Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Podsumowanie

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Streszczenie

Niniejszy protokół przedstawia metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zastosowań w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego. W skrócie, tkanka odkomórkowiona zostaje liofilizowana, zmielona, poddana trawieniu enzymatycznemu, a następnie doprowadzona do fizjologicznego pH. Liofilizacja usuwa całą zawartość wody z tkanki, w wyniku czego powstaje sucha macierz ECM, którą można zmielić na drobny proszek za pomocą małej młynki. Po zmieleniu proszek ECM jest trawiony pepsyną w celu utworzenia wstrzykiwalnej macierzy. Po dostosowaniu do pH 7.4 ciekawy materiał macierzy może zostać wstrzyknięty do mięśnia sercowego. Wyniki poprzednich analiz charakterystyki wykazały, że żele macierzy otrzymywane z odkomórkowanej tkanki osierdzia i mięśnia sercowego zachowują natywne składniki ECM, w tym różnorodne białka, peptydy i glikozaminoglikany. Biorąc pod uwagę zastosowanie tego materiału w inżynierii tkankowej, szczególnie przydatna jest charakterystyka in vivo; tutaj przedstawiono metodę wykonywania wstrzyknięcia śródściennego do wolnej ściany lewej komory (LV) jako sposób analizy odpowiedzi gospodarza na żel macierzy w modelu małych zwierząt. Dostęp do jamy klatki piersiowej uzyskuje się poprzez przeponę, a wstrzyknięcie wykonuje się nieco powyżej wierzchołka w wolnej ścianie LV. Rusztowanie pochodzenia biologicznego można zwizualizować poprzez znakowanie biotyną przed wstrzyknięciem, a następnie barwienie przekrojów tkankowych neutrawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową i wizualizację za pomocą barwienia diaminobenzydyną (DAB). Analiza obszaru wstrzyknięcia może być również przeprowadzona za pomocą barwienia histologicznego i immunohistochemicznego. W ten sposób wykazano, że wcześniej badane żele macierzy osierdziowej i mięśnia sercowego tworzą włókniste, porowate sieci i promują angiogenezę w obszarze wstrzyknięcia.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki do wstępnego przetwarzania

1. Przed zastosowaniem tego protokołu należy przeprowadzić decelularyzację wybranej tkanki. W tym przykładzie świeże próbki osierdzia świńskiego i ludzkiego są decelularyzowane poprzez płukanie w wodzie dejonizowanej (DI) oraz roztworze sodku dodecylo-siarczanu (SDS) w warunkach hipotonicznych i hipertonicznych.
2. W szczególności, najpierw należy płukać osierdzie świńskie w wodzie DI przez 30 minut, następnie mieszać nieprzerwanie w 1% SDS w buforze fosforanowym (PBS) przez 24 godziny, a następnie płukać w wodzie DI przez 5 godzin. W przypadku osierdzia ludzkiego najpierw płukać w wodzie DI przez 30 minut, następnie mieszać nieprzerwanie w 1% SDS w PBS przez 60–65 godzin, a następnie płukać w wodzie DI przez noc. Wszystkie próbki należy wyjąć z końcowego roztworu i ponownie opłukać pod bieżącą wodą DI ¹.
3. Aby zweryfikować decelularyzację, należy pobrać niewielki fragment, zamrozić go w medium do mrożenia O.C.T. i wykonać przekroje tkankowe o grubości 10 μm co 100 μm w całej próbce w celu analizy histologicznej, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami ^34-36.
4. Do oceny braku jąder w tkance należy zastosować barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E). W celu weryfikacji wyników H&E można również zastosować fluorescencyjny barwnik Hoescht 33342 (1,0 μg/mL) do wykrywania DNA; w skrócie: należy utrwalić przekroje, nawodnić i wypłukać w wodzie, barwić przez 10 minut, a następnie dokładnie wypłukać i przechowywać w ciemności. Alternatywnie można zastosować zestaw taki jak Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit, który służy do ilościowego oznaczenia całkowitej zawartości DNA w próbce.

