Artykuł metodologiczny

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2102

⸱

14 sierpnia 2010

 ,  ,  , 
1Department of Brain and Cognitive Sciences, University of Rochester, 2Center for Visual Science, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Streszczenie

W niniejszej pracy opisujemy zmodyfikowaną wersję podwójnej fluorescencjiin situmetoda hybrydyzacji (dFISH) zoptymalizowana pod kątem wykrywania dwóch wybranych mRNA w świeżych mrożonych przekrojach mózgu. Nasz zespół z sukcesem zastosował to podejście do badania koregulacji genów. Bardziej szczegółowo, metoda dFISH została przez nas wykorzystana do badania organizacji anatomicznej, właściwości neurochemicznych oraz wpływu doświadczeń sensorycznych w ośrodkowych obwodach sensorycznych z rozdzielczością pojedynczych komórek. Protokół ten został zwalidowany w tkance mózgowej myszy, szczurów i ptaków śpiewających, jednak można go łatwo dostosować do innych gatunków kręgowców, a także do wielu rodzajów tkanek pozanerwowych. W tym filmie przedstawiamy szczegółową demonstrację głównych etapów tej procedury.

Protokół

Niniejszy protokół został opracowany i dopracowany na podstawie standardowych radiacyjnych i nieradiacyjnych metod hybrydyzacji in-situ, wcześniej opracowanych przez nas oraz innych autorów w celu wykrywania jednego lub dwóch gatunków transkryptów w tkance mózgowej 1-7. Opisany poniżej protokół trwa łącznie 2 lub 3 dni, w zależności od liczby przerw proceduralnych wybranych przez użytkownika końcowego. Wszystkie szczegółowo opisane poniżej etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem etapu hybrydyzacji sondy ryboprobowej oraz przemywań po hybrydyzacji. Roztwory i bufory wymagane do wszystkich etapów tej metody znajdują się na końcu niniejszego protokołu.

1. Przygotowanie i krojenie tkanek

  1. Należy szybko przeprowadzić dekapitację i wyekstrahować mózg obiektu, a następnie umieścić go w plastikowej formie o odpowiednim rozmiarze.
  2. Przykryć mózg medium do zatapiania Tissue-Tek i szybko umieścić plastikową formę w kąpieli z suchego lodu i alkoholu w celu szybkiego zamrożenia. Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
  3. Za pomocą kriosztatu nanieść 2 lub 3 przekroje mózgu na jeden naładowany szkiełko Superfrost Plus. Grubość przekrojów powinna wynosić 10-12 μmPreparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80°C do momentu użycia.

2. Przygotowanie kolumn Sephadex G50 do oczyszczania sond

„Kolumny Sephadex można nabyć z komercyjnych źródeł, jednak poniżej przedstawiamy niskokosztową alternatywę dla przygotowania kolumn, które będą niezbędne do oczyszczania sond”.

  1. Nawilżyć odpowiednią ilość proszku Sephadex G50 wodą wolną od RNaz, traktowaną DEPC (na przykład 2 g proszku w 10 ml wody traktowanej DEPC), krótko wymieszać roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, aby wytrącić nadmiar Sephadex G50.
  2. Usunąć nadsącz (górną warstwę wody) po wytrąceniu Sephadex G50.
  3. Powtórzyć powyższy proces 3-5 razy.
  4. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić roztwór Sephadex G50 w buforze TE (w stosunku 1:1) i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.
  5. Umieścić autoklawowaną watę szklaną w sterylnej strzykawce 1 ml i ścisnąć ją tłokiem, aby utworzyć zwartą warstwę na dnie, a następnie umieścić strzykawkę w probówce Falcon 15 ml.
  6. Dokładnie wymieszać roztwór Sephadex G50 w buforze TE. Wypełnić strzykawkę/kolumnę tym roztworem.
  7. Wirurować kolumnę przez 30 sec przy 10 rpm.
  8. Powtarzać tę procedurę, aż kolumna zostanie niemal całkowicie wypełniona granulkami Sephadex G50.
  9. Nanieść na kolumnę 20 μl buforu do płukania kolumny i wirować przez 2 min przy 100 rpm. Odrzucić przefiltrowany płyn.
  10. Nanieść na kolumnę 20 μl buforu blokującego kolumnę i wirować przez 2 min przy 10 rpm. Powtórzyć ten krok 4-5 razy, aby zrównoważyć kolumnę. Kolumny można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia, jeśli zostaną uszczelnione Parafilmem.

