek wynosi zwykle od 150 do 250 średniej wielkości wysepek na 20 gramowego biorcę przy użyciu szczepu myszy C57BL/6. W modelu syngenetycznym można wykorzystać genetycznie lub farmakologicznie zmodyfikowane wyspy trzustkowe do sprawdzenia, czy dana modulacja wpływa na skuteczność terapeutyczną wysp trzustkowych na wczesnym etapie po przeszczepie.

W modelach allogenicznych i autoimmunologicznych, przeszczepy wysp trzustkowych są narażone na specyficzny atak immunologiczny ze strony adaptacyjnej odporności gospodarza, która obejmuje limfocyty T, limfocyty B i inne komórki odpornościowe. Odporność adaptacyjna to opóźniona odpowiedź immunologiczna; Aby ocenić tę odpowiedź, konieczne jest przeszczepienie nasyconej liczby wysp trzustkowych, która skutecznie przywraca normoglikemię we wczesnym stadium po przeszczepie, aby zminimalizować wpływ pierwotnej niefunkcji. Następnie można monitorować czas, po którym wyspy trzustkowe zostaną odrzucone, na co wskazuje utrata normoglikemii, aby określić wpływ dowolnej modyfikacji wysp trzustkowych na odrzucenie przeszczepu. Z naszego doświadczenia wynika, że na 20 gramową mysz potrzeba więcej niż 300 wysepek, a 15 do 21 dni to czas odrzucenia przeszczepu allogenicznego przy użyciu Balb/c (H-2^d) jako dawców i C57BL/6 (H-2^b) jako biorców.

Rysunek 1. Lokalizacja otworu dwunastnicy wspólnego przewodu żółciowego. Endogenne enzymy trawienne odprowadzające wodę z wątroby, trzustki i pęcherzyka żółciowego przechodzą przez wspólny przewód żółciowy, zanim dostaną się do przewodu pokarmowego w dwunastnicy. Kierunek przepływu przez ten kanał można odwrócić, jeśli do układu zostanie przyłożone ciśnienie poprzez dodanie płynu zewnętrznego. Spowoduje to, że trzustka stanie się pełna i rozdęta.

Rysunek 2. Zaciskanie ujścia dwunastnicy wspólnego przewodu żółciowego. W celu napełnienia trzustki preparatem Liberase konieczne jest zablokowanie dwunastnicy w przewodzie żółciowym wspólnym. Jeśli nie zostanie to osiągnięte prawidłowo, Liberase wypełni jelita zamiast trzustki.

Rysunek 3. Repozycja wątroby względem przepony umożliwia wizualizację bliższego obszaru wspólnego przewodu żółciowego. Kaniulacja przewodu żółciowego wspólnego może być osiągnięta najskuteczniej, jeśli zostanie podjęta w pobliżu jego bliższego końca (przy zbiegu w kształcie litery V opisanym w 2.3.1).

Rysunek 4. Kaniulacja przewodu żółciowego wspólnego metodą "wolnej ręki". Zbieg wspólnego przewodu żółciowego staje się widoczny, gdy hemostat zaciśnięty nad dwunastnicą jest ciągnięty w kierunku tylnego końca myszy. Kaniulację kanału można uzyskać, umieszczając igłę o rozmiarze 27 w tym zbiegu i przebijając się przez nią.

Rysunek 5. Kaniulacja przewodu żółciowego wspólnego metodą "wspomagania kleszczy". Jak wspomniano w tekście, czasami tkanka powięziowa otaczająca przewód utrudnia kaniulację. (A) W takich przypadkach przydatne jest oczyszczenie warstwy twarzy za pomocą igły o rozmiarze 27. (B) Kanał może być następnie wyraźnie uwidoczniony i podparty przez parę zgiętych kleszczyków do ramion. (C) Używając kleszczy jako zabezpieczenia, igła o rozmiarze 27 może zostać wprowadzona do kanału w celu podania Liberase.

