Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Podsumowanie

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Streszczenie

Niniejszy protokół przedstawia metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zastosowań w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego. W skrócie, tkanka odkomórkowiona zostaje liofilizowana, zmielona, poddana trawieniu enzymatycznemu, a następnie doprowadzona do fizjologicznego pH. Liofilizacja usuwa całą zawartość wody z tkanki, w wyniku czego powstaje sucha macierz ECM, którą można zmielić na drobny proszek za pomocą małej młynki. Po zmieleniu proszek ECM jest trawiony pepsyną w celu utworzenia wstrzykiwalnej macierzy. Po dostosowaniu do pH 7.4 ciekawy materiał macierzy może zostać wstrzyknięty do mięśnia sercowego. Wyniki poprzednich analiz charakterystyki wykazały, że żele macierzy otrzymywane z odkomórkowanej tkanki osierdzia i mięśnia sercowego zachowują natywne składniki ECM, w tym różnorodne białka, peptydy i glikozaminoglikany. Biorąc pod uwagę zastosowanie tego materiału w inżynierii tkankowej, szczególnie przydatna jest charakterystyka in vivo; tutaj przedstawiono metodę wykonywania wstrzyknięcia śródściennego do wolnej ściany lewej komory (LV) jako sposób analizy odpowiedzi gospodarza na żel macierzy w modelu małych zwierząt. Dostęp do jamy klatki piersiowej uzyskuje się poprzez przeponę, a wstrzyknięcie wykonuje się nieco powyżej wierzchołka w wolnej ścianie LV. Rusztowanie pochodzenia biologicznego można zwizualizować poprzez znakowanie biotyną przed wstrzyknięciem, a następnie barwienie przekrojów tkankowych neutrawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową i wizualizację za pomocą barwienia diaminobenzydyną (DAB). Analiza obszaru wstrzyknięcia może być również przeprowadzona za pomocą barwienia histologicznego i immunohistochemicznego. W ten sposób wykazano, że wcześniej badane żele macierzy osierdziowej i mięśnia sercowego tworzą włókniste, porowate sieci i promują angiogenezę w obszarze wstrzyknięcia.

Protokół

1. Przygotowanie tkanek do wstępnej obróbki

1. Przed zastosowaniem niniejszego protokołu należy przeprowadzić decelularyzację wybranej tkanki. W tym przykładzie świeże próbki osierdzia świńskiego i ludzkiego są decelularyzowane poprzez płukanie w wodzie dejonizowanej (DI) oraz roztworze dodecylosiarczanu sodu (SDS) w warunkach hipotonicznych i hipertonicznych.
2. W szczególności, najpierw należy myć osierdzie świńskie w wodzie DI przez 30 minut, następnie mieszać w 1% SDS w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przez 24 godziny, a następnie płukać w wodzie DI przez 5 godzin. W przypadku osierdzia ludzkiego należy najpierw płukać w wodzie DI przez 30 minut, następnie mieszać w 1% SDS w PBS przez 60-65 godzin, a następnie płukać w wodzie DI przez całą noc. Wszystkie preparaty należy wyjąć z końcowego roztworu i ponownie opłukać pod bieżącą wodą DI ¹.
3. Aby zweryfikować decelularyzację, należy pobrać mały fragment tkanki, zamrozić go w medium do mrożenia O.C.T. i wykonać przekroje tkankowe o grubości 10 μm co 100 μm w całej próbce w celu przeprowadzenia analizy histologicznej, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami ^34-36.
4. Do oceny braku jąder komórkowych w tkance należy zastosować barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E). Można również użyć fluorescencyjnego barwnika Hoescht 33342 (1,0 μg/mL) do wybarwienia DNA w celu weryfikacji wyników H&E; w skrócie: należy utrwalić przekroje, nawodnić i opłukać w wodzie, barwić przez 10 minut, a następnie dokładnie opłukać i przechowywać w ciemności. Alternatywnie można zastosować zestaw, taki jak Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit, który służy do ilościowego oznaczenia całkowitej zawartości DNA w próbce.

