Artykuł metodologiczny

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2097

⸱

3 września 2010

 , 
1Department of Chemistry, George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Streszczenie

Metody jonizacji w atmosferze w spektrometrii mas pozwalają na prowadzenie badań analitycznych bezpośrednio na tkance lub biofilmie w warunkach eksperymentalnych zbliżonych do naturalnych. Jonizacja przez rozpylanie elektrosprayowe z ablacji laserowej (LAESI) jest jedną z takich metod i jest szczególnie odpowiednia do badania próbek zawierających wodę. LAESI wykorzystuje wiązkę lasera średniej podczerwieni (długość fali 2,94 μm) do wzbudzenia cząsteczek wody w próbce. Po przekroczeniu progu gęstości energii ablacji materiał próbki jest wyrzucany w postaci cząsteczek, które przemieszczają się na odległość kilkunastu milimetrów powyżej powierzchni próbki. W metodzie LAESI pióropusz ablacyjny ten jest przechwytywany przez silnie naładowane kropelki, aby przechwycić część wyrzuconego materiału próbki i przekształcić jego składniki chemiczne w jony w fazie gazowej. Do analizy i rejestracji składu uwalnianych jonów pochodzących z badanego obszaru (piksela) próbki wykorzystuje się spektrometr mas wyposażony w interfejs źródła jonów pracującego pod ciśnieniem atmosferycznym. Systematyczna analiza układu pikseli umożliwia obrazowanie molekularne w trybie mikroanalizy. Unikalnym aspektem obrazowania spektrometrycznego LAESI jest profilowanie głębokości, które w połączeniu z obrazowaniem bocznym pozwala na trójwymiarowe (3D) obrazowanie molekularne. Przy obecnej rozdzielczości bocznej i głębokości wynoszących odpowiednio ~100 μm i ~40 μm, obrazowanie spektrometryczne LAESI pomaga badać strukturę molekularną tkanek biologicznych. W niniejszym opracowaniu omawiamy główne elementy systemu LAESI i przedstawiamy wytyczne dla udanego eksperymentu obrazowania.

Protokół

Poniższy protokół opisuje główne etapy eksperymentu z wykorzystaniem laserowej ablacji z jonizacją przez elektrospray (LAESI) oraz przedstawia reprezentatywne przykłady obrazowania bocznego i trójwymiarowego (3D) dla próbek tkanek zwierzęcych i roślinnych. Dodatkowe szczegóły eksperymentalne i techniczne można znaleźć w innych źródłach.1-6

1. Przygotowanie i montaż tkanki

  1. Jeśli wymagane jest cięcie, należy użyć kriomikrotomu do przygotowania skrawków tkanki o grubości 10-100 μm w temperaturze od -10 do -20 °C, chyba że dla danego rodzaju tkanki zalecane są inne warunki.
  2. Należy zamontować skrawki na płaskiej powierzchni (np. chemicznie oczyszczonym szkiełku przedmiotowym) bezpośrednio, bez użycia modyfikatorów chemicznych. W przypadku tkanek ciętych, skrawki należy montować metodą rozmrażania (thaw-mounting) i niezwłocznie po tym procesie przymocować uchwyt próbki do stolika chłodzącego Peltiera, aby tkanka pozostawała zamrożona przez cały czas trwania analizy. Krok ten jest niezbędny w celu zminimalizowania lub zapobiegania migracji molekularnej w skrawku.
  3. W razie potrzeby należy zastosować radiator z wentylatorem o niskiej mocy, aby ułatwić odprowadzanie ciepła ze stolika Peltiera i utrzymać tkankę w stanie zamrożonym.
  4. W wilgotnym środowisku, przy dłuższym czasie ekspozycji (1-2 godziny), należy kontrolować, czy na powierzchni tkanki nie tworzy się kondensat wody lub lód. Kondensacja wody na tkance negatywnie wpływa na jakość obrazowania w eksperymentach LAESI.1
  5. Jeśli jest to konieczne, należy użyć osuszacza powietrza lub umieścić schłodzoną próbkę w komorze środowiskowej wypełnionej gazem obojętnym (np. suchym azotem), aby zapobiec kondensacji.1

2. Optymalizacja źródła jonów LAESI

Źródło jonów LAESI składa się z lasera średniej podczerwieni, szeregu elementów optycznych do kierowania i ogniskowania światła, a także dodatkowych uchwytów na próbki, komponentów chłodzących, stołów translacyjnych oraz systemu podawania rozpuszczalnika. Rycina 1 przedstawia typowy układ tych elementów względem wlotu źródła jonów ciśnieniowych atmosferycznych spektrometru mas.