Rysunek 6. Równomierne rozszerzanie się trzustki wskazuje na optymalne ułożenie igły. Biorąc pod uwagę półprzezroczysty charakter przewodu i otaczających go tkanek powięziowych, w niektórych przypadkach może się wydawać, że przewód został kaniulowany, podczas gdy w rzeczywistości tak nie było. Jeśli tak się stanie i igła wniknie w torebkę trzustkową, okolica dwunastnicy trzustki zacznie się rozszerzać po podaniu leku Liberase. Jednak cała trzustka nie zostanie ulegnie perfuzji, co spowoduje niską wydajność wysp trzustkowych. Aby uniknąć tego problemu, obserwuj równomierne rozszerzanie się trzustki, szukając oznak wnikania enzymu do obszaru trzustki przyczepionego do przedniej części żołądka.

Rysunek 7. Usunięcie perfundowanej trzustki. Aby usunąć trzustkę z myszy, należy przerwać kilka punktów styku z wnętrznościami. Punkty A-B) Oddziel trzustkę od jelit. (C) Oddzielić trzustkę od żołądka. (D) Oddziel trzustkę od jelit. (E-F) Odetnij wszelkie pozostałe kontakty z jamą otrzewnej.

Rysunek 8. Reprezentatywne obrazy wysepek. Względną czystość i jakość wysepek można oszacować pod mikroskopem po zakończeniu procedury izolacji. (A) Chociaż celem jest oczyszczenie wysp trzustkowych, czasami obecne są komórki zewnątrzwydzielnicze i szczątki. (B) Stres związany z izolacją wysp trzustkowych może wywołać śmierć komórki, która objawia się ciemnymi centralnymi obszarami wysp trzustkowych i złuszczaniem się komórek z obwodu wysp. (C) Podczas wybierania wysepek do eksperymentu należy unikać wybierania zanieczyszczających komórek zewnątrzwydzielniczych. (D) Wysepki zmieniają swój wygląd z upływem czasu w kulturze. Gdy wysepki dochodzą do siebie po izolacji, uzyskują gładką powierzchnię obwodową. Od czasu do czasu na większych wysepkach widoczny jest ciemny obszar centralny. Komórki te barwią się pozytywnie pod względem śmierci komórki.

Dodatkowe wideo 1. Mikroskopia poklatkowa wysepek po izolacji. Na tym 16-godzinnym filmie poklatkowym można zobaczyć, jak wysepki rozwijają nekrotyczne centra, które ostatecznie są wyrzucane. Proszę kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Discussion

W powyższych sekcjach opisaliśmy szczegółowe kroki izolowania i przeszczepiania wysp trzustkowych myszy. W tym miejscu pokrótce podkreślamy kroki, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia procedur.

1. Izolacja wysp trzustkowych

Kluczowymi etapami są: określenie optymalnego czasu trawienia enzymatycznego (1.4), umieszczenie zacisku hemostatu nad otworem dwunastnicy wspólnego przewodu żółciowego (2.2.3), kaniulowanie wspólnego przewodu żółciowego (2.3), energiczne potrząsanie trzustką po trawieniu w temperaturze 37°C (3.2) oraz usunięcie zanieczyszczenia komórek zewnątrzwydzielniczych (3.3.7 i 3.3.16). Etapy te mają ogromny wpływ na jakość, plon i czystość wysepek. Być może najtrudniejszym technicznie krokiem jest kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego. U wielu myszy wspólny przewód żółciowy może być trudny do uwidocznienia ze względu na otaczającą powięź. Dlatego często zdarza się, że próby kaniulacji wspólnego przewodu żółciowego skutkują penetracją tylko tkanki powięziowej. W takich przypadkach Liberaza zaczyna wypełniać otaczającą tkankę łączną i nie przenika do trzustki. W takim przypadku należy zatrzymać przepływ leku Liberase i zmienić położenie igły tak, aby wniknęła w światło przewodu żółciowego. Przy nabraniu wprawy możliwe jest szybkie określenie optymalnej pozycji do umieszczenia igły i zakończenie kaniulacji bez uszkodzenia kruchego kanału.

