Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
WSTĘP: Czynniki regulacyjne i szczegółowa fizjologia mikrokrążenia in vivo nie zostały w pełni wyjaśnione, mimo opracowania wielu różnych metod obrazowania. Choć wiele makroskopowych parametrów przepływu krwi odzwierciedla prędkość przepływu, to w obserwacjach mikroskopowych zmiany prędkości przepływu krwi i strumienia erytrocytów (RBC) nie wykazują liniowej zależności. Istnieją doniesienia o rozbieżnościach między prędkością a strumieniem RBC, między strumieniem RBC a objętością przepływu osocza, a także o przestrzennej i czasowej heterogeniczności regulacji przepływu w tkankach obwodowych w obserwacjach mikroskopowych, co stanowi naukową podstawę dla konieczności przeprowadzenia bardziej szczegółowych badań nad regulacją mikrokrążenia z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej.
METODY: Zmodyfikowaliśmy metodę Jeffa Lichtmana dotyczącą mikroskopowej obserwacji in vivo mięśni mostkowo-obojczykowo-sutkowych myszy. Myszy poddaje się znieczuleniu, wentylacji oraz wstrzykuje im RBC znakowane fluorescencyjnie PKH26L w celu przeprowadzenia obserwacji mikroskopowej.
WYNIKI I WNIOSKI: Erytrocyty znakowane fluorescencyjnie są dobrze wykrywane i rozróżniane za pomocą mikroskopu szerokopolowego. Skurcz mięśnia wywołany stymulacją elektryczną doprowadził do zwiększenia przepływu erytrocytów. Możliwa była kwantyfikacja innych parametrów, w tym prędkości erytrocytów oraz gęstości naczyń kapilarnych. Myszy dobrze zniosły zabieg chirurgiczny, wstrzyknięcie znakowanych erytrocytów, obserwację mikroskopową oraz stymulację elektryczną. Nie zaobserwowano uszkodzeń mięśni ani naczyń krwionośnych, co sugeruje, że nasza metoda jest stosunkowo mniej inwazyjna i odpowiednia do długoterminowych obserwacji.
Protokół
Barwienie błony RBC
- Erytrocyty mysie pobrano od myszy tego samego szczepu z zastosowaniem heparynyzacji.
- Erytrocyty mysie barwiono barwnikiem PKH26 (551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit, Sigma, U.S.A.).
- Erytrocyty przemyto w PBS i inkubowano z 2μM roztworem barwnika PKH26 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano poprzez dodanie osocza (wcześniej inaktywowanego termicznie przez 1 godzinę w 65°C) i inkubowano przez 1 minutę.
- Zbarwione erytrocyty przemyto 5 razy w PBS.
Przygotowanie myszy
- W badaniu wykorzystano samce myszy szczepu C57BL/10 w wieku od trzech do sześciu miesięcy. Myszy znieczulono poprzez dożylne wstrzyknięcie pentobarbitalu (50mg/kgBW).
- Następnie myszy intubowano rurką polietylenową o rozmiarze 20-gage, podłączono do wentylatora mechanicznego i ogrzewano w temperaturze 37°C na grzejniku z folii Kapton połączonym z czujnikiem termopary i systemem regulatora temperatury z pętlą sprzężenia zwrotnego.
- Ogolono brzuszna stronę szyi. Obnażono prawe i lewe mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe. Mięśnie unieruchomiono w uchwycie ze stali nierdzewnej i poddano superfuzji sterylnym roztworem Krebsa-Ringera.
Wstrzyknięcie
- Barwione erytrocyty ogrzano do 37°C, a następnie rozcieńczono w roztworze Krebsa-Ringera. 50µL barwionych erytrocytów (hematokryt 12%) wstrzyknięto myszy przez żyłę prącia.
Mikroskopowa obserwacja mięśni szkieletowych in vivo
Zastosowaliśmy metodę Jeffa W. Lichtmana z wprowadzonymi modyfikacjami1:
- Zwierzęta umieszczono na podgrzewaczu na ręcznie wykonanym żelaznym stoliku mikroskopu Nikon Eclipse-800. Do obserwacji epi-fluorescencyjnych na żywo wykorzystano obiektywy zanurzeniowe. Obserwowano przepływ RBC barwionych PKH26 wewnątrz naczyń pod światłem fluorescencyjnym lampy rtęciowej. Tętniczki pierwszorzędowe, tętniczki drugorzędowe, kapilary i żyły zidentyfikowano na podstawie kierunku przepływu RBC oraz ich architektury.
- Zainstalowano wzmocnioną kamerę SIT (Hamamatsu Photonics, C2400, Japonia) oraz moduł przechwytywania klatek wideo w celu rejestracji słabego sygnału w czasie rzeczywistym z prędkością 30 klatek na sekundę. Obrazy zapisano na płytach DVD w formie plików wideo.
Stymulacja mięśni
- Impuls elektryczny generowano za pomocą stymulatora nerwów obwodowych (Innervator 252, Fisher & Paykel Healthcare, Nowa Zelandia) i przekazywano na powierzchnię mięśnia za pomocą powlekanej sondy ze stali nierdzewnej. Ujemny koniec sondy umieszczono w części proksymalnej mięśnia, a koniec dodatni w części dystalnej mięśnia. Stymulację tężcową stosowano z częstotliwością 50Hz przez 5 sekund. Bodźce elektryczne nie spowodowały bezpośredniego uszkodzenia włókien mięśniowych w obrębie obszaru kontaktu.
Analiza przepływu RBC
- Zarejestrowane obrazy wideo z DVD przeniesiono do plików obrazów Video Savant za pomocą oprogramowania do przechwytywania klatek (Video Savant, USA). Obrazy wideo przeglądano z dostosowaną prędkością w celu wizualizacji poszczególnych barwionych RBC. Strumień RBC mierzono, licząc liczbę RBC przepływających przez skupioną arteriolę pierwszego rzędu w ciągu minuty.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe punkty techniczne są następujące: (1) utrzymanie stanu fizjologicznego zwierzęcia (wentylacja, pH roztworu perfuzyjnego, temperatura ciała), (2) objętość wstrzykniętych barwionych RBC oraz (3) warunki obserwacji (optymalny dobór obiektywu, intensywność fluorescencji). Potencjalne przyszłe zastosowania obejmują: (a) połączenie z interwencjami farmakofizjologicznymi i/lub biologii molekularnej, (b) długoterminową obserwację arterio-/arteriolosklerozy oraz neowaskularyzacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkie procedury związane z doświadczeniami na zwierzętach zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Subcommittee on Research Animal Care) w Massachusetts General Hospital.
Podziękowania
Dziękujemy JW Lichtmanowi za porady dotyczące obserwacji mięśni in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| barwnik PKH26 | Sigma-Aldrich | 551/567 nm; Zestaw do znakowania komórek czerwonym fluorescencyjnym łącznikiem | ||
| myszy C57BL/10 | Zwierzę | Samce w wieku od trzech do sześciu miesięcy | ||
| pentobarbital | środek znieczulający, 50mg/kgBW, i.p. |
Bibliografia
- Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