  1. Zgodnie z ilustracją na Rysunku 1, umieść próbkę 15-20 mm poniżej otworu stożka próbkowania spektrometru mas (dOR-FP).
  2. Uruchom laser średniej podczerwieni o długości fali 2,94 μm i częstotliwości powtarzania 10 Hz. Osłab moc wyjściową lasera do energii ~100 μJ/impuls.
  3. Użyj zestawu luster złotych i soczewki skupiającej przezroczystej dla długości fali lasera (np. soczewki plano-konweksowej z CaF2 lub ZnSe), aby wprowadzić energię impulsu laserowego do próbki pod kątem prostym (patrz kąt padania względem powierzchni próbki po prawej stronie na Rysunku 1).
  4. Ustaw oś wiązki średniej podczerwieni 5-8 mm przed otworem stożka próbkowania spektrometru mas.
  5. Dostosuj położenie soczewki skupiającej oraz energię impulsu wiązki lasera, aby uzyskać usuwanie tkanki w plamce ogniskowania. Wymiary objętości ablacyjnej określają rozmiar piksela (lub voksela w obrazowaniu trójwymiarowym) dla zastosowań obrazowania.
  6. Umieść emiter nanospray w linii z osią wlotową spektrometru mas, w odległości ~10 mm od otworu do końcówki emitera (patrz Rysunek 1).
  7. Do rozpylania elektrostatycznego przygotuj 50% roztwór metanolu z dodatkiem 0,1% kwasu octowego lub 0,1% octanu amonu dla odpowiednio dodatniego lub ujemnego trybu jonów. W zależności od próbki, metanol można zastąpić innymi rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak acetonitryl, izopropanol itp., w stężeniach odpowiednich dla danego zadania analitycznego. Stabilność rozpylania elektrostatycznego jest kluczowa dla pomyślnego obrazowania. W zależności od wyboru rozpuszczalnika, należy dostosować szybkość przepływu i napięcie rozpylania, aby uzyskać stabilny strumień.
  8. W przypadku reaktywnego LAESI6 w zastosowaniach obrazowania, roztwór rozpylany elektrostatycznie może zawierać substraty.
  9. Użyj pompy strzykawkowej do podawania roztworu rozpylania elektrostatycznego przez emiter z szybkością przepływu ~300 nL/min.
  10. Jeśli otwór spektrometru mas jest utrzymywany pod niskim napięciem (<500 V względem masy), wywołaj rozpylanie elektrostatyczne poprzez przyłożenie wysokiego napięcia bezpośrednio do emitera (np. 3000 V) lub poprzez złączkę metalową. W przeciwnym razie uziem bezpośrednio emiter lub złączkę metalową, aby zainicjować rozpylanie elektrostatyczne.
  11. Uruchom źródło rozpylania elektrostatycznego w trybie cone-jet, aby zapewnić najefektywniejszą generację jonów metodą LAESI. Wpływ zmiennych operacyjnych na tryby rozpylania oraz ich wpływ na widma masowe opisano w innych publikacjach.5,7,8
  12. Ostrożnie dostosuj wzajemne odległości w układzie LAESI, aby zoptymalizować wydajność jonową LAESI, utrzymując osie wiązki lasera, emitera i otworu w tej samej płaszczyźnie. Szczegółowe instrukcje znajdują się w innych źródłach.5
  13. Za pomocą mikroskopu optycznego określ wymiary poprzeczne krateru ablacyjnego na próbce.
  14. W przypadku eksperymentów z trójwymiarowym obrazowaniem LAESI, przeprowadź ablację pojedynczymi impulsami i określ głębokość voksela, wykorzystując na przykład tryb z-stack w mikroskopii optycznej.3

3. Obrazowanie molekularne i analiza danych

W eksperymencie obrazowania próbka tkanki jest przemieszczana w płaszczyźnie ogniskowej lasera w kierunkach X i Y z wielkością kroku większą lub równą wymiarom plamki ablacji. Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez ogniskowanie padającej wiązki laserowej.