3. Labellowanie i oczyszczanie ryboprob

Poniżej szczegółowo opisano generowanie i oczyszczanie pojedynczej sondy rybonukleotydowej (riboproby). W przypadku dFISH przygotowanie każdej sondy będzie przebiegać według tej samej metodologii, z wyjątkiem tego, że jedna z sond zostanie znakowana UTP z digoksygeniną (DIG), a druga UTP z biotyną.

  1. Przygotuj stężony (> 150 ng/μl) i oczyszczony roztwór zlinearyzowanego cDNA, aby wygenerować sondy ryboprobowe typu sens (kontrolne) lub antysens.
  2. Do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 0,5-1 μg oczyszczonej matrycy cDNA, 2 μl buforu do znakowania sondy 5X, 1 μl mieszanki do znakowania DIG (lub biotyny) 10X, 0,5 μl RNasiny oraz 1 μl odpowiedniej polimerazy RNA, a następnie uzupełnij objętość końcową roztworu do 10 μl wodą wolną od RNaz (traktowaną DEPC).
  3. Inkubuj roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 2 h.
  4. Dodaj do roztworu 1 μl tRNA (stok; 20 μg/μl) oraz 39 μl buforu blokującego kolumnę.
  5. Przygotuj kolumnę Sephadex G50 do oczyszczania sondy. W tym celu dodaj do kolumny 50 μl buforu blokującego i wiruj przez 10 s przy 10 rpm.
    Powtórz ten krok 2-3 razy, aby zrównoważyć kolumnę (tj. do momentu, gdy pełna objętość 50 μl naniesiona na kolumnę zostanie odzyskana po cyklu wirowania).
  6. Nanieś roztwór sondy na kolumnę Sephadex G50, umieść nową probówkę mikroodśrodkową u podstawy kolumny i wiruj przez 3 min przy 10 rpm, aby otrzymać 50 μl oczyszczonego roztworu ryboproby.
  7. Oceń jakość i wydajność znakowanej ryboproby, używając standardowego żelu RNA agaroza-formaldehyd lub spektrofotometru.

4. Postfiksacja, acetylacja i hybrydyzacja

  1. Wyjmij skrawki z zamrażarki -80°C i pozostaw je do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. Następnie inkubuj skrawki w zimnym, świeżo przygotowanym 3% roztworze paraformaldehydu przez 5 min.
  2. Krótko przemyj skrawki dwukrotnie w roztworze solistropowej PBS.
  3. Odwodnij skrawki w standardowej serii alkoholi (70%, 95% i 10%; po 2 min w każdym), a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  4. Inkubuj skrawki w roztworze acetylującym przez 10 min.
  5. Przemyj skrawki 3 razy w 2X SSPE.
  6. Ponownie odwodnij skrawki w opisanej powyżej standardowej serii alkoholi i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  7. Przygotuj odpowiednią objętość roztworu do hybrydyzacji i dodaj do niego obie sondy rybowe (stężenie sondy: 1 ng/μl dla każdej sondy). Całkowita objętość roztworu do hybrydyzacji jest określana na podstawie liczby skrawków do hybrydyzacji (16 μl roztworu do hybrydyzacji na skrawek).
  8. Nanieś odpowiednią objętość roztworu do hybrydyzacji na tkankę oraz szkiełka nakrywkowe, upewniając się, że na tkance nie pozostały pęcherzyki powietrza.
  9. Umieść szkiełka w metalowym uchwycie. Zanurz uchwyt w kąpieli olejowej z oleju mineralnego w temperaturze 65°C na noc. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są skierowane do góry (tj. boczna część uchwytu do szkiełek powinna stykać się z dnem pojemnika z olejem mineralnym).

