Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Podsumowanie

W niniejszym protokole opisaliśmy nową metodę badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem systemu kokultury in vitro. Glejowe komórki kory mózgu szczura hodowano do osiągnięcia konfluencji, a następnie kokultywowano z wysoko oczyszczonymi neuronami z zwojów korzeni grzbietowych szczura. Bezpośrednio w tej samej kulturze porównano wpływ różnych komórek glejowych na adhezję neuronów oraz wzrost aksonów. Metoda ta stanowi nowy sposób bezpośredniego badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na adhezję neuronów i wzrost aksonów.

Streszczenie

W ośrodkowym układzie nerwowym wszystkich ssaków przerwane aksony po urazie nie są w stanie zregenerować się do swoich pierwotnych celów, a regeneracja funkcjonalna jest bardzo słaba ¹. Niepowodzenie regeneracji aksonów jest wynikiem kombinacji kilku czynników, w tym wrogiego środowiska komórek glejowych, hamujących cząsteczek związanych z mieliną oraz zmniejszonej wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów ². Astrocyty są najliczniejszym typem komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym i odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu aksonów w warunkach fizjologicznych i patologicznych ³. W przeciwieństwie do homologicznych oligodendrocytów, astrocyty stanowią heterogenną populację komórek złożoną z różnych subpopulacji astrocytów o zróżnicowanej morfologii i ekspresji genów ⁴. Znaczenie funkcjonalne tej heterogenności, na przykład w kontekście wpływu na wzrost aksonów, pozostaje w dużej mierze nieznane.

Aby zbadać komórki glejowe, a w szczególności wpływ heterogeniczności astrocytów na zachowanie neuronów, opracowaliśmy nową metodę polegającą na kokulturze wysoko oczyszczonych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych z komórkami glejowymi uzyskanymi z kory szczura. Dzięki tej technice mogliśmy bezpośrednio porównać adhezję neuronów i wzrost aksonów na różnych subpopulacjach astrocytów w tych samych warunkach.

W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy protokół tej metody izolacji i hodowli astrocytów, izolacji i oczyszczania neuronów z zwojów korzeni grzbietowych oraz kokultury neuronów DRG z astrocytami. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne obszary mózgu w celu badania specyficznych dla komórek lub regionów oddziaływań między neuronami a komórkami glejowymi.

Protokół

1. Hodowla komórek glejowych

Komórki glejne można hodować z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Cały proces przedstawiono na schemacie przebiegu procedury.

Dzień 1 Powlekanie płytek hodowlanych i szkiełek nakrywkowych

1. Wysuszyć wysterylizowane szklane okrywek okrągłe do mikroskopu w autoklawie.
2. Umieścić wysterylizowane okrywki w sterylnej płytce hodowlanej z 24 dołkami.
3. Powlec okrywki poli-lizyną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Powlec płytki hodowlane z 6 dołkami w ten sam sposób, co w kroku 3.
5. Przemyć okrywki oraz płytkę hodowlaną z 6 dołkami dwukrotnie wodą destylowaną i wysuszyć powietrzem w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
6. Dodać 200 μL pożywki DMEM (z 10% FBS) do każdego dołka w płytce 24-dołkowej oraz 2 mL do każdego dołka w płytce 6-dołkowej, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂

Dzień 2: Izolacja kory mózgu i hodowla komórek glejowych

1. Sterylizować komorę do preparatyki tkanek.
2. Włączyć lampę UV na 20 min.
3. Spryskać wszystkie powierzchnie 70% etanolem i odczekać 15 min przed rozpoczęciem pracy.
4. Znieczulić młode szczury (P2-P6) poprzez hipotermię, a następnie przeprowadzić gilotynowanie u podstawy otworu wielkiego za pomocą nożyczek operacyjnych.
5. Otworzyć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek irydowych i usunąć sklepienie czaszki.
6. Usunąć przedmózowie i umieścić w schłodzonym medium L15; pod stereomikroskopem ostrożnie oczyścić oponę twardą i miękką wraz z naczyniami krwionośnymi, wyizolować korę mózgu i kilkukrotnie przemyć medium L15.
7. Pokroić korę mózgu na małe fragmenty za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.
8. Dodać 0,125% trypsyny-EDTA przygotowanej w medium L15 do fragmentów kory i inkubować w 37 °C przez 15 min.
9. Przenieść bloki tkanki do 20 mL medium DMEM z 20% FBS w probówce 50 mL, dodać roztwór stokowy DNazy do stężenia końcowego 10 µg/mL, aspirując i wydmuchując roztwór tkankowy 20 razy za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
10. Jednokrotnie przemyć zawiesinę komórkową medium DMEM, resuspenderć komórki w DMEM z 10% FBS, policzyć komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i wysiać komórki w gęstości 5000-10000/cm². Hodować komórki w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2, wymieniając połowę medium 2 razy w tygodniu.

2. Izolacja, hodowla i puryfikacja neuronów z zwojów korzeni grzbietowych

Dzień 1 Przygotowanie materiału hodowlanego

1. Pokryć wysterylizowane szkiełka podstawowe poli-lizyną, przemyć je dwukrotnie wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu, a następnie umieścić w płytkach 24-dołkowych.
2. Dodać 100μL pożywki Neurobasal z 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL), a następnie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

Dzień 2 Izolacja zwojów korzeniowych tylnych (DRG) z embrionów

1. Sterylizację dygestorium przeprowadzono w ten sam sposób, co w przypadku hodowli komórek glejowych.
2. Uśmiercono ciężarną szczurzycę (E15) poprzez przedawkowanie CO₂, zdezynfekowano brzuch 70% etanolem, a następnie wyizolowano embriony z macicy i przeniesiono je do schłodzonego medium L15.
3. Pod stereomikroskopem wyizolowano rdzenie kręgowe wraz z połączonymi zwojami korzeni grzbietowych i przeniesiono je do szalek 35 mm z schłodzonym medium L15.
4. Przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek i przepłukano ją raz medium NBF (medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50 ng/mL)).