  1. Wybierz obszar zainteresowania na powierzchni próbki i określ współrzędne (X, Y) odpowiadających mu granic.
  2. Wybierz algorytm siatkowania (np. siatka adaptacyjna, obrazowanie wybranego regionu, siatka prostokątna, wzór spiralny, skanowanie Z itp.), za pomocą którego powierzchnia próbki zostanie przeskanowana rastrowo z wybranym czasem ekspozycji dla każdego piksela w obrazowanym obszarze.
  3. Użyj trójosiowego stołu translacyjnego oraz oprogramowania zdolnego do rastrowania próbki zgodnie z predetermined siatką.
  4. Oblicz całkowity czas wymagany do wykonania obrazowania.
  5. Wyłącz limit czasu akwizycji danych spektrometru mas. Jeśli nie jest to możliwe, ustaw limit czasu akwizycji danych na obliczoną wartość czasu obrazowania.
  6. Uruchom źródło lasera średniofalowego podczerwieni z częstotliwością repetycji odpowiednią do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu w widmie masowym w czasie ekspozycji dla każdego piksela podczas eksperymentu obrazowania bocznego LAESI. W przypadku obrazowania molekularnego 3D zastosuj szybkość akwizycji widm wyższą niż częstotliwość repetycji źródła lasera, aby pomyślnie przeprowadzić analizę masową jonów generowanych w obrębie jednego impulsu laserowego. Czekaj na sygnał START w celu zainicjowania sekwencji ablacji.
  7. Włącz źródło elektrospray. Upewnij się, że znajduje się wystarczająca ilość roztworu na cały czas wymagany do obrazowania.
  8. Jednocześnie URUCHOM (START) akwizycję widm masowych, ablację laserem średniofalowym IR oraz skanowanie powierzchni.
  9. Po zakończeniu procesu obrazowania ZATRZYMAJ (STOP) skanowanie powierzchni, działanie lasera średniofalowego IR oraz akwizycję danych.
  10. Wyłącz źródło lasera.
  11. Wyłącz wysokie napięcie.
  12. Wyłącz pompę strzykawkową.
  13. Ustaw spektrometr mas w tryb czuwania (STANDBY).
  14. Wyłącz elektronikę chłodzenia Peltiera.
  15. Zamknij przepływ gazu obojętnego, jeśli był stosowany.
  16. Użyj oprogramowania do powiązania współrzędnych bezwzględnych pikseli w obrazowaniu bocznym lub wokseli w analizie 3D z odpowiadającymi im widmami.
  17. Przedstaw sygnał intensywności jonów dla wybranej wartości m/z w funkcji współrzędnych bezwzględnych analizy, aby uzyskać boczne i trójwymiarowe obrazy molekularne.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki dla kilku głównych typów tkanek i modalności obrazowania. Panel A ukazuje przypadek przekroju tkanki zwierzęcej, która została zamrożona podczas eksperymentu w celu zapobieżenia odwodnieniu.1 Dodatkowo próbkę umieszczono w środowisku suchego azotu, aby uniknąć kondensacji pary wodnej z otoczenia na powierzchni próbki. Przekrój czołowy mózgu szczura (Rattus norvegicus) o grubości 100 µm został obrazowany bocznie za pomocą LAESI. Regiony anatomiczne mózgu (patrz obraz optyczny w panelu A) wykazują dobrą korelację z obrazem molekularnym uzyskanym dla plazmalogenów PC(O-33:3) i/lub PE(O-36:3) o m/z 728.559.

Panel B przedstawia obrazowanie 3D LAESI tkanki liścia rośliny Zebra (Aphelandra squarrosa). Ponieważ liście posiadają naturalny mechanizm obronny przed odwodnieniem, próbkę można było badać w warunkach otoczenia.3 Uzyskane trójwymiarowe obrazy molekularne ujawniły różnorodne wzorce rozmieszczenia metabolitów pierwotnych i wtórnych. Wśród nich akacetyna o m/z 285.076 została wykryta przy wyższych liczbach jonów w żółtych sektorach drugiej i trzeciej warstwy od góry, natomiast w pozostałych wykazano rozkład jednorodny. Rozmieszczenie to było zgodne ze wzorem ubarwienia widocznym na obrazie optycznym.

