Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Streszczenie

Doświadczenie wzrokowe rozpoczyna się w momencie, gdy pigment wzrokowy w fotoreceptorach siatkówki pochłania fotony energii świetlnej, co inicjuje kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych prowadzących do zamknięcia kanałów sterowanych cyklicznymi nukleotydami w błonie komórkowej. Wynikająca z tego zmiana potencjału błonowego prowadzi z kolei do zmniejszenia ilości uwalnianego neuroprzekaźnika zarówno z zakończeń synaptycznych pręcików, jak i czopków. Aby zmierzyć, w jaki sposób wywołana światłem zmiana potencjału błonowego fotoreceptorów wpływa na aktywność w dalszych obszarach siatkówki, naukowcy od dziesięcioleci wykonują rejestracje elektrofizjologiczne z preparatów skrawków siatkówki^1,2. W przeszłości skrawki te wycinano ręcznie żyletką z tkanki siatkówki przymocowanej do papieru filtrującego; w ostatnich latach opracowano inną metodę krojenia, w której tkanka siatkówki zostaje zatopiona w agarze o niskiej temperaturze żelowania, a następnie pocięta w chłodnym roztworze za pomocą wibrotomu^3,4. Metoda ta pozwala na uzyskanie skrawków siatkówki z mniejszymi uszkodzeniami powierzchniowymi i bardzo silnymi odpowiedziami wywołanymi światłem. W niniejszej pracy dokumentujemy, w jaki sposób procedurę tę można przeprowadzić w świetle podczerwonym, aby uniknąć blaknięcia pigmentu wzrokowego.

Protokół

1. Przygotowanie elektrod

1. Przygotować elektrody pomiarową i odniesienia, zanurzając obie w 1M NaCl i przyłożając między nie napięcie 15V przy użyciu fali sinusoidalnej o częstotliwości 1 Hz przez ok. 20 s.
2. Wykonać elektrody pomiarowe za pomocą wyciągacza mikropipet (Sutter Instruments P-97). W przypadku pipet do techniki patch-clamp należy użyć szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 mm i średnicy wewnętrznej 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat#B120-69-10). Zmierzyć rezystancję szeregową przez końcówkę elektrody. Na podstawie wielkości komórek docelowych wybrać średnicę końcówki pipety; dla ciał komórek o średnicy ok. 20 μm zastosować ok. 5 MΩ, a dla ciał komórek o średnicy ok. 5 μm zastosować ok. 12 MΩ.
3. Przygotować elektrody uziemiające/odniesienia. Za pomocą strzykawki wypełnić krótki odcinek rurki polietylenowej (Intramedic, PE205) roztworem 1 mM NaCl zawierającym 3,5% Agaru (Sigma; Cat# A7002) w 1M NaCl. Umieścić ten mostek agarowy nad elektrodą odniesienia Ag/AgCl.

2. Przygotowywanie roztworów

1. Zewnętrzny roztwór kąpieli, pożywka Amesa zawierająca wodorowęglany (1 L): 1 butelka Ames' Medium (Sigma; Cat# A1420), 1,9 g NaHCO₃, 7 mL Penicillin-Streptomycin (Sigma; Cat# P0781) w celu zapobiegania wzrostowi bakterii. Dostosować osmolalność do ~ 280 mOsm.
2. Roztwór do krojenia, pożywka Amesa zawierająca bufor pH HEPES (1 L): 1 butelka Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 mL Penicillin-Streptomycin. Dostosować pH do ~ 7,4 przy użyciu 1M NaOH i/lub 1M HCl. Dostosować osmolalność do ~ 280 mOsm.
3. Wewnętrzny roztwór do pipety z aspartanem potasu (K-Asp) (w mM): 125 K-Aspartate, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl₂, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg; pH dostosowane do ~ 7,3 za pomocą NMG-OH, a osmolalność dostosowana do ~ 280 mOsm.
4. Agarowe podłoże stabilizujące agarozę o niskiej temperaturze żelowania zawierającą siatkówkę (5% wagowo), 7,5 g Agar (Sigma; Cat# A7002) rozpuszczone w 150 mL dH₂O.