2. Przeszczep wysp trzustkowych

Krytycznymi etapami są indukcja STZ cukrzycy (5.1) i skuteczne dostarczanie wysp trzustkowych do torebki podtorebkowej (5.3.14-5.3.16). STZ jest naturalnie występującym analogiem glukozy, który jest selektywnie toksyczny dla komórek wydzielających insulinę β komórek wysp trzustkowych ⁹. Jednak ta selektywna toksyczność występuje w stosunkowo wąskim zakresie stężeń. Świadczy o tym fakt, że wysokie dawki STZ mogą skutkować szybką (2-3 dni) śmiertelnością przy braku hiperglikemii. Dlatego należy dołożyć starań, aby określić optymalną dawkę STZ dla szczepu i wieku wykorzystywanych myszy przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów na dużą skalę. Kluczowym krokiem jest również fizyczne dostarczenie wysp trzustkowych do torebki podtorebkowej. Aby osiągnąć spójne wyniki, konieczne jest zminimalizowanie strat wysepek podczas ich dostarczania. Może się tak zdarzyć, jeśli występują wady lub pęknięcia torebki nerkowej pokrywającej torebkę lub jeśli wstrzyknięta objętość jest zbyt duża. Uszkodzenia kapsułki można uniknąć poprzez delikatną i ostrożną manipulację oraz użycie gładkiej szklanej sondy do przygotowania torebki podkapsułkowej. Ponadto objętość wtrysku można zminimalizować poprzez ostrożne usunięcie supernatantu w kroku 5.3.6.3. Jeśli supernatant zostanie usunięty do poziomu osadzonych wysepek, w woreczku podtorebkowym jest zwykle wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić od 400 do 500 wysepek. Jeśli jednak objętość wstrzyknięcia jest zbyt duża, istnieje większe prawdopodobieństwo, że wysepki wydostaną się z torebki podczas procesu przeszczepu, co zagraża odtwarzalności eksperymentu.

W ramach tego protokołu możliwe jest zmodyfikowanie niektórych kroków i nadal osiąganie satysfakcjonujących wyników. Obejmują one: (a) zastosowanie innego enzymu do trawienia trzustki, (b) inną metodę dostarczania enzymu do trzustki, (c) zastosowanie ciągłego gradientu fikolu-diatrizoinianu sodu (FSD) zamiast etapu Histopaque1077 o pojedynczej gęstości oraz (d) przeszczep wysp trzustkowych do miejsc innych niż podtorebka nerki.

1. W tym protokole Liberaza jest stosowana w celu osłabienia kontaktów komórka-komórka w trzustce. Liberaza jest zasadniczo mieszaniną wysoce oczyszczonych kolagenaz, które okazały się przydatne w uwalnianiu wysp trzustkowych. Jednak mniej oczyszczone kolagenazy są w stanie osiągnąć podobny efekt. W związku z tym możliwe jest stosowanie różnych dostępnych na rynku preparatów enzymatycznych do trawienia trzustki, o ile warunki trawienia są zoptymalizowane w celu osiągnięcia wysokiej jakości wysp trzustkowych, wydajności i czystości.
2. Możliwe jest również trawienie trzustki bez przewodowej perfuzji enzymu. Dostarczanie liberazy przez wspólny przewód żółciowy pozwala na maksymalne narażenie powierzchni trzustki na działanie enzymu. Powoduje to bardziej równomierne trawienie trzustki i większe uwalnianie nienaruszonych wysp trzustkowych. Można jednak zastosować inne kroki w celu zwiększenia powierzchni trzustki dla enzymu. Na przykład rozdrobnienie trzustki przed inkubacją w Liberazie lub bezpośrednie wstrzyknięcie Liberazy przez torebkę trzustkową może być wykorzystane do wyizolowania wysp trzustkowych. Jednak żadna inna metoda dostarczania Liberazy nie jest tak skuteczna jak perfuzja przez wspólny przewód żółciowy. Dlatego mielenie lub bezpośrednie wstrzyknięcie należy zachować w ostateczności, jeśli wspólny przewód żółciowy jest uszkodzony i nie jest przepuszczalny.
3. Alternatywna metoda oddzielania wysp trzustkowych od komórek zewnątrzwydzielniczych polega na zastosowaniu gradientu FSD zamiast Histopaque1077 ¹⁰. Skuteczne oddzielenie wysp trzustkowych od komórek zewnątrzwydzielniczych w tym protokole wynika częściowo z różnicy gęstości między tymi dwoma typami komórek. Histopaque1077 ma gęstość 1,0771 g/ml w temperaturze 25°C. W tej temperaturze histopaque jest gęstszy niż wysepki, ale mniej gęsty niż komórki zewnątrzwydzielnicze. Dlatego pod wpływem siły wirowania Histopaque1077 granuluje komórki zewnątrzwydzielnicze, jednocześnie unosząc wysepki na powierzchnię. W zasadzie na tym etapie można zastosować każdą inną substancję o gęstości pozwalającej oddzielić wyspy trzustkowe od komórek zewnątrzwydzielniczych, a gradient FSD jest jedną z takich substancji.
4. Jeśli chodzi o miejsce przeszczepienia wysp trzustkowych, torebka nerkowa zastosowana w tym protokole jest jednym z niewielu możliwych miejsc. Podczas gdy podtorebka nerki jest najczęściej zgłaszanym miejscem przeszczepu u myszy, inne miejsca przeszczepu okazały się skuteczne i obejmują żyłę wrotną wątroby, przestrzeń podsiatkówkową, jądra, poduszeczkę tłuszczową najądrza, śledzionę, a nawet trzustkę ^11-14. Każda z tych lokalizacji ma swoje zalety i wyzwania. W związku z tym wybór miejsca do przeszczepu wysp trzustkowych powinien być uzależniony od poruszonych pytań i szczególnych okoliczności eksperymentów.