5. Przemywanie po hybrydyzacji

  1. Następnego dnia ostrożnie wyjmij uchwyt do szkiełek z kąpieli w oleju mineralnym i krótko opłucz go w chloroformie, aby usunąć nadmiar oleju z szkiełek.
  2. Umieść szkiełka w roztworze 2X SSPE na 5-10 min. Szkiełka coverlips powinny oddzielić się od szkiełek przedmiotowych podczas przebywania w roztworze.
  3. Przenieś szkiełka do nowego roztworu 2X SSPE i pozostaw je na 1 hr w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieś skrawki do roztworu zawierającego 2X SSPE oraz 50% formamid. Temperatura tego roztworu powinna odpowiadać temperaturze zastosowanej w nocnej procedurze hybrydyzacji. Pozostaw szkiełka w tym roztworze na 1,5 hr.
  5. Przenieś skrawki do roztworu 0,1X SSPE uprzednio podgrzanego do temperatury stosowanej na etapie hybrydyzacji. Inkubuj skrawki w tym roztworze przez 30 min. Powtórz ten krok przez kolejne 30 min.

6. Detekcja i wizualizacja ryboprobes

  1. Przenieś preparaty na szkiełkach do buforu TNT z dodatkiem 0,3% nadtlenku wodoru na 10 min.
  2. Przemyj skrawki w buforze TNT, 3 razy (po 10 min każde płukanie).
  3. Używając pisaka DAKO, obrysuj obszar zawierający skrawki mózgu, tworząc wgłębienie. Należy zachować szczególną ostrożność, aby skrawki nie wyschły.
  4. Nanieś 150 μl buforu TNB na każde szkiełko i inkubuj skrawki w tym roztworze przez 30 min w komorze wilgotnej.
  5. Usuń nadmiar roztworu TNB, przechylając szkiełka.
  6. Nanieś 150 μl roztworu TNB zawierającego przeciwciało anty-DIG sprzężone z peroksydazą i przechowuj szkiełka w komorze wilgotnej przez 2 h. Stężenie przeciwciał powinno zostać określone indywidualnie dla każdego badanego transkryptu przed przeprowadzeniem dFISH.
  7. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.
  8. Nanieś 150 μl gotowego roztworu tyramidu sprzężonego z Alexa 594 na każde szkiełko i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 1 h. Roztwór ten należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.
  10. Inkubuj skrawki w buforze TNT z dodatkiem 0,3% nadtlenku wodoru przez 10-30 min.
  11. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.
  12. Nanieś 150 μl buforu TNB na każde szkiełko i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 30 min.
  13. Usuń nadmiar roztworu TNB, przechylając szkiełka.
  14. Dodaj 150 μl roztworu TNB zawierającego przeciwciało anty-biotynowe sprzężone z peroksydazą i przechowuj szkiełka w komorze wilgotnej przez 2 h.
  15. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.
  16. Nanieś na szkiełka 150 μl gotowego roztworu tyramidu sprzężonego z Alexa 488 i inkubuj skrawki przez 1 h. Roztwór ten należy przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
  17. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.
  18. Dodaj do skrawków 150 μl roztworu Hoechst (1:10 w buforze TNT) i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 2 min.
  19. Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 5 min każde płukanie.
  20. Przykryj skrawki szkiełkiem podstawowym, stosując medium montażowe kompatybilne z fluorescencją (np. Vectashield lub ProLong antifade).

