Nagrania patch clamp z neuronów siatkówki myszy w dostosowanym do ciemności preparacie plasterków

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę generowania dostosowanych do ciemności wycinków siatkówki myszy do zapisów elektrofizjologicznych.

Streszczenie

Nasze doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się, gdy pigment wzrokowy w naszych fotoreceptorach siatkówkowych absorbuje fotony energii świetlnej i inicjuje kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych, które prowadzą do zamknięcia kanałów bramkowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie komórkowej. Wynikająca z tego zmiana potencjału błonowego prowadzi z kolei do zmniejszenia ilości uwalniania neuroprzekaźników zarówno z końcówek synaptycznych pręcików, jak i czopków. Aby zmierzyć, w jaki sposób wywołana światłem zmiana potencjału błony fotoreceptora prowadzi do dalszej aktywności siatkówki, naukowcy przeprowadzili zapisy elektrofizjologiczne z preparatów plastrów siatkówki przez dziesięciolecia^1,2. W przeszłości plastry te były krojone ręcznie za pomocą żyletki na tkance siatkówki, która jest przymocowana do bibuły filtracyjnej; W ostatnich latach opracowano inną metodę krojenia, w której tkanka siatkówki jest zatapiana w agarze o niskiej temperaturze żelowania i krojona w chłodny roztwór za pomocą wibrującego mikrotomu^3,4. Preparat ten wytwarza plastry siatkówki z mniejszymi uszkodzeniami powierzchni i bardzo silnymi reakcjami wywołanymi światłem. Tutaj dokumentujemy, w jaki sposób tę procedurę można wykonać w świetle podczerwonym, aby uniknąć wybielania pigmentu wizualnego.

Protokół

1. Przygotowanie elektrod

1. Przygotuj elektrody rejestrujące i referencyjne, zanurzając je w 1M NaCl i wprowadzając między nie 15 V za pomocą fali sinusoidalnej 1 Hz przez ~ 20 s.
2. Wykonaj elektrody rejestrujące za pomocą ściągacza do mikropipet (Sutter Instruments P-97). Do pipet plastrowych należy użyć szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1.2 mm i średnicy wewnętrznej 0.69 mm (Sutter Instruments, Cat#B120-69-10). Zmierz rezystancję szeregową przez końcówkę elektrody. Na podstawie wielkości komórek docelowych należy wybrać średnicę końcówki pipety; dla ciał komórkowych o średnicy ~ 20 μm użyj ~ 5 MΩ, dla ciał komórkowych o średnicy ~ 5 μm użyj ~ 12 MΩ.
3. Przygotować elektrody uziemiające/referencyjne. Za pomocą strzykawki napełnij rurkę polietylenową o małym przekroju (Intramedic, PE205) 1 mM NaCl, który zawiera 3,5% agaru (Sigma; Nr kat. # A7002) w 1M NaCl. Umieść ten mostek agarowy na elektrodzie referencyjnej Ag/AgCl.

2. Przygotowanie rozwiązań

1. Zewnętrzny roztwór do kąpieli, pożywka Amesa zawierająca wodorowęglan (1 l): 1 butelka pożywki Amesa (Sigma; Kat# A1420), 1,9 g NaHCO₃, 7 ml penicyliny-streptomycyny (Sigma; Nr kat. # P0781), aby zapobiec rozwojowi bakterii. Dostosuj osmolarność do ~ 280 mOsm.
2. Roztwór do krojenia, pożywka Amesa zawierająca bufor pH HEPES (1 l): 1 butelka pożywki Amesa, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml penicyliny-streptomycyny. Dostosować pH do ~ 7,4 za pomocą 1M NaOH i/lub 1M HCl. Dostosuj osmolarność do ~ 280 mOsm.
3. Roztwór wewnętrzny pipety potasowo-asparaginianowej (K-Asp) (w mM): 125 K-asparaginian, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl₂, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg; pH dostosowuje się do ~ 7,3 za pomocą NMG-OH, a osmolarność dostosowuje się do ~ 280 mOsm.
4. Zabezpieczenie agarowe do stabilizacji niskiej temperatury żelowania agaroza zawierająca siatkówkę (5% wagowo), 7,5 g agaru (Sigma; Kat# A7002) stopił się w 150 ml dH₂O.