2. Przygotowanie wstrzykiwalnej ECM

1. Liofilizacja
   1. Po odpowiednim przygotowaniu zamrozić zdecelularyzowane próbki w ciekłym azocie lub poprzez przechowywanie w temperaturze -80 °CLiofilizować próbki aż do całkowitego wysuszenia. W zależności od systemu oraz zawartości wody w próbkach, proces ten może trwać od 12 do 72 godzin.
2. Frezowanie
   1. Po całkowitym wyschnięciu, do zmielenia suchej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na drobny proszek wykorzystuje się młyn Wiley Mini Mill. Należy dobrać odpowiednią wielkość sita w zależności od przeznaczenia; w niniejszej procedurze zastosowano sito o oczkach 40 gauge. Gdy większość próbki przejdzie przez filtr, należy wyjąć słoik zbiorczy z proszkiem z mielonej ECM. W przypadku niewielkiej ilości materiału pozostałą część próbki można wydobyć z młyna na różne sposoby; tutaj do usunięcia ECM uwięzionej za nieruchomymi ostrzami młyna użyto patyczka higienicznego.
   2. Należy zawsze upewnić się, że młyn jest czysty i wolny od zanieczyszczeń. Ważne jest również, aby zarówno młyn, jak i próbka były całkowicie suche; każda pozostała wilgoć spowoduje agregację i zlepianie się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co uniemożliwi prawidłowe mielenie. ECM może absorbować wilgoć z powietrza, dlatego powinna być przenoszona bezpośrednio z liofilizatora do młyna.
3. Trawienie
   1. Aby przygotować wstrzykiwalną ECM, proszek poddaje się trawieniu pepsyną. Poniższy protokół został zmodyfikowany na podstawie pracy Freyetes, i wsp. (2).
   2. Ważne jest, aby produkt pozostał jak najbardziej sterylny, ponieważ będzie on wstrzykiwany. in vivo a zanieczyszczenie może spowodować powikłania. Należy zatem używać sterylnych fiolek i łyżek do odważania oraz filtrować wszystkie roztwory przed użyciem. Etap liofilizacji po mieleniu, a przed trawieniem, pomoże również utrzymać sterylność.
   3. Odważ pożądaną ilość proszku ECM do odpowiedniej fiolki scyntylacyjnej. Dla objętości całkowitych mniejszych niż 1 ml zaleca się użycie fiolki o pojemności 2 ml, a dla objętości większych – fiolki o pojemności 20 ml. Zapewnia to obecność wystarczającej ilości cieczy na dnie fiolki w celu efektywnego mieszania.
   4. Odważyć pożądaną ilość pepsyny do fiolki scyntylacyjnej. Dodać 0,1 M HCl w taki sposób, aby uzyskać stężenie pepsyny wynoszące 1 mg/ml. Przed użyciem upewnić się, że pepsyna jest całkowicie rozpuszczona (brak cząsteczek stałych); można to przyspieszyć poprzez wstrząsanie roztworu pepsyny w wortexie.
   5. Dodaj roztwór pepsyny/HCl do fiolki scyntylacyjnej z proszkiem ECM w taki sposób, aby uzyskać stężenie ECM wynoszące 10 mg/ml.
   6. Mieszać roztwór w sposób ciągły przez 60–65 godzin, okresowo zgarniając osad ze ścianek fiolki za pomocą łyżeczki do odważania lub szpatułki.
4. Regulacja pH
   1. Ten etap wykonuje się w celu doprowadzenia płynnego materiału macierzy do pH fizjologicznego oraz inaktywacji pepsyny, aby zapobiec dalszemu rozszczepianiu ECM. Ponownie należy upewnić się, że stosowane są roztwory filtrowane, przygotowane z wody Millipore.
   2. Dodaje się 1 M NaOH tak, aby stanowił on 1/10 objętości początkowej. W tym momencie należy sprawdzić pH i dodawać niewielkie ilości (2-10 μl) NaOH lub HCl, aż do uzyskania pożądanego pH (7,4). Należy odnotować wszystkie niewielkie ilości dodane w celu neutralizacji lub pobrane do pomiaru pH. Po zneutralizowaniu roztworu należy dodać 10x PBS w ilości stanowiącej 1/10 objętości końcowej (1/9 aktualnej objętości). Następnie należy oznaczyć stężenie wstrzykiwalnej ECM, a następnie dodać 1x PBS w celu uzyskania pożądanego stężenia końcowego, w tym przypadku 6 mg/ml.
   3. Charakterystykę wstrzykiwalnej ECM można przeprowadzić za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, kolorymetrycznego testu Blyscan na obecność GAG oraz spektrometrii masowej.
   4. W tym momencie można wstrzyknąć materiał matrycy in vivo w celu utworzenia rusztowania do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego.
5. Znakowanie biotyną
   1. Macierz pozakomórkową (ECM) można znakować biotyną przed iniekcją, aby ułatwić wizualizację wstrzykniętej ECM.
   2. Przygotuj 10 mM roztwór biotyny i dodaj go do wstrzykiwalnej ECM w stosunku 0,3 mg/mg. ECM powinna mieć pożądane stężenie do iniekcji. W przypadku wstrzykiwania w stężeniu 6 mg/ml, dodaj 40 μL Biotyna na 1 ml ECM. Przed wstrzyknięciem roztwór biotyny-ECM należy przechowywać w lodzie przez co najmniej 1 godzinę.
6. Wszystkie etapy przetwarzania można przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec żelowaniu macierzy do iniekcji, etap regulacji pH można przeprowadzać w lodzie.