2. Przygotowanie wstrzykiwalnej ECM

1. Liofilizacja
   1. Po odpowiednim przygotowaniu zamrozić zdecelularyzowane próbki za pomocą ciekłego azotu lub przechowując je w temperaturze -80 °C. Liofilizować próbki aż do całkowitego wysuszenia. W zależności od posiadanego systemu oraz zawartości wody w próbkach, może to zająć od 12 do 72 godzin.
2. Mielenie
   1. Po całkowitym wysuszeniu, do zmielenia suchej ECM na drobny proszek należy użyć młyna Wiley Mini Mill. Należy wybrać odpowiednią wielkość sita w zależności od przeznaczenia; w tym przypadku użyto sita o rozmiarze 40 gauge. Gdy większość próbki przejdzie przez filtr, należy wyjąć naczynie zbiorcze z proszkiem mielonej ECM. W przypadku małej ilości materiału, resztę próbki można wydobyć z młyna na różne sposoby; tutaj użyto patyczka higienicznego do usunięcia ECM zaklinowanej za nieruchomymi ostrzami młyna.
   2. Należy zawsze upewnić się, że młyn jest czysty i wolny od zanieczyszczeń. Ważne jest również, aby zarówno młyn, jak i próbka były całkowicie suche; każda pozostała wilgoć spowoduje agregację i zbrylenie ECM, co uniemożliwi skuteczne mielenie. ECM może chłonąć wilgoć z powietrza, dlatego powinna trafić bezpośrednio z liofilizatora do młyna.
3. Trawienie
   1. Aby uzyskać wstrzykiwalną ECM, proszek poddaje się trawieniu pepsyną. Poniższy protokół został zmodyfikowany na podstawie pracy Freyetes, et al. (2).
   2. Ważne jest zachowanie jak największej sterylności produktu, ponieważ będzie on wstrzykiwany in vivo, a zanieczyszczenia mogą spowodować powikłania. Należy zatem stosować sterylne fiolki i szpatułki do ważenia oraz filtrować wszystkie roztwory przed użyciem. Etap liofilizacji po mieleniu, a przed trawieniem, pomoże również w utrzymaniu sterylności.
   3. Odważyć pożądaną ilość proszku ECM do odpowiedniej fiolki scyntylacyjnej. Dla objętości całkowitych mniejszych niż 1 mL zaleca się użycie fiolki 2 mL, a dla większych objętości fiolki 20 mL. Zapewnia to wystarczającą ilość cieczy na dnie fiolki do efektywnego mieszania.
   4. Odważyć pożądaną ilość pepsyny do fiolki scyntylacyjnej. Dodać 0.1 M HCl tak, aby stężenie pepsyny wynosiło 1 mg/mL. Przed użyciem upewnić się, że pepsyna jest całkowicie rozpuszczona (brak cząstek stałych) – można to przyspieszyć poprzez wierzchołkowanie roztworu pepsyny.
   5. Dodać roztwór pepsyny/HCl do fiolki scyntylacyjnej z proszkiem ECM w taki sposób, aby stężenie ECM wynosiło 10 mg/mL.
   6. Mieszać roztwór w sposób ciągły przez 60-65 godzin, okresowo zgarniając materiał ze ścianek fiolki za pomocą szpatułki do ważenia lub szpachelki.
4. Regulacja pH
   1. Krok ten wykonuje się w celu doprowadzenia ciekłego materiału macierzy do fizjologicznego pH oraz inaktywacji pepsyny, aby zapobiec dalszemu cięciu ECM. Ponownie, należy pamiętać o stosowaniu filtrowanych roztworów przygotowanych z wody Millipore.
   2. Dodać 1 M NaOH w ilości stanowiącej 1/10 objętości początkowej. Na tym etapie sprawdzić pH i dodawać niewielkie ilości (2-10 μl) NaOH lub HCl, aż do osiągnięcia pożądanego pH (7.4). Należy odnotować wszystkie dodane ilości użyte do neutralizacji lub odjęte do badania pH. Po zneutralizowaniu roztworu dodać 10x PBS w ilości stanowiącej 1/10 objętości końcowej (1/9 aktualnej objętości). Określić stężenie wstrzykiwalnej ECM, a następnie dodać 1x PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe, w tym przypadku 6 mg/mL.
   3. Charakteryzację wstrzykiwalnej ECM można przeprowadzić za pomocą SDS-PAGE, kolorymetrycznego testu GAG Blyscan oraz spektrometrii mas.
   4. Na tym etapie materiał macierzy może zostać wstrzyknięty in vivo w celu utworzenia rusztowania do inżynierii tkanki mięśnia sercowego.
5. Znakowanie biotyną
   1. Przed wstrzyknięciem ECM można oznakować biotyną w celu łatwiejszej wizualizacji wstrzykniętej macierzy.
   2. Przygotować 10mM roztwór biotyny i dodać go do wstrzykiwalnej ECM w stosunku 0.3mg/mg. ECM powinna być w pożądanym stężeniu do wstrzyknięcia. W przypadku wstrzykiwania w stężeniu 6 mg/mL, dodać 40 μL biotyny na 1 mL ECM. Przed wstrzyknięciem przechowywać roztwór biotyna-ECM w lodzie przez co najmniej 1 godzinę.
6. Wszystkie etapy przetwarzania można przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec żelowaniu wstrzykiwalnej macierzy, etap regulacji pH można przeprowadzić w lodzie.

