Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Podsumowanie

W niniejszym protokole opisaliśmy nową metodę badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem systemu kokultury in vitro. Glejowe komórki kory mózgu szczura hodowano do osiągnięcia konfluencji, a następnie kokultywowano z wysoko oczyszczonymi neuronami z zwojów korzeni grzbietowych szczura. Bezpośrednio w tej samej kulturze porównano wpływ różnych komórek glejowych na adhezję neuronów oraz wzrost aksonów. Metoda ta stanowi nowy sposób bezpośredniego badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na adhezję neuronów i wzrost aksonów.

Streszczenie

W ośrodkowym układzie nerwowym wszystkich ssaków przerwane aksony po urazie nie są w stanie zregenerować się do swoich pierwotnych celów, a regeneracja funkcjonalna jest bardzo słaba ¹. Niepowodzenie regeneracji aksonów jest wynikiem kombinacji kilku czynników, w tym wrogiego środowiska komórek glejowych, hamujących cząsteczek związanych z mieliną oraz zmniejszonej wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów ². Astrocyty są najliczniejszym typem komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym i odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu aksonów w warunkach fizjologicznych i patologicznych ³. W przeciwieństwie do homologicznych oligodendrocytów, astrocyty stanowią heterogenną populację komórek złożoną z różnych subpopulacji astrocytów o zróżnicowanej morfologii i ekspresji genów ⁴. Znaczenie funkcjonalne tej heterogenności, na przykład w kontekście wpływu na wzrost aksonów, pozostaje w dużej mierze nieznane.

Aby zbadać komórki glejowe, a w szczególności wpływ heterogeniczności astrocytów na zachowanie neuronów, opracowaliśmy nową metodę polegającą na kokulturze wysoko oczyszczonych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych z komórkami glejowymi uzyskanymi z kory szczura. Dzięki tej technice mogliśmy bezpośrednio porównać adhezję neuronów i wzrost aksonów na różnych subpopulacjach astrocytów w tych samych warunkach.

W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy protokół tej metody izolacji i hodowli astrocytów, izolacji i oczyszczania neuronów z zwojów korzeni grzbietowych oraz kokultury neuronów DRG z astrocytami. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne obszary mózgu w celu badania specyficznych dla komórek lub regionów oddziaływań między neuronami a komórkami glejowymi.

Protokół

1. Hodowla komórek glejowych

Komórki glejowe można hodować z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Cały proces przedstawiono na schemacie procesu.

Dzień 1 Powlekanie płytek hodowlanych i szkiełek nakrywkowych

1. Wysuszyć wysterylizowane szklane okładki mikroskopowe w autoklawie.
2. Umieścić wysterylizowane okładki w sterylnej 24-dołkowej płytce hodowlanej.
3. Pokryć okładki poli-lizyną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Pokryć 6-dołkowe płytki hodowlane w ten sam sposób, co w kroku 3.
5. Przemyć okładki oraz 6-dołkową płytkę hodowlaną dwukrotnie wodą destylowaną i wysuszyć strumieniem powietrza w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
6. Dodać 20 μL pożywki DMEM (z 10% FBS) do każdego dołka w płytce 24-dołkowej oraz 2 mL do każdego dołka w płytce 6-dołkowej, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂

Dzień 2 Izolowanie kory i hodowla komórek glejowych

1. Zdezynfekuj komorę do preparatyki tkanek (positive flow dissection hood).
2. Włącz lampę UV na 20 min.
3. Spryskaj wszystkie powierzchnie 70% etanolem i odczekaj 15 min przed użyciem.
4. Zanurz młode szczury (P2-P6) w anestezji poprzez hipotermię, a następnie dokonaj dekapitacji u podstawy otworu wielkiego (foramen magnum) za pomocą nożyc operacyjnych.
5. Otwórz czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek irydowych i odchyl kości czaszki.
6. Usuń przedmózowie i umieść go w schłodzonym medium L15; pod stereomikroskopem ostrożnie oczyść oponę twardą i miękką wraz z naczyniami krwionośnymi, wyizoluj korę mózgową i kilkakrotnie przemyj medium L15.
7. Pokrój korę mózgową na małe fragmenty za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.
8. Dodaj 0,125% trypsyny-EDTA przygotowanej w medium L15 do fragmentów kory i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 min.
9. Przenieś bloki tkanki do probówki 50 mL zawierającej 20 mL medium DMEM z 20% FBS, dodaj roztwór zapasowy DNazy do stężenia końcowego 10 µg/mL, aspiruj zawiesinę tkankową góra-dół 20 razy za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
10. Przemyj zawiesinę komórkową raz medium DMEM, resuspenduj komórki w DMEM z 10% FBS, policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i wysiej komórki w zagęszczeniu 50-100/cm². Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, wymieniając połowę medium 2 razy w tygodniu.

2. Izolacja, hodowla i oczyszczanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych

Dzień 1 Przygotowanie materiału hodowlanego

1. Pokryć sterylizowane szkiełka nakrywki poli-lizyną, dwukrotnie przemyć szkiełka wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu, a następnie umieścić je w płytkach 24-dołkowych.
2. Dodać 10μL pożywki Neurobasal z 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL), a następnie włożyć płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni z 5% CO₂.

Dzień 2 Izolacja zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z embrionów

1. Sterylizację komory z laminarnym przepływem powietrza przeprowadzono w taki sam sposób, jak w przypadku hodowli komórek glejowych.
2. Hipotermicznie uśmiercono ciężarną szczurzycę (E15) poprzez przedawkowanie CO₂, zdezynfekowano brzuch 70% etanolem, a następnie wyizolowano zarodki z macicy i przeniesiono je do schłodzonego medium L15.
3. Pod stereomikroskopem wyizolowano rdzenie kręgowe wraz z połączonymi zwojami korzeni grzbietowych i przeniesiono je do naczyń 35mm z schłodzonym medium L15.
4. Przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek i przepłukano ją raz medium NBF (medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50 ng/mL)).