3. Dzień eksperymentu

1. Rozmrozić ~ 1,5 ml roztworu wewnętrznego K-Asp i wybrany fluorofor z zamrażarki. Rozcieńczyć fluorofor do odpowiedniego stężenia, które należy określić empirycznie.
2. Wlać pożywkę Amesa zawierającą NaHCO₃ (~ 200 ml) do światłoszczelnego pojemnika do przechowywania, a następnie umieścić w łaźni wodnej (30-32°C) i zrównoważyć z 5% gazem CO₂/95% O₂
3. Napełnij butelkę ~ 110 ml pożywki Amesa zawierającej HEPES, umieść na lodzie i zrównoważ 100%_O2.
4. Umieść pozostałą pożywkę Amesa zawierającą_NaHCO3 w podgrzewanym zbiorniku na klatce Faradaya i zrównoważ 5% gazem CO₂ / 95% O₂ . Parafilm może być użyty do uwięzienia gazu w przestrzeni nad roztworem.
5. Przygotować agarozę o niskiej temperaturze żelowania (3%), dodając 0,75 g (Sigma; Nr kat.#A0701) do 25 ml pożywki Amesa z HEPES i podgrzać roztwór w temperaturze ~ 115°C w celu stopienia agarozy. Mieszać, aż roztwór będzie klarowny bez pęcherzyków i przechowywać w łaźni wodnej (~ 42°C).
6. Napełnij pipetę rejestrującą wewnętrznym roztworem K-Asp i sprawdź rezystancję końcówki.

4. Rozpocznij eksperyment

1. Uśpij mysz i szybko usuń oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek. Do wszystkich zabiegów należy używać gogli na podczerwień, aby zapobiec wybielaniu pigmentu wzrokowego.
2. Umieść oczy na kawałku bibuły filtracyjnej, aby zapobiec ich toczeniu się, i za pomocą cienkiego dwustronnego ostrza wykonaj szczelinę w rogówce, przytrzymując oko kleszczami.
3. Gdy tylko gałka oczna zostanie przebita, przenieś oko do naczynia wypełnionego pożywką Amesa.
4. Używając szczeliny w rogówce jako punktu wejścia, małe nożyczki służą do odcinania pozostałych części rogówki, po czym można usunąć soczewkę i ciało szkliste. Należy uważać, aby siatkówka pozostała przymocowana do muszli ocznej i przechowywać muszlę oczną w ciemności w temperaturze 32°C w pożywce Amesa zrównoważonej 5% CO₂/95% O_{2 .}

5. Krojenie

1. Hemisect jednej z muszli ocznych i oddzielić siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki. Usuń krawędzie siatkówki, aby tkanka mogła leżeć płasko.
2. Użyj małej szklanej pipety Pasteura z lateksową bańką, aby napełnić szalkę Petriego o średnicy 35 mm stopionym agarem i przeciągnij kleszcze przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję.
3. Kiedy zaczniesz widzieć, jak agar krzepnie:
   1. Przenieś siatkówkę na górną część agaru.
   2. Użyj skręconego kawałka Kimwie, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół siatkówki.
   3. Umieść 2-3 krople Agaru bezpośrednio na siatkówce i szybko umieść plastikowy cylinder na siatkówce, aby utworzyć wokół niego ścianę. Następnie wlej dodatkowy stopiony agar po bokach plastikowego cylindra, jednocześnie centrując siatkówkę w agarze.
   4. Przenieś szalkę Petriego do lodowatej łaźni wodnej w celu ostygnięcia.
4. Po ~ 45 sekundach wyjmij tkankę z lodowatej kąpieli wodnej i za pomocą tłoka wyciśnij blok agaru z plastikowego cylindra, popychając od strony najbardziej oddalonej od siatkówki.
5. Użyj jednostronnej żyletki, aby wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę i przyklej blok na miejscu do podkładki agaru na krążku próbki.
6. Przenieś krążek z próbką do wibrującej tacki na mikrotom i wlej do niej lodowaty AMES HEPES, umożliwiając całkowite zanurzenie bloku z siatkówką.
7. Plastry siatkówki o grubości ~ 200 μm można ciąć z maksymalną szybkością wibracji ostrza i prędkością ostrza ustawioną do przodu w taki sposób, że przecięcie siatkówki na każdym plastrze zajmuje od 4 do 5 sekund.
8. Użyj ostrza skalpela nr 11, aby usunąć każdy nadający się do użytku plasterek pojedynczo
9. Dobre plastry zawierające siatkówkę umieszcza się w komorach nagraniowych i obciąża kotwami do plastrów z przecinającymi je nylonowymi nitkami. Nylonowe nici przytrzymują agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę niezakłóconą podczas nagrań.
10. Przenieś komorę zapisu na stolik mikroskopu pionowego, zamknij kurtynę i włącz źródło światła podczerwonego, aby view wycinek na kamerze czułej na podczerwień.