3. Iniekcje w mięsień sercowy

1. Przygotowanie do iniekcji
   1. Dla użytych tutaj samic szczurów (225-250 g) przygotowano iniekcje 75 μL wstrzykiwalnej ECM o pH 7.4 w strzykawkach 0.1 mL z igłami o rozmiarze 30 G. W przypadku użycia samców szczurów (375-400 g) można wstrzyknąć 90 μL.
   2. Wszystkie materiały chirurgiczne powinny zostać wysterylizowane przed operacją; tutaj zastosowano autoklawowany zestaw chirurgiczny zawierający wszystkie niezbędne narzędzia.
2. W dniu operacji szczur rasy Harlan Sprague-Dawley jest znieczulany izofluranem w stężeniu 5%, intubowany za pomocą otoskopu, a następnie utrzymywany przy 2.5% izofluranu przez cały czas trwania procedury.
3. Do oczu zwierzęcia należy nałożyć maść z substytutem łez, aby chronić je przed wysychaniem i dostaniem się sierści. W celu nawodnienia podczas operacji należy podać 3 mL roztworu Lactated Ringers poprzez iniekcję podskórną w dolnej części brzucha.
4. Zwierzę należy ułożyć na stole operacyjnym w pozycji na plecach i delikatnie przymocować kończyny taśmą. Przed odkażaniem należy usunąć sierść z brzucha za pomocą trymera i odessać resztki włosów odkurzaczem.
5. Wykonuje się serię małych iniekcji (około 50 μL każda) 2% lidokainy wzdłuż przekątnej od wyrostka mieczowatego do dolnej prawej strony brzucha. Następnie obszar przemywa się trzy razy betadyną, zaczynając od środka i kierując się na zewnątrz. Czynność powtarza się z użyciem 70% etanolu. Zwierzę należy przykryć chustą chirurgiczną z gotowym okrągłym okienkiem; w razie potrzeby przymocować ją kleszczykami do ręczników.
6. Używając skalpela nr 10, wykonuje się nacięcie o długości 3-4 cm od wyrostka mieczowatego do dolnej prawej strony brzucha. Lokalizując wyrostek mieczowaty, przeprowadza się dyssekcję pionowo w dół przez mięśnie w prawo, uważając, aby nie uszkodzić dużego naczynia po prawej stronie. Po przecięciu mięśni używa się nożyczek do bocznego przecięcia mięśni w celu odsłonięcia przepony. Należy uważać, aby nie uszkodzić wątroby.
7. Używając 36-calowego odcinka nici chirurgicznej 3-0 Vicryl i hemostatyków, przeprowadza się jedną igłę przez wyrostek mieczowaty i wyciąga nić do połowy. Końce nici skleja się taśmą i mocuje do punktu nad zwierzęciem i za nim, co w praktyce unosi wyrostek mieczowaty i odsłania przeponę. Używając kolejnego 36-calowego odcinka nici 3-0 Vicryl, przeprowadza się igłę przez mięsień najbliższy wyrostkowi mieczowatemu, ponownie wyciąga i mocuje końce do kolejnego punktu po prawej stronie stołu operacyjnego, całkowicie odsłaniając jamę operacyjną.
8. Na tym etapie serce powinno być widoczne przez przeponę. Używając małej pary mikropincet z ząbkami dla szczurów, chwyta się środek przepony, pociąga w stronę operatora i wykonuje bardzo małe nacięcie tępymi nożyczkami. Niezwykle ważne jest użycie bardzo tępych nożyczek, aby uniknąć przebicia płuc. Po wykonaniu otworu płuca cofą się, co umożliwia wykonanie nacięcia o długości 2-3 cm pionowo przez przeponę w celu uwidocznienia serca.
9. Do lewej strony jamy wprowadza się 3-calowy patyczek higieniczny Q-tip, aby odsunąć płuca. Patyczek mocuje się w miejscu za pomocą kleszczyka do ręczników. Drugiego patyczka Q-tip używa się do odsunięcia prawego płuca w celu zlokalizowania worka osierdziowego. Używając mikropincety i pary dużych kleszczyków z ząbkami, rozdziera się worek osierdziowy, odsłaniając wierzchołek serca. Jeśli zwierzę przeszło wcześniej procedurę zawału, osierdzie będzie już nieobecne.