Uważa się, że strategie, które mogą przezwyciężyć ograniczenia związane z przeszczepianiem wysp trzustkowych, znacznie zwiększą ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym wykorzystanie modelu mysiego, jak opisano w tym protokole, stanowi atrakcyjne podejście do identyfikacji takich strategii.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik RPMI 1640		GIBCO, firmy Life Technologies	31800-022
Odczynnik Liberase TL		Roche Group	05401020001
Odczynnik do płodowej surowicy bydlęcej		GIBCO, firmy Life Technologies	10437-028
Histopaque1077	Odczynnik	Sigma-Aldrich	10771
Penicylina Streptomycyna	Odczynnik	GIBCO, firmy Life Technologies	15140
Odczynnik cytrynianu sodu		Sigma-Aldrich	S4641
Odczynnik Streptozotocyny		Sigma-Aldrich	S-0130
HCl	Odczynnik	Fisher Scientific	A144-212
Odczynnik izofluranu		Vedco, Inc.	ISOSOL
Szklane rurki kapilarne		Sprzęt Fisher Scientific	22362574
Sprzęt do strzykawek do insuliny		BD Biosciences	329461
Sprzęt do igieł strzykawkowych o rozmiarze 27		BD Biosciences	305109
Strzykawka Hamilton #1702	Sprzęt	Fisher Scientific	14813133
10cm Płytki Petriego	Sprzęt	Fisher Scientific	0875712
6cm Płytki Petriego	6cm Sprzęt	Fisher Scientific	07770212
6-0	Sprzęt	Ethicon Inc.	8726H
PE 50 Elastyczny	sprzęt	Fisher Scientific NC9083963
5 ml Jednorazowy sprzęt do strzykawek		BD Biosciences	309603
50 ml Sprzęt do rurek stożkowych		BD Biosciences	352098
15 ml Stożkowa rurka		Biosciences	352097
0,1 mm Nylon Sprzęt siatkowy		Fisher Scientific	22363549
0,419 mm Sprzęt z siatki drucianej		Newark Wire Cloth Company	0300241
Sprzęt	inkubatora kąpieli wodnej	Fisher Scientific	15-462-5
Sprzęt	do mikroskopu preparacyjnego	Carl Zeiss, Inc.	Stemi SV6
Sprzęt do mikroskopu odwróconego		Instrumenty Nikon Sprzęt	tkankowych TMS
Nożyczki do preparowania
McPherson-Vannas Sprzęt do nożyczek		Kent Scientific	INS500260
Sprzęt do zakrzywionych kleszczy		Kent Scientific	INS15915
Sprzęt do kleszczy hemostatycznych		Kent Scientific	INS 500451
Sprzęt do nebulizatora izofluranu		Smiths Medical	ISOTech 4 OHMEDA
		Dupont – Sorvall	RT6000D
Wirnik łyżki huśtawki		Dupont – Sorvall	H1000B
Miernik pH	Sprzęt	Mettler Toledo	09313509
Końcówki do ładowania żelu		Fisher Scientific	05408151
p200	Tips Equipment	USA Scientific, Inc.	111-0730