3. Iniekcje wewnątrzmięśniowe w mięsień sercowy

1. Przygotowanie do iniekcji
   1. Dla użytych tutaj samic szczurów (225-250 g) przygotowano 75 μL iniekcji wstrzykiwalnego ECM o pH 7.4 w strzykawkach 0.1 mL z igłami 30 G. W przypadku użycia samców szczurów (375-400 g) można było wstrzyknąć 90 μL.
   2. Wszystkie przybory chirurgiczne należy wysterylizować przed operacją; tutaj stosujemy autoklawowany zestaw chirurgiczny zawierający wszystkie niezbędne narzędzia.
2. W dniu operacji szczura rasy Harlan Sprague-Dawley znieczula się izofluranem w stężeniu 5%, intubuje za pomocą otoskopu, a następnie utrzymuje znieczulenie przy 2.5% izofluranu przez cały czas trwania procedury.
3. Do oczu zwierzęcia należy nanieść maść z zastępczymi łzami, aby chronić je przed wysychaniem i dostaniem się włosów. W celu nawodnienia podczas operacji podaje się 3 mL roztworu Ringera z mleczanem. Powinno to zostać wykonane poprzez iniekcję podskórną w dolnej części brzucha.
4. Zwierzę kładzie się w pozycji na plecach na stole chirurgicznym i delikatnie przymocowuje kończyny taśmą. Za pomocą trymera usuwa się owłosienie z brzucha, a przed myciem pola operacyjnego usuwa się pozostałe włosy odkurzaczem.
5. Wykonuje się serię małych iniekcji (około 50 μL każda) 2% lidokainy wzdłuż linii przekątnej od wyrostka mieczykowatego do dolnej prawej strony brzucha. Następnie pole myje się trzy razy betadyną, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz. Czynność powtarza się z 70% etanolem. Zwierzę przykrywa się obłożeniem chirurgicznym z gotowym okrągłym wycięciem; w razie potrzeby mocuje się je kleszczykami do ręczników.
6. Za pomocą skalpela nr 10 wykonuje się nacięcie o długości 3-4 cm od wyrostka mieczykowatego do dolnej prawej strony brzucha. Po zlokalizowaniu wyrostka mieczykowatego wykonuje się rozcięcie pionowe przez mięśnie w prawo, uważając, aby nie uszkodzić dużego naczynia po prawej stronie. Po rozcięciu mięśni za pomocą nożyczek przecina się mięśnie bocznie, odsłaniając przeponę. Należy uważać, aby nie uszkodzić wątroby.
7. Używając nici Vicrile 3-0 o długości 36 cali i hemostatu, przeprowadza się igłę przez wyrostek mieczykowaty i wyciąga nić do połowy. Końce nici skleja się taśmą i mocuje w punkcie nad zwierzęciem i za nim, co w zasadzie unosi wyrostek mieczykowaty i odsłania przeponę. Za pomocą kolejnego 36-calowego odcinka nici Vicrile 3-0 przeprowadza się igłę przez mięsień najbliższy wyrostkowi mieczykowatemu, ponownie przeciąga nić i mocuje końce w innym punkcie po prawej stronie stołu chirurgicznego, całkowicie odsłaniając jamę operacyjną.
8. Na tym etapie serce powinno być widoczne przez przeponę. Za pomocą małej mikropincety z ząbkami dla szczurów chwyta się środek przepony, odciąga go w stronę operatora i wykonuje bardzo małe nacięcie tępymi nożyczkami. Niezwykle ważne jest użycie bardzo tępych nożyczek, aby uniknąć przebicia płuc. Po wykonaniu otworu płuca cofają się, co pozwala na wykonanie nacięcia o długości 2-3 cm pionowo przez przeponę w celu wizualizacji serca.
9. Do lewej strony jamy wprowadza się 3-calowy patyczek kosmetyczny (Q-tip), aby odsunąć płuca. Patyczek mocuje się kleszczykiem do ręczników. Drugi patyczek wykorzystuje się do odsunięcia prawego płuca w celu zlokalizowania worka osierdziowego. Za pomocą mikropincety i dużych kleszczyków z rowkami rozrywa się worek osierdziowy, odsłaniając wierzchołek serca. Jeśli zwierzę przeszło wcześniej procedurę zawałową, osierdzie będzie już nieobecne.