10. Chwyta się wierzchołek serca mikropincetą z ząbkami i wstrzykuje płynny materiał macierzy na wysokości jednej trzeciej od wierzchołka. Igłę wprowadza się równolegle do powierzchni osierdziowej, wstrzykując materiał tak, aby ścięta krawędź igły była skierowana w lewo. Należy unikać żyły wieńcowej wielkiej. Przed wyjęciem igły należy odczekać kilka sekund. W miejscu iniekcji powinno być widoczne wybielenie tkanki.
11. Należy usunąć krew z jamy, a następnie zdjąć kleszczyk do ręczników i patyczek Q-tip podtrzymujący prawe płuco. Do zamknięcia przepony używa się zakrzywionych mikrohemostatyków i mikropincety z ząbkami. Wykonuje się pierwszy węzeł, a następnie za pomocą kleszczyków z ząbkami i mikrohemostatyków zamyka się przeponę szwem ciągłym przy użyciu igły stożkowej. Przed całkowitym zamknięciem wprowadza się rurkę ssącą PE160 i używa strzykawki 10 mL do ewakuacji treści z jamy klatki piersiowej w miarę zacieśniania szwu.
12. Po prawidłowej ewakuacji i zamknięciu przepona powinna być wklęsła. Wypukła przepona wskazuje na obecność powietrza w jamie.
13. W tym momencie stężenie izofluranu można obniżyć do 1%.
14. Usuwa się obie nici 3-0 Vicryl utrzymujące jamę w otwarciu. Mięśnie nawilża się sterylną wodą, usuwając nadmiar patyczkiem Q-tip lub sterylną gazą. Używając nowego odcinka nici 3-0, zamyka się warstwę mięśniową szwami przerywanymi.
15. W tym momencie można wyłączyć izofluran.
16. Obszar oczyszcza się sterylną wodą i zamyka skórę zszywkami. Jeśli zszywki kolidowałyby z badaniem, można użyć nici prolinowej 5-0. W takim przypadku skórę zamyka się szwami przerywanymi przy użyciu igły tnącej w odwrotnym kierunku (RC). W obu przypadkach miejsce zamkniętego nacięcia pokrywa się punktowo klejem chirurgicznym.
17. Miejsce nacięcia smaruje się patyczkiem Q-tip maścią z potrójnym antybiotykiem.
18. Pozostawia się zwierzę do wybudzenia w 100% tlenie.
19. Gdy zwierzę zacznie oddychać wokół wentylatora, usuwa się rurkę intubacyjną.
20. Gdy zwierzęta przyjmą pozycję sternalną, podaje się podskórnie 0.05 mg/kg hydrochlorku buprenorfiny i przenosi je do klatki domowej na sterylny ręcznik.
21. Zwierzęta powinny podlegać pooperacyjnej obserwacji i opiece.
22. W interesujących punktach czasowych zwierzęta są uśmiercane, a serca pobierane do analizy. Wykonuje się przekroje poprzeczne w osi krótkiej, które można barwić hematoksyliną i eozyną (H&E) do ogólnej analizy tkanki. W krótkich punktach czasowych region wstrzyknięty będzie wyglądał jak różna, włóknista sieć rozprzestrzeniona śródmiąższowo. W późniejszych punktach czasowych zaobserwuje się napływ komórek i ostateczną degradację wstrzykniętej macierzy po 2 do 3 tygodniach. Jeśli ECM została znakowana biotyną przed iniekcją, można ją bezpośrednio zwizualizować poprzez barwienie biotyny streptawidyną sprzężoną z HRP. Barwienia immunohistochemicznego można użyć do identyfikacji specyficznych komórek lub struktur w regionie iniekcji; tutaj preparaty zostały poddane podwójnemu barwieniu: izolektyną sprzężoną z FITC, która wiąże się z komórkami śródbłonkowymi i fluorescuje na zielono, oraz przeciwciałem przeciwko aktynie mięśni gładkich z wtórnym przeciwciałem Alexafluor, które znakuje komórki SMC na czerwono.

