Artykuł metodologiczny

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2122

⸱

26 sierpnia 2010

 ,  ,  , 
1Schulich Faculty of Chemistry, The Technion, Israel Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje metodę mikroobrazowania za pomocą rezonansu spin-elektronowego (ESR) do trójwymiarowego mapowania poziomu tlenu w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z rozdzielczością w skali mikronowej1. Tlen jest jedną z najważniejszych cząsteczek w cyklu życia. Służy jako końcowy akceptor elektronów w fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach i jest wykorzystywany w produkcji reaktywnych form tlenu. Pomiary tlenu są istotne dla badania funkcji mitochondrialnych i metabolicznych, szlaków sygnalizacyjnych, efektów różnych bodźców, przepuszczalności błon oraz różnicowania chorób. Zużycie tlenu stanowi zatem informacyjny marker metabolizmu komórkowego, który znajduje szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych – od mitochondriów i komórek po całe organizmy. Ze względu na jego znaczenie opracowano wiele metod pomiaru tlenu w żywych systemach. Obecne próby zapewnienia obrazowania tlenu o wysokiej rozdzielczości opierają się głównie na metodach fluorescencyjnych i fosforyzacyjnych, które nie dają satysfakcjonujących wyników, ponieważ wykorzystują sondy o wysokiej fototoksyczności i niskiej czułości na tlen. ESR, który mierzy sygnał z egzogennych sond paramagnetycznych w próbce, jest znany z zapewniania bardzo dokładnych pomiarów stężenia tlenu. W typowym przypadku pomiary ESR mapują poszerzenie kształtu linii i/lub skrócenie czasu relaksacji sondy, które są bezpośrednio powiązane z lokalnym stężeniem tlenu. (Tlen jest paramagnetyczny; w związku z tym, podczas kolizji z egzogenną sondą paramagnetyczną, skraca on jej czasy relaksacji). Tradycyjnie tego typu eksperymenty są przeprowadzane z niską rozdzielczością, w skali milimetrowej, w obrazowaniu ESR małych zwierząt. Tutaj pokazujemy, jak obrazowanie ESR może być prowadzone również w skali mikronowej w celu badania małych żywych próbek. Mikroobrazowanie ESR jest stosunkowo nową metodologią, która umożliwia pozyskiwanie sygnałów ESR z rozdzielczością przestrzenną zbliżoną do 1 μm w temperaturze pokojowej2. Głównym celem niniejszej publikacji protokołu jest pokazanie, w jaki sposób ta nowa metoda, wraz z nowo opracowanymi sondami czułymi na tlen, może być zastosowana do mapowania poziomu tlenu w małych żywych próbkach. Wykazano rozdzielczość przestrzenną rzędu ~30 x 30 x 100 μm, z czułością na stężenie tlenu w zakresie bliskim mikromolarnemu oraz bezwzględną czułością na tlen poniżej femtomola na woxel. Zastosowanie mikroobrazowania ESR do mapowania tlenu w pobliżu komórek uzupełnia obecnie dostępne techniki oparte na mikroelektrodach lub fluorescencji/fosforyzacji. Ponadto, przy zastosowaniu odpowiedniej sondy paramagnetycznej, metoda ta będzie łatwo przydatna do wewnątrzkomórkowego mikroobrazowania tlenu – możliwości, którą innym metodom bardzo trudno jest osiągnąć.

Protokół

1. Przegląd mikroobrazowania ESR

W pierwszej kolejności przedstawiamy zwięzłe wyjaśnienie zasad ESR, mikroskopii ESR oraz poszczególnych komponentów naszego systemu, a następnie opisujemy przebieg właściwych eksperymentów obrazowania.

Elektronowy rezonans spinowy jest techniką spektroskopową, w której promieniowanie elektromagnetyczne o określonej częstotliwości jest absorbowane przez cząsteczki z niesparowanymi spinami elektronowymi, umieszczone w zewnętrznym statycznym polu magnetycznym (Rysunek 1). ESR jest wykorzystywany w szerokich obszarach nauki, takich jak chemia, biologia, fizyka i inżynieria materiałowa, do detekcji i identyfikacji wolnych rodników oraz centrów paramagnetycznych. Jest to potężna metoda badania otoczenia cząsteczek paramagnetycznych w żywych organizmach, dostarczająca informacji o kwasowości (pH), lepkości oraz stężeniach tlenu i reaktywnych form tlenu3.