Dzień 3 Oczyszczanie neuronów DRG

1. Od 18 do 24 h po wysianiu neuronów, dodać do hodowli neuronów stężony roztwór zapasowy FUDR (1 mM) do uzyskania stężenia końcowego 20 μM i objętości końcowej 200 μL.
2. Po 72 h wymienić połowę medium na medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50 ng/mL) bez dodatku FUDR. Następnie wymieniać medium co drugi dzień.

3. Kokultywacja neuronów DRG z komórkami glejowymi

1. Gdy hodowla komórek glejowych osiągnęła konfluencję (około 20 dni po wysianiu), były one gotowe do kokultury z neuronami.
2. Na 24 godziny przed dodaniem oczyszczonych neuronów, pożywkę komórek glejowych zmieniono na pożywkę Neurobasal zawierającą 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL).
3. Oczyszczone neurony zebrano z dołków hodowlanych; zawiesinę pojedynczych komórek uzyskano poprzez mechaniczne przejście przez wypalaną pipetę Pasteura.
4. Po przeliczeniu komórek, neurony wysiano w zagęszczeniu 500/cm² na konfluentne komórki glejowe w pożywce Neurobasal zawierającej 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL).
5. Adhezję neuronów oraz wzrost neurytów na komórkach glejowych można było rejestrować i analizować w różnych punktach czasowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu oraz immunocytochemii z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danego typu komórek.

4. Reprezentatywne wyniki

1. Kultura komórek glejowych: Po wysianiu komórki glejowe osiągną konfluencję około 20 dnia. Pod mikroskopem fazokontrastowym łatwo zidentyfikowano, że różne morfologiczne subpopulacje komórek glejowych tworzyły zróżnicowane podstruktury wzorców wzrostu, a astrocyty wykazujące pozytywny wynik dla GFAP stanowiły ponad 90%, co wykazano za pomocą techniki immunocytochemicznej (Rycina 1, Rycina 2).
2. Kultura neuronów DRG: W zastosowanej metodzie, po 72-godzinnejy obróbce FUDR, czystość neuronów DRG osiągnie poziom do 99% w ciągu 6 dni; neurony DRG wykazały charakterystyczną morfologię oraz gęsty wzrost neurytów (Rycina 3, Rycina 4).
3. Kokultura komórek glejowych i neuronów: Adhezja neuronów DRG i wyrastanie neurytów na komórkach glejowych następowało szybko w ciągu 4 godzin od wysiania. Wnikliwe obserwacje wykazały, że adhezja neuronów i wzrost neurytów były uwarunkowane przez subpopulacje komórek glejowych tworzące specyficzne podstruktury wzorców wzrostu, co można było łatwo zidentyfikować pod mikroskopem fazokontrastowym oraz za pomocą immunocytochemii (Rycina 5, Rycina 6).

Rycina 1. Morfologia konfluentnych komórek glejowych. Komórki glejowe kory mózgu wysiano na szkiełka podstawkowe pokryte polilizyną i hodowano przez 20 dni; zwróć uwagę na odmienny wzór wzrostu komórek glejowych, gdzie komórki po lewej stronie są ułożone promieniście.

Rysunek 2. Konfluentne komórki glejowe znakowane przeciwciałem przeciwko glialnemu białku kwaśnemu (GFAP). Zwróć uwagę na promienisty układ komórek wykazujących pozytywną reakcję z GFAP (kolor czerwony) po prawej stronie.

Rycina 3. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych rosły in vitro bez zastosowania FUDR. Komórki zanieczyszczające stanowiły tło dla neuronów DRG.

Rysunek 4. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych rosły in vitro po zastosowaniu FUDR. Komórki zanieczyszczające w tle zostały całkowicie wyeliminowane.

Rycina 5. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych hodowane na komórkach glejowych. Adhezja neuronów i wzrost neurytów zostały zahamowane na napromieniowanych komórkach ułożonych w strukturę oraz ograniczone na komórkach glejowych po prawej stronie.

Rysunek 6. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych rosnące na komórkach glejowych znakowanych przeciwciałem przeciwko neurofilamentom. Wzrost neurytów (zielony) został zahamowany na napromieniowanych komórkach glejowych po lewej stronie i ograniczony po prawej stronie; wszystkie komórki glejowe zostały znakowane przeciwciałem GFAP (czerwony).

Dyskusja

Protokół tego eksperymentu został opracowany w celu realizacji dwóch założeń badawczych dotyczących komórek glejowych, a w szczególności wpływu heterogeniczności astrocytów na adhezję neuronów i wzrost neurytów. Pierwszym celem było maksymalne zachowanie heterogeniczności astrocytów; w tym eksperymencie konfluencyjna hodowla komórek glejowych wzbogacona w astrocyty stanowiła mieszaną hodowlę pierwotną, bez jakiejkolwiek obróbki chemicznej i pasażowania z trawieniem, co mogłoby dodatkowo uszkodzić komórki i wywołać odpowi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
pożywka L15	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
pożywka Neurobasal	Invitrogen	21103-049
poli-lizyna	Sigma-Aldrich	P4832	klasa hodowlana
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
suplement B27	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
przeciwciało przeciwko neurofilamentom	Abcam	ab24575