4. Reprezentatywne wyniki

Poprzednia charakterystyka materiałów macierzy przygotowanych w ten sposób wykazała utrzymanie różnorodnych makromolekuł. W szczególności, za pomocą spektrometrii mas zidentyfikowano wiele białek włóknistych i glikoprotein (Tabela 1). Jeśli okaże się, że materiały macierzy przetworzone zgodnie z tym protokołem nie zawierają już złożonego zestawu makromolekuł, może to oznaczać, że zastosowany protokół decelularyzacji był zbyt drastyczny. Po pełnej liofilizacji wysuszona ECM osierdzia przypomina bardzo sztywny, pognieciony papier. Inne typy tkanek będą przypominać styropianowe elementy zabezpieczające. Jeśli materiał zostanie dobrze zmielony, ECM powinna przejść przez sito i zostać zebrana w słoiku na dnie. Jeśli w próbce pozostanie wilgoć, ECM będzie się zbijać w grudki i utknie w komorze mielącej. Po trawieniu roztwór ECM powinien mieć mleczny kolor i być całkowicie wolny od widocznych cząsteczek. Będzie on również nieco bardziej lepki niż sam HCl. Jeśli ECM nie zostanie dobrze strawiona, w fiolce nadal będą znajdować się duże cząstki; alternatywnie, ECM może wypaść z roztworu. Po regulacji pH w roztworze nie następuje żadna widoczna zmiana, a ECM nadal pozostaje mętnym, jednorodnym płynem. Jeśli zacznie on żelować, lepkość wzrośnie, a pobranie materiału do strzykawki będzie trudne lub niemożliwe. W takim przypadku należy przeprowadzić etap regulacji pH na lodzie, stosując schłodzone wcześniej roztwory. Po przygotowaniu wstrzykiwaczy należy przechowywać je na lodzie do momentu użycia. Jeśli wstrzyknięcie przebiegnie pomyślnie, obszar wokół końcówki igły bieleje i widoczny jest mały bolus. Jeśli nie zostanie to zaobserwowane, wstrzyknięcie mogło trafić do komory zamiast do ściany. Podczas zszywania zwierzęcia po wstrzyknięciu, najistotniejszym krokiem jest staranne zamknięcie przepony. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, przepona będzie ściśle przylegać do płuc i będzie wyglądać na wklęsłą. Jeśli w płucach pozostanie powietrze, przepona pozostanie wypukła lub pojawi się obszar, w którym będzie ona wybrzuszona. Podczas badania histologicznego miejsca wstrzyknięcia w wczesnym punkcie czasowym (od 30 minut do 4 godzin po wstrzyknięciu), powinno być widoczne różowe, włókniste pole pozbawione komórek – jest to zreorganizowany materiał macierzy po wstrzyknięciu (Rysunek 2). Sieć ta często rozprzestrzenia się śródmiąższowo i może być obecna na wielu przekrojach. Możliwym wyjaśnieniem zaobserwowania tylko bardzo małego obszaru żelu macierzy jest to, że część wstrzykiwacza chybiła celu wewnątrzściennego i została wstrzyknięta do komory LV lub wyciekła z miejsca wstrzyknięcia. Dodatkowo, w zależności od czasu żelowania, rozprzestrzenianie śródmiąższowe może być zmienne.