10. Wierzchołek serca chwyta się mikropincetą z ząbkami dla szczurów i wstrzykuje ciekły materiał macierzy w odległości jednej trzeciej wysokości od wierzchołka. Igłę wprowadza się równolegle do powierzchni osierdziowej, wstrzykując materiał ściętym końcem igły skierowanym w lewo. Należy unikać żyły wieńcowej wielkiej. Przed wyjęciem igły należy odczekać kilka sekund. W miejscu iniekcji powinno być widoczne wybielenie tkanki.
11. Usuwa się krew z jamy oraz kleszczyk do ręczników i patyczek kosmetyczny odsuwający prawe płuco. Do zamknięcia przepony używa się zakrzywionych mikrohemostatów i mikropincety z ząbkami dla szczurów. Wykonuje się pierwszy węzeł, a następnie za pomocą kleszczyków z rowkami i mikrohemostatów zamyka się przeponę szwem ciągłym za pomocą igły stożkowej. Przed całkowitym zamknięciem wprowadza się rurkę ssącą PE160 i za pomocą strzykawki 10 mL ewakuuje się jamę klatki piersiowej podczas zaciągania szwu.
12. Po prawidłowym opróżnieniu i zamknięciu przepona powinna być wklęsła. Wypukłość przepony wskazuje na obecność powietrza w jamie.
13. W tym momencie stężenie izofluranu można zmniejszyć do 1%.
14. Usuwa się obie nici Vicrile 3-0 utrzymujące jamę otwartą. Mięsień nawilża się wodą sterylną, wycierając nadmiar patyczkiem kosmetycznym lub sterylną gazą. Nowym odcinkiem nici 3-0 zamyka się warstwę mięśniową szwami przerywanymi.
15. W tym momencie izofluran można wyłączyć.
16. Miejsce operowane oczyszcza się wodą sterylną i zamyka skórę zszywkami. Jeśli zszywki mogłyby zakłócić badanie, można użyć nici proline 5-0. W takim przypadku skórę zamyka się szwami przerywanymi za pomocą igły tnącej odwrotnie (RC). W obu przypadkach miejsce zamkniętego nacięcia smaruje się punktowo klejem chirurgicznym.
17. Za pomocą patyczka kosmetycznego nacięcie smaruje się maścią z potrójnym antybiotykiem.
18. Zwierzęciu pozwala się dojść do siebie w atmosferze 100% tlenu.
19. Gdy zwierzę zaczyna oddychać synchronicznie z respiratorem, usuwa się rurkę tchawiczą.
20. Gdy zwierzęta przyjmą pozycję siedzącą (sternal), podaje się podskórnie 0.05 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny i przenosi je do domowej klatki na sterylnym ręczniku.
21. Zwierzęta powinny pozostawać pod obserwacją i opieką pooperacyjną.
22. W wybranych punktach czasowych zwierzęta są uśmiercane, a serca pobierane do analizy. Wykonuje się przekroje poprzeczne w osi krótkiej, które można barwić hematoksyliną i eozyną (H&E) do ogólnej analizy tkanki. W krótkich odstępach czasu obszar wstrzyknięcia będzie widoczny jako różowa, włóknista sieć rozprzestrzeniona śródmiąższowo. W późniejszych punktach czasowych zaobserwuje się napływ komórek i ostateczną degradację wstrzykniętej macierzy po 2 do 3 tygodniach. Jeśli ECM został znakowany biotyną przed iniekcją, można go zwizualizować bardziej bezpośrednio poprzez barwienie biotyny streptawidyną sprzężoną z HRP. Barwienie immunohistochemiczne można wykorzystać do identyfikacji konkretnych komórek lub struktur w obszarze iniekcji; tutaj preparaty zostały poddane podwójnemu barwieniu izolektyną sprzężoną z FITC, która wiąże się z komórkami śródbłonka i fluorescuje na zielono, oraz przeciwciałem przeciwko aktynie mięśni gładkich z wtórnym przeciwciałem Alexafluor, które wykazuje komórki mięśni gładkich (SMC) w kolorze czerwonym.