3. Dzień eksperymentu

1. Odmrozić z zamrażarki ~ 1,5 mL wewnętrznego roztworu K-Asp oraz wybrany fluorofor. Rozcieńczyć fluorofor do odpowiedniego stężenia, które należy wyznaczyć empirycznie.
2. Wlać do światłoszczelnego pojemnika do przechowywania pożywkę Amesa zawierającą NaHCO₃ (~ 200 mL）, a następnie umieścić ją w łaźni wodnej (30-32°C) i nasycić mieszaniną gazów 5% CO₂/95% O₂.
3. Napełnić butelkę ~ 110 mL pożywki Amesa zawierającej HEPES, umieścić na lodzie i nasycić 100% O₂.
4. Pozostałą pożywkę Amesa zawierającą NaHCO₃ umieścić w podgrzewanym zbiorniku na górze klatki Faradaya i nasycić mieszaniną gazów 5% CO₂/95% O₂. Do zatrzymania gazu w przestrzeni nad roztworem można użyć Parafilmu.
5. Przygotować agarozę o niskiej temperaturze żelowania (3%), dodając 0,75 g (Sigma; Cat#A0701) do 25 mL pożywki Amesa z HEPES, a następnie podgrzać roztwór do ~ 115°C, aby stopić agarozę. Mieszać do momentu, aż roztwór stanie się klarowny i pozbawiony pęcherzyków powietrza, a następnie przechowywać w łaźni wodnej (~ 42°C).
6. Napełnić pipetę rejestrującą wewnętrznym roztworem K-Asp i sprawdzić oporność końcówki.

4. Rozpoczęcie eksperymentu

1. Uśmierć mysz i szybko usuń oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek. Wszystkie procedury należy przeprowadzać w goglach podczerwonych, aby zapobiec blaknięciu pigmentu wzrokowego.
2. Umieść oczy na kawałku papieru filtracyjnego, aby zapobiec ich toczeniu się, a następnie, trzymając oko pęsetą, wykonaj nacięcie w rogówce za pomocą cienkiego, obustronnego ostrza.
3. Natychmiast po przebiciu gałki ocznej przenieś oko do naczynia wypełnionego pożywką Ameśs.
4. Wykorzystując nacięcie w rogówce jako punkt wejścia, za pomocą małych nożyczek wytnij pozostałe części rogówki, po czym usuń soczewkę i ciało szkliste. Należy uważać, aby siatkówka pozostała przytwierdzona do oka; tak przygotowaną gałkę oczną przechowuj w ciemności w temperaturze 32° C w pożywce Ameśs równoważonej z 5% CO₂/95% O₂.

5. Krojenie

1. Przetnij połowicznie jedną z czarek ocznych i oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki. Usuń brzegi siatkówki, aby tkanka mogła równo przylegać.
2. Za pomocą małej szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką napełnij 35 mm szalkę Petriego roztopionym agarem, a następnie przeciągnij pęsetą przez agar, aby sprawdzić jego konsystencję.
3. Gdy agar zacznie twardnieć:
   1. Przenieś siatkówkę na powierzchnię agaru.
   2. Użyj skręconego kawałka chusteczki Kimwipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu wokół siatkówki.
   3. Nanieś 2-3 krople agaru bezpośrednio na siatkówkę i szybko umieść nad nią plastikowy cylinder, aby stworzyć wokół niej ściankę. Następnie wlewaj dodatkowy roztopiony agar po ściankach plastikowego cylindra, centrując siatkówkę wewnątrz agaru.
   4. Przenieś szalkę Petriego do kąpieli w lodowatej wodzie w celu schłodzenia.
4. Po około 45 sekundach wyjmij tkankę z kąpieli w lodowatej wodzie i za pomocą tłoka wypchnij blok agaru z plastikowego cylindra, naciskając od strony przeciwnej do siatkówki.
5. Użyj jednostronnego ostrza do golenia, aby wyciąć mały blok agaru zawierający siatkówkę, a następnie przyklej blok superglue do ogranicznika agaru na dysku do preparatów.
6. Przenieś dysk do preparatów do tacy wibracyjnego mikrotomu i wlej do tacy lodowaty roztwór Ames HEPES, tak aby blok z siatkówką został całkowicie zanurzony.
7. Przekroje siatkówki o grubości ~ 200 μm można wycinać przy maksymalnej częstotliwości wibracji ostrza i prędkości posuwu ustawionej tak, aby przecięcie siatkówki w każdym przekroju trwało od 4 do 5 sekund.
8. Użyj ostrza skalpela nr 11, aby pojedynczo usuwać każdy użyteczny przekrój.
9. Dobre przekroje zawierające siatkówkę umieszcza się w komorach rejestracyjnych i dociąża kotwicami do przekrojów z nylonowymi nićmi przebiegającymi nad nimi. Nitki nylonowe dociskają agar otaczający siatkówkę, pozostawiając siatkówkę odsłoniętą do rejestracji.
10. Przenieś komorę rejestracyjną na stolik mikroskopu pionowego, zasłoń zasłonę i włącz podczerwone źródło światła, aby obejrzeć przekrój za pomocą kamery czułej na podczerwień.