Rysunek 1. Wyniki elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE). (A) Standard masy cząsteczkowej. (B) Kolagen typu I z ogona szczura (2.5 mg/mL) w porównaniu z rozpuszczoną macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) osierdzia ludzkiego (C) i świńskiego (D) (7 mg/mL). Zwróć uwagę na obecność kolagenu, a także kilku innych białek i peptydów w próbkach macierzy osierdzia.

Tabela 1. Składniki ECM zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas.

Rycina 2. Wstrzyknięcia do mięśnia sercowego: żelowanie in vivo. Barwienie H&E wstrzyknięć macierzy osierdziowej ludzkiej (A) i świńskiej (B), które uległy żelowaniu in vivo po 45 minutach. Strzałki wskazują miejsce rozmieszczenia macierzy, zabarwionej na jaśniejszy róż niż mięsień sercowy. Pasek skali wynosi 500 μm.

Rysunek 3. Infiltracja komórek naczyniowych. Barwienia fluorescencyjne naczyń w wstrzykniętych żelach matrycowych pochodzenia ludzkiego (A-C) i świńskiego (D-F) po dwóch tygodniach. Komórki śródbłonka są znakowane na zielono (A, D), natomiast komórki mięśni gładkich są znakowane na czerwono (B, E). Na zdjęciach C i F przedstawiono obrazy złożone. Pasek skali wynosi 100 μm. Białe linie przerywane wskazują obszar wstrzyknięcia matrycy, określony na podstawie analizy H&E sąsiedniego przekroju.

Rycina 4. Komórki macierzyste w obszarze wstrzyknięcia macierzy. Barwienie Hoechstem na jądra (niebieski) oraz przeciwciałami przeciwko c-kit (zielony) identyfikuje komórki macierzyste w obszarach wstrzyknięcia macierzy u ludzi (A) oraz u świń (B). Pasek skali wynosi 50 μm.

Dyskusja

Niniejsza metoda umożliwia wytwarzanie pochodnych biologicznie, wstrzykiwalnych rusztowań do inżynierii tkanki mięśnia sercowego. Chociaż metody te zostały początkowo opracowane w celu wytwarzania i testowania in vivo żelu z macierzy mięśnia sercowego i zaprezentowano je tutaj z wykorzystaniem żelu z macierzy osierdzia, protokół ten można dostosować do użytku z dowolną tkanką, pod warunkiem, że tkanka ta może zostać odpowiednio zdecelularyzowana. Decelularyzacja powinna zostać przeprowadzona i zweryfikowana prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki:
Pepsyna	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Liofilizowany
Biotyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidyna-HRP	Thomas Scientific	21130
Sprzęt:
Młyn Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Liofilizator Labconco	Labconco Corp.	7670520
Wyposażenie chirurgiczne:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Roztwór Ringera z mleczanem	MWI Veterinary Supply	003966
Żel KY	MWI Veterinary Supply	28658
Lidokaina, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Klorowodorek buprenorfiny	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Maść zastępcza do łez	Fisher Scientific	NC9860843
Potrójna maść antybiotykowa	Fisher Scientific	19082795
Izofluran	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoskop	MWI Veterinary Supply	008699
Kurek odcinający	MWI Veterinary Supply	006245
szew Vicryl 3-0	MWI Veterinary Supply	J327H
Szew z Proline 5-0	MWI Veterinary Supply	s-1173
igła tnąca odwrotna (RC)	Ethicon Inc.	8684G
Mikro clampy hemostatyczne	Fine Science Tools	13013-14
Mikrokleszczyki do zębów szczura	Fine Science Tools	11084-07
Skalpel nr 10	Fine Science Tools	10110-01
Nożyczki tępe	Fine Science Tools	14108-09
Ostre nożyczki zakrzywione	Fine Science Tools	14085-08
Duże pęsety ząbkowane	Fine Science Tools	1106-12
przewód ssawiący PE160	BD Biosciences	427430
Klipery	MWI Veterinary Supply	21608
Zszywki skórne/zszywacz skórny	Ethicon Inc.	PRR35
Ogólne materiały i odczynniki:
Mieszadła magnetyczne
0,1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% etanol
strzykawki 0,1 ml
strzykawka 10 ml
patyczki higieniczne
Klej chirurgiczny
Obłożenie chirurgiczne
Klematy ręcznikowe
Mały odkurzacz ręczny