Dzień 3 Oczyszczanie neuronów z DRG

1. 18–24h po wysianiu neuronów dodać do hodowli neuronów skoncentrowany roztwór zapasu FUDR o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM i objętość końcową 20 μL.
2. 72h później wymienić połowę medium na medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50ng/mL) bez FUDR. Następnie wymieniać medium co drugi dzień.

3. Kokultura neuronów DRG z komórkami glejowymi

1. Gdy hodowla komórek glejowych osiągnęła konfluencję (około 20 dni po wysianiu), były one gotowe do kokultury z neuronami.
2. Na 24 godziny przed dodaniem oczyszczonych neuronów zmieniono medium komórek glejowych na medium Neurobasal zawierające 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL).
3. Oczyszczone neurony zebrano z dołków hodowlanych; zawiesinę pojedynczych komórek uzyskano poprzez mechaniczne przejście przez wypalaną pipetę Pasteura.
4. Po przeliczeniu liczby komórek, neurony wysiano w gęstości 500/cm² na konfluentne komórki glejowe w medium Neurobasal zawierającym 2% B27 i 2.5S NGF (50ng/mL).
5. Adhezję neuronów oraz wzrost neurytów na komórkach glejowych można było rejestrować i analizować w różnych punktach czasowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu oraz immunocytochemii z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danego typu komórek.

4. Reprezentatywne wyniki

1. Kultura komórek glejowych: Po wysianiu komórki glejowe osiągają konfluencję około 20. dnia. W badaniu pod mikroskopem fazokontrastowym łatwo było zidentyfikować, że różne morfologiczne subpopulacje komórek glejowych tworzą odmienne podstruktury wzorca wzrostu, a astrocyty wykazujące pozytywną reakcję na GFAP stanowiły ponad 90%, co wykazano techniką immunocytochemiczną (Rysunek 1, Rysunek 2).
2. Kultura neuronów z DRG: W zastosowanej metodzie, po 72-godzinnej inkubacji z FUDR, czystość neuronów z DRG osiąga poziom do 9% w ciągu 6 dni; neurony z DRG wykazały charakterystyczną morfologię oraz wysoką gęstość wzrostu neurytów (Rysunek 3, Rysunek 4).
3. Kokultura komórek glejowych i neuronów: Adhezja neuronów z DRG oraz wypustki neurytów rozwijały się sprawnie na komórkach glejowych w ciągu 4 godzin od wysiania; dokładne obserwacje wykazały, że adhezja neuronów i wzrost neurytów były zależne od subpopulacji komórek glejowych tworzących specjalne podstruktury wzorca wzrostu, co można było łatwo zidentyfikować pod mikroskopem fazokontrastowym oraz za pomocą immunocytochemii (Rysunek 5, Rysunek 6).

Rycina 1. Morfologia konfluencyjnych komórek glejowych. Komórki glejowe kory mózgu wysiano na szkiełka podstawkowe pokryte polilizyną i hodowano przez 20 dni; zwróć uwagę na różny wzorzec wzrostu komórek glejowych – komórki po lewej stronie są rozmieszczone promieniście.

Rycina 2. Konfluentne komórki glejowe znakowane przeciwciałem przeciwko gliałemu kwaśnemu białku włóknistemu (GFAP). Zwróć uwagę na promienisty układ komórek wykazujących pozytywną reakcję na GFAP (czerwone) po prawej stronie.

Rysunek 3. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych uległy wzrostowi in vitro bez zastosowania FUDR. Zanieczyszczające komórki stanowiły tło dla neuronów zzęłów korzeni grzbietowych (DRG).

Rycina 4. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych uległy wzrostowi in vitro po zastosowaniu FUDR. Zanieczyszczające tło komórkowe zostało całkowicie wyeliminowane.

Rysunek 5. Neurony zwojów korzeni grzbietowych hodowane na komórkach glejowych. Adhezja neuronów i wzrost neurytów zostały zahamowane na napromieniowanych uporządkowanych komórkach oraz ograniczone na komórkach glejowych po prawej stronie.

Rysunek 6. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych rosnące na komórkach glejowych znakowanych przeciwciałem przeciwko neurofilamentom. Wzrost neurytów (zielone) został zahamowany w obrębie napromieniowanych komórek glejowych po lewej stronie i ograniczony po prawej stronie; wszystkie komórki glejowe zostały znakowane przeciwciałem anty-GFAP (czerwone).

Dyskusja

Protokół tego eksperymentu został opracowany w celu realizacji dwóch założeń badawczych dotyczących komórek glejowych, a w szczególności wpływu heterogeniczności astrocytów na adhezję neuronów i wzrost neurytów. Pierwszym celem było maksymalne zachowanie heterogeniczności astrocytów; w tym eksperymencie konfluencyjna hodowla komórek glejowych wzbogacona w astrocyty stanowiła mieszaną hodowlę pierwotną, bez jakiejkolwiek obróbki chemicznej i pasażowania z trawieniem, co mogłoby dodatkowo uszkodzić komórki i wywołać odpowi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
pożywka L15	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
pożywka Neurobasal	Invitrogen	21103-049
poli-lizyna	Sigma-Aldrich	P4832	klasa hodowlana
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
suplement B27	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
przeciwciało przeciwko neurofilamentom	Abcam	ab24575