6. Nagrywanie

1. Po zidentyfikowaniu dobrego wycinka siatkówki (z nienaruszonymi fotoreceptorami i odpowiednim kątem cięcia) należy rozpocząć perfuzję siatkówki z szybkością większą niż 5 ml / min za pomocą podgrzanego podłoża Amesa, które jest podgrzewane do 35 37 ° C i równoważone 5% CO₂ / 95% O_{2 .}
2. W wyniku procesu krojenia mogą być widoczne pewne uszkodzenia powierzchni. Tę zwykle cienką warstwę komórek można usunąć za pomocą pipety ze złamaną końcówką i delikatnie odessać martwe ciała komórek. To zazwyczaj ujawnia żywe komórki pod spodem. Zidentyfikuj zdrowe ciało komórki, którego pozycja znajduje się w warstwach będących przedmiotem zainteresowania.
3. Napełnij mikropipetę roztworem wewnętrznym KAsp i wyciśnij dodatnie (na zewnątrz) ciśnienie przez końcówkę pipety, a następnie opuść końcówkę pipety do komory rejestrującej i w dół do poziomu celi za pomocą mikromanipulatora.
4. Przesuń końcówkę pipety tak, aby wgłębiła się w błonę komórkową, i zastosuj delikatny nacisk ujemny (do wewnątrz), aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji. Tryb całego ogniwa można osiągnąć, przykładając podciśnienie do elektrody, aby włamać się do ogniwa.
5. Stymulacja tkanki siatkówki za pomocą diod LED może następnie wywołać reakcje na światło.
6. Sfotografuj komórkę, z której wykonano nagranie, wywołując fluorescencję fluoroforu w roztworze wewnętrznym pipety.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Pokazano tu potencjały wywołane światłem neuronu siatkówki przystosowanego do ciemności do błysków światła o rosnącej sile.

Rysunek 2. Obraz fluorescencyjny z wycinka siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione fluoroforem, Lucyferem Żółtym. Fluorescencja wywołana pokazuje morfologię komórek, z których wykonano zapisy plastrów.

Dyskusja

Zapisy warstwowe z siatkówki kręgowców są prowadzone od dziesięcioleci^1,2 i odniosły spory sukces w dostarczaniu głębszego zrozumienia, w jaki sposób obwody siatkówki kodują padające światło. Zaletą cięcia za pomocą wibrującego mikrotomu, a nie bezpośrednio żyletki, jest to, że plastry siatkówki ulegają mniejszym uszkodzeniom na powierzchni. Za pomocą pipety ssącej łatwo jest usunąć to uszkodzenie i celować w zdrowe komórki tuż pod powierzchnią, które zachowują swoją łączność w obwodzie siatkówki, gdzie więk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97
Szkło borokrzemianowe	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Rurka polietylenowa	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Niska temperatura żelowania agaroza	Sigma-Aldrich	A0701
Ames' Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781