4. Reprezentatywne wyniki

Poprzednia charakterystyka materiałów macierzy przygotowanych w ten sposób wykazała retencję różnych makrocząsteczek. W szczególności za pomocą spektrometrii mas zidentyfikowano liczne białka włókniste i glikoproteiny (tabela 1). Jeśli okaże się, że materiały macierzy przetworzone zgodnie z tym protokołem nie zawierają już złożonego zestawu makrocząsteczek, może to oznaczać, że zastosowany protokół decelularyzacji jest zbyt agresywny. Po pełnej liofilizacji wysuszona ECM osierdzia przypomina bardzo sztywny, pognieciony papier. Inne rodzaje tkanek będą przypominać wypełniacze do paczek. Jeśli materiał zostanie dobrze zmielony, ECM powinna przejść przez sito i zostać zebrana w słoiku na dnie. Jeśli w próbce pozostanie wilgoć, ECM będzie się zbrylać i utknie w komorze mielącej. Po trawieniu roztwór ECM powinien mieć mleczny kolor i być całkowicie wolny od widocznych cząstek. Będzie on również nieco bardziej lepki niż sam HCl. Jeśli ECM nie ulegnie prawidłowemu trawieniu, w fiolce nadal będą znajdować się duże cząstki; alternatywnie ECM może wytrącić się z roztworu. Po skorygowaniu pH w roztworze nie następuje widoczna zmiana, a ECM pozostaje mętnym, jednorodnym płynem. Jeśli zacznie on żelować, lepkość wzrośnie, a pobranie materiału do strzykawki stanie się trudne lub niemożliwe. W takim przypadku należy przeprowadzić etap korekty pH w lodzie, używając schłodzonych wcześniej roztworów. Po przygotowaniu iniekcji należy przechowywać je w lodzie do momentu użycia. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, obszar wokół końcówki igły bieleje i widoczna jest mała grudka (bolus). Jeśli tego nie zaobserwowano, iniekcja mogła trafić do komory zamiast do ściany. Podczas zszywania zwierzęcia po iniekcji najważniejszym krokiem jest staranne zamknięcie przepony. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, przepona będzie ściśle przylegać do płuc i będzie wyglądać na wklęsłą. Jeśli w płucach pozostanie jakiekolwiek powietrze, przepona pozostanie wypukła lub będzie miała obszar, w którym wybrzusza się jak balon. Podczas badania histologicznego miejsca iniekcji we wczesnym punkcie czasowym (od 30 minut do 4 godzin po iniekcji) powinien być widoczny różowy, włóknisty obszar pozbawiony komórek — jest to zreorganizowany materiał macierzy po iniekcji (rycina 2). Sieć ta często rozprzestrzenia się śródmiąższowo i może być obecna w wielu przekrojach. Możliwym wyjaśnieniem obserwacji tylko bardzo małego obszaru żelu macierzy jest to, że część iniekcji ominęła cel wewnątrzścienny i została wstrzyknięta do komory LV lub wyciekła z miejsca iniekcji. Dodatkowo, w zależności od czasu żelowania, stopień rozprzestrzeniania śródmiąższowego może być różny.