6. Rejestracja

1. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego skrawka siatkówki (z nienaruszonymi fotoreceptorami i właściwym kątem cięcia) należy rozpocząć perfuzję siatkówki z prędkością powyżej 5 mL/min podgrzanym do 35–37°C podłożem Amesa, równoważonym z 5% CO₂/95% O₂.
2. W wyniku procesu krojenia mogą być widoczne uszkodzenia powierzchniowe. Tę cienką warstwę komórek można zazwyczaj usunąć za pomocą pipety z uciętą końcówką, delikatnie odsysając martwe ciała komórek. Pozwoli to zazwyczaj na odsłonięcie żywych komórek znajdujących się poniżej. Należy zidentyfikować zdrowe ciało komórki znajdujące się w interesującej nas warstwie.
3. Należy napełnić mikropipetę wewnętrznym roztworem KAsp, przyłożyć dodatnie (zewnętrzne) ciśnienie przez końcówkę pipety, a następnie opuścić końcówkę pipety do komory rejestracyjnej i na poziom komórki za pomocą mikromanipulatora.
4. Przesunąć końcówkę pipety tak, aby spowodowała ona wgłębienie w błonie komórkowej, a następnie przyłożyć delikatne ujemne (wewnętrzne) ciśnienie w celu utworzenia uszczelnienia o wysokiej rezystancji. Tryb whole-cell można uzyskać poprzez przyłożenie ujemnego ciśnienia do elektrody w celu przebicia się do wnętrza komórki.
5. Stymulacja tkanki siatkówki za pomocą diod LED może następnie wywołać odpowiedzi na światło.
6. Należy sfotografować komórkę, z której dokonano pomiaru, wywołując fluorescencję fluoroforu zawartego w wewnętrznym roztworze pipety.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Przedstawiono tutaj potencjały wywołane światłem w zaadaptowanym do ciemności neuronie siatkówki w odpowiedzi na błyski światła o rosnącym natężeniu.

Rysunek 2. Obraz fluorescencyjny z przekroju siatkówki, w którym komórki zostały wypełnione fluorophorem, Lucifer Yellow. Wywołana fluorescencja pokazuje morfologię komórek, z których wykonano rejestracje patch-clamp.

Dyskusja

Rejestracje z przekrojów siatkówek kręgowców są przeprowadzane od dziesięcioleci^1,2 i okazały się bardzo skuteczne w pogłębianiu zrozumienia sposobu, w jaki obwody siatkówkowe kodują padające światło. Przewagą cięcia za pomocą wibrotomu w porównaniu z cięciem bezpośrednim za pomocą żyletki jest fakt, że przekroje siatkówki ulegają mniejszym uszkodzeniom powierzchniowym. Dzięki zastosowaniu pipety ssącej można łatwo usunąć te uszkodzenia i skierować badanie na zdrowe komórki znajdujące się tuż pod powierzchnią,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wytwornica mikroelektrod (puller)	Sutter Instrument Co.	P-97
Szkło borokrzemowe	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Przewody polietylenowe	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Agaroza o niskiej temperaturze żelowania	Sigma-Aldrich	A0701
Pożywka Amesa’	Sigma-Aldrich	A1420
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781