7. Reprezentatywne wyniki

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające wzorce ekspresji białek; zielone i czerwone markery w komórkach.
Rycina 1. Prezentujemy tutaj reprezentatywne wyniki dFISH uzyskane w mózgu zebry fincza. Przedstawiono mikrofotografie wykonane w obrębie przyśrodkowo-guzowej części nidopallium (NCM), która jest odpowiednikiem kory słuchowej ssaków u ptaków śpiewających. Przekroje mózgu poddano hybrydyzacji z biotynylowaną sondą ryboprobową skierowaną przeciwko parwalbuminie (A), będącej markerem dla subpopulacji neuronów hamujących, oraz sondą ryboprobową znakowaną DIG skierowaną przeciwko genowi zenk (B), zależnemu od aktywności i będącemu wiarygodnym markerem neuronów aktywowanych przez śpiew. C) Nałożenie obrazów (A) i (B) ukazuje populację neuronów hamujących, które są aktywowane przez doświadczenia słuchowe. Strzałki i groty strzałek wskazują komórki znakowane wyłącznie każdą z dwóch sond ryboprobowych, a gwiazdki wskazują reprezentatywne neurony koekspresujące oba badane transkrypty. Pasek skali = 25 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół wykorzystaliśmy do badania organizacji neurochemicznej i funkcjonalnej mózgu kręgowców oraz do określenia, w jaki sposób istotne behawioralnie bodźce sensoryczne wpływają na mechanizmy genomiczne neuronów w dorosłym mózgu 8-10. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w tkance mózgowej myszy, szczurów i ptaków śpiewających, lecz przewidujemy, że protokół ten będzie łatwy do adaptacji w przypadku przekrojów mózgu uzyskanych z wielu gatunków kręgowców, a być może także z tkanek pozaneuralnych. K...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca finansowana z grantów NIH/NIDCD oraz Fundacji Schmitt dla RP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DEPCVWR internationalIC15090225substancja toksyczna
Zestaw do oczyszczania produktów PCRQiagen28104
FormaldehydVWR internationalBDH0506-4LPsubstancja toksyczna
polimeraza RNA T3Grupa Roche11031163001
polimeraza RNA T7Grupa Roche10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7,5)VWR internationalIC816124
MgCl₂2 (1 M)Sigma-Aldrich449172
Spermidyna (1 M)Sigma-AldrichS0266
mieszanina do znakowania RNA DIGGrupa RocheNC9380805
Mieszanina do znakowania RNA biotynąGrupa RocheNC9440104
RNazinaPromega Corp.N2111
BSASigma-Aldrich05491
DTTSigma-AldrichD5545
Sephadex G50VWR international95016-772
EDTAVWR international101384-758
Karta charakterystyki bezpieczeństwa (SDS)Sigma-AldrichL4390
tRNA (transferowy RNA)Invitrogen15401011
10X MOPSVWR international14221-398substancja toksyczna
ParaformaldehydVWR internationalAAAL04737-36substancja toksyczna
Wodorofosforan soduSigma-AldrichS3139
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS3264
NaOHVWR InternationalSX0600-1
TrietanoloaminaVWR internationalIC15216391
Bezwieciek octowyVWR internationalMK242002substancja toksyczna
podostre stwardniające zapalenie panencefalitVWR International82021-488
FormamidVWR internationalJT4028-1substancja toksyczna
Poly AInvitrogenPOLYA.GF
Olej mineralnyVWR internationalIC15169491
ChloroformVWR internationalBDH1109rozpuszczalnik organiczny
Dejonizowany formamidSigma-AldrichF9037substancja toksyczna
Nadtlenek wodoruVWR internationalVW36901substancja toksyczna
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Triton X-100JT BakerX198-05
anty-DIG HRPGrupa Roche11093274910
Przeciwciało antybiotynowe z peroksydaząVector LaboratoriesSP3010
TSA Alexa Fluor 594InvitrogenT20935
TSA Alexa Fluor 488InvitrogenT20932
H–chstVWR International200025-538
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
forma do zatapianiaVWR international15160-157
kriostatLeica MicrosystemsCM 1850
Szkiełko Superfrost plusVWR international89033-052

Roztwory

  1. Bufor do płukania kolumny: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0,1% SDS w 50 ml wody traktowanej DEPC.
  2. Bufor blokujący kolumnę: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA w 50 ml wody traktowanej DEPC.
  3. Bufor TNT: 60 ml 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl oraz 1,8 ml Triton X-100 w 600 ml wody traktowanej DEPC.
  4. bufor TNB: 100 mM Tris-HCl, 8,3 μg/μ1% BSA, 0,15 M NaCl i 3% Triton X-100 w wodzie traktowanej DEPC.
  5. bufor TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 oraz 1 mM EDTA, pH 7,5.
  6. Roztwór do acetylacji: 2,7 ml trietanolaminy oraz 0,5 ml bezwodnika octowego w 200 ml wody traktowanej DEPC.
  7. Roztwór do hybrydyzacji: 50% formamid, 2X SSPE, 2 μg/μtRNA-l, 1 μg/μl BSA i 1 μg/μ16 $\mu$l poly A w wodzie traktowanej DEPC. Na każdą sekcję wymagane jest 16 $\mu$l.

Bibliografia

  1. Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
  2. Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
  3. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
  4. Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
  5. Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
  6. Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
  7. Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
  8. Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
  9. Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
  10. Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
  11. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wykrywanie mRNAkoregulacja gen woczyszczanie sondprocedura hybrydyzacjimikroskopia fluorescencyjnaanaliza tkanki m zgowejrozdzielczo pojedynczych kom rekobwody sensoryczne

Powiązane artykuły