Schemat układu wzbudzenia optycznego z wykorzystaniem lasera IR do pomiaru absorpcji przejściowej przy 2,94 μm.
Rycina 1. Schemat systemu LAESI (ES, końcówka emitera elektrospray; OR, otwór stożka pobierającego spektrometru mas; FL, soczewka skupiająca; FP, punkt ogniskowania; P, ogniwo chłodzące Peltiera; HS, radiator). Część materii cząsteczkowej wyrzuconej podczas ablacji w średniej podczerwieni (czerwone kropki) łączy się z elektrosprayem, tworząc naładowane kropelki zaszczepione cząsteczkami i jonami próbki (zielone kropki). Jony uwalniane z tych kropelek są analizowane i rejestrowane przez spektrometr mas.

Obrazowanie spektrometrią mas, m/z 728,559, analiza sekcji tkankowej; 3D mapa mikrostruktury powierzchni rośliny.
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki obrazowania bocznego i 3D z wykorzystaniem spektrometrii mas LAESI. (A) Górny panel przedstawia obraz optyczny przekroju koronarnego mózgu szczura (Rattus norvegicus) oraz obraz molekularny uzyskany dla plazmalogenów PC(O-33:3) i/lub PE(O-36:3) o m/z 728,559. Biały pasek skali odpowiada 1 mm. Adaptowano za zgodą z (Referencja 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Dolny panel pokazuje obrazowanie 3D liścia pantery (Aphelandra squarrosa). Akacetyna o m/z 285,076 została wykryta przy wyższych liczbach jonów w żółtych sektorach drugiej i trzeciej warstwy od góry, przy jednoczesnym jednorodnym rozkładzie w pozostałych. Przedrukowano za zgodą z (Referencja 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

Dyskusja

Różne rodzaje tkanek wykazują zróżnicowaną zawartość wody i wytrzymałość na rozciąganie, co z kolei może wpływać na charakterystykę ablacji próbek.9 Aby zniwelować te efekty, zaleca się modyfikację fluencji laserowej, sposobu manipulacji próbkami oraz protokołów analitycznych przy zmianie głównego rodzaju tkanek.

W przypadku badań pojedynczych komórek lub analiz o wyższej rozdzielczości, światło w średniej podczerwieni można wprowadzić do zaostrzonego światłowodu zamiast przez soczewkę skupiającą.10 Dzięki umieszczeniu końcówki światłowodu w bliskim sąsiedztwie wybranych komórek w tkance, analizę LAESI można przeprowadzić na poziomie pojedynczej komórki.

Jako bezznakowe źródło jonów dla spektrometrii mas z jonizacją w warunkach otoczenia,11 LAESI wykazuje duży potencjał w badaniu procesów biochemicznych w tkankach. Dzięki dodatkowym zaletom, takim jak analiza bezpośrednia oraz obrazowanie boczne i 3D, LAESI staje się rozwijającym się narzędziem bioanalitycznym zarówno w zastosowaniach profilowania, jak i obrazowania.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe tej pracy udzielone przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (National Science Foundation) w ramach grantu nr 0719232, amerykański Departament Energii (DEFG02-01ER15129) oraz firmę Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Autorzy chcieliby również podziękować Jessica A. Stolee za pomoc podczas nagrywania wideo protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrometr masWatersQ-TOF Premier
Laser w średniej podczerwieni (Mid-IR)Opotek Inc. (Carlsbad, CA)Vibrant IR

Bibliografia

  1. Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 82, 982-988 (2010).
  2. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  3. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  4. Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. Methods in Molecular Biology. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).
  6. Shrestha, B. Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry. Analyst. 135, 751-758 (2010).
  7. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).
  8. Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization. Anal Chem. 80, 387-395 (2008).
  9. Vertes, A. Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry. Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).
  10. Shrestha, B., Vertes, A. In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).
  11. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566-1570 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Jonizacja otoczeniaablacja laserowajonizacja elektrorospryskowyprofilowanie g boko cioweobrazowanie 3D
Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.