Rysunek 1. Wyniki elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). (A) Standard masy cząsteczkowej. (B) Kolagen typu I z ogona szczura (2.5 mg/mL) w porównaniu do rozpuszczonej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) osierdzia ludzkiego (C) i świńskiego (D) (7 mg/mL). Zwróć uwagę na obecność kolagenu, a także kilku innych białek i peptydów w próbkach macierzy osierdziowej.

Tabela 1. Składniki ECM zidentyfikowane za pomocą spektrometrii masowej.

Rysunek 2. Wtryski do mięśnia sercowego: żelowanie in vivo. Barwienie H&E wtrysków macierzy osierdziowej ludzkiej (A) i świńskiej (B), które uległy żelowaniu in vivo po 45 minutach. Strzałki wskazują miejsce rozmieszczenia macierzy, zabarwionej na jaśniejszy róż niż mięsień sercowy. Pasek skali wynosi 500 μm.

Rysunek 3. Infiltracja komórek naczyniowych. Barwienie fluorescencyjne naczyń w wstrzykniętych żelach macierzowych ludzkich (A-C) i świńskich (D-F) po dwóch tygodniach. Komórki śródbłonka są znakowane na zielono (A, D), natomiast komórki mięśni gładkich na czerwono (B, E). Obrazy z nałożonymi kanałami przedstawiono w C i F. Pasek skali wynosi 100 μm. Białe linie przerywane wskazują obszar wstrzyknięcia macierzy, określony na podstawie analizy H&E sąsiedniego przekroju.

Rysunek 4. Komórki macierzyste w obszarze wstrzyknięcia macierzy. Barwienie Hoechst dla jąder (niebieski) oraz c-kit (zielony) identyfikuje komórki macierzyste w obszarach wstrzyknięcia macierzy u człowieka (A) i świni (B). Pasek skali wynosi 50 μm.

Dyskusja

Niniejsza metoda umożliwia wytwarzanie pochodnych biologicznie, wstrzykiwalnych rusztowań do inżynierii tkanki mięśnia sercowego. Chociaż metody te zostały początkowo opracowane w celu wytwarzania i testowania in vivo żelu z macierzy mięśnia sercowego i zaprezentowano je tutaj z wykorzystaniem żelu z macierzy osierdzia, protokół ten można dostosować do użytku z dowolną tkanką, pod warunkiem, że tkanka ta może zostać odpowiednio zdecelularyzowana. Decelularyzacja powinna zostać przeprowadzona i zweryfikowana prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki:
Pepsyna	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Liofilizowany
Biotyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidyna-HRP	Thomas Scientific	21130
Sprzęt:
Młyn Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Liofilizator Labconco	Labconco Corp.	7670520
Wyposażenie chirurgiczne:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Roztwór Ringera z mleczanem	MWI Veterinary Supply	003966
Żel KY	MWI Veterinary Supply	28658
Lidokaina, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Klorowodorek buprenorfiny	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Maść zastępcza do łez	Fisher Scientific	NC9860843
Potrójna maść antybiotykowa	Fisher Scientific	19082795
Izofluran	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoskop	MWI Veterinary Supply	008699
Kurek odcinający	MWI Veterinary Supply	006245
szew Vicryl 3-0	MWI Veterinary Supply	J327H
Szew z Proline 5-0	MWI Veterinary Supply	s-1173
igła tnąca odwrotna (RC)	Ethicon Inc.	8684G
Mikro clampy hemostatyczne	Fine Science Tools	13013-14
Mikrokleszczyki do zębów szczura	Fine Science Tools	11084-07
Skalpel nr 10	Fine Science Tools	10110-01
Nożyczki tępe	Fine Science Tools	14108-09
Ostre nożyczki zakrzywione	Fine Science Tools	14085-08
Duże pęsety ząbkowane	Fine Science Tools	1106-12
przewód ssawiący PE160	BD Biosciences	427430
Klipery	MWI Veterinary Supply	21608
Zszywki skórne/zszywacz skórny	Ethicon Inc.	PRR35
Ogólne materiały i odczynniki:
Mieszadła magnetyczne
0,1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% etanol
strzykawki 0,1 ml
strzykawka 10 ml
patyczki higieniczne
Klej chirurgiczny
Obłożenie chirurgiczne
Klematy ręcznikowe
Mały odkurzacz ręczny