W przypadku próbek heterogenicznych informacje spektralne ESR można uzyskać w sposób rozdzielony przestrzennie (t.j. poprzez otrzymanie obrazu), dzięki zastosowaniu gradientów pola magnetycznego4. Jest to bardzo podobne do powszechniejszej metody obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI), która obserwuje głównie spiny protonowe. Do tej pory takie techniki obrazowania ESR stosowano w przypadku żywych okazów o stosunkowo dużym rozmiarze kilku centymetrów i rozdzielczości w skali mm. (Patrz na przykład Rysunek 2, pochodzący z odniesienia 5). Stosunkowo niedawnym osiągnięciem w obrazowaniu ESR jest rozszerzenie jego możliwości z badania małych zwierząt w rozdzielczości milimetrowej na pomiary próbek o rozmiarach milimetrowych i podmilimetrowych z rozdzielczością w skali mikronowej. Dziedzina ta jest znana jako mikroskopia ESR, która obecnie pozwala na uzyskanie trójwymiarowych obrazów ESR o rozdzielczości zbliżonej do 1 mikrona 2 (reprezentatywne przykłady przedstawiono na Rysunku 3).

Mikroskop ESR jest zasadniczo podobny do konwencjonalnego spektrometru ESR. Posiada magnes do wytwarzania pola statycznego, układ mikrofalowy do wzbudzania spinów i detekcji sygnału, sondę do trzymania próbki oraz komputerową konsolę do sterowania procesem akwizycji i przetwarzania danych. Innymi komponentami charakterystycznymi dla obrazowania ESR w ogóle, obecnymi również w mikroskopii ESR, są źródła gradientu pola magnetycznego, które stanowią część układu elektronicznego, oraz cewki gradientowe znajdujące się w sondzie obrazującej. Więcej szczegółów na temat naszego konkretnego systemu przedstawiono w filmie z protokołem oraz opisano w odniesieniu 2.

2. Przygotowanie próbek do mikroobrazowania ESR

Ten etap opisuje metodę przygotowania próbek do eksperymentu mikroobrazowania ESR. Na koniec tego etapu komórki zostają umieszczone na dnie specjalnie przygotowanego szklanego pojemnika do mikroskopii ESR wraz z buforem zawierającym rodnik trytylowy6. Protokół ten opisuje pomiar komórek cyjanobakterii, dlatego w przypadku innych typów komórek na etapie przygotowania próbek mogą być wymagane odpowiednie korekty.

  1. Najpierw należy przygotować kilka kwadratów papieru chłonnego o rozmiarze ok. 400 400 μm pobiera się i umieszcza w probówce Eppendorfa, którą następnie napełnia się 1,2 ml zawiesiny cyjanobakterii (o stężeniu 40 mg/ml).
  2. Zawiesinę wiruje się przez 2 minuty przy 6000 obr./min w mikrocentry fudze.
  3. Następnie całkowicie usuwa się bufor z supernatantu, pozostawiając jedynie około50 μL które pozostawia się, aby zapobiec odwodnieniu cyjanobakterii. W wyniku tego procesu papier absorbujący zostaje nasycony komórkami cyjanobakterii.
  4. Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyekstrahować kilka włókien z papieru i umieścić je na dnie specjalnie przygotowanego szklanego uchwytu na próbki w kształcie kielicha.7Następnie zastosowano 3 mM trytylu w roztworze BG-11.8, 9 (patrz Schemat 1) nanosi się do uchwytu próbki za pomocą cienkiej strzykawki. Następnie uchwyt uszczelnia się za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV, pozostawiając otwarty niewielki otwór odprowadzający powietrze.
    Roztwór zapasowy 4Zapas 3Roztwór zapasowy 2Roztwór stok 1
    H3BO3
    2,86 g/l    		K2HPO (mikroskopia wysokorozdzielcza)4 :3H2O
    4,0 g/l    		MgSO4 : 7H2O
    7,5 g/l    		Na2Mg EDTA 0,1 g/l
    MnCl22 :4H2O
    1,81 g/l    		  Cytrynian amonu i żelaza(III) 0,6 g/l
    ZnSO₄4 7H2O
    0,222 g/l    		  Kwas cytrynowy :1H2O
    0,6 g/l
    CuSO₄4 :5H2O
    0,079 g/l    		  CaCl22 2H2O
    3,6 g/l
    COCl2 :6H2O
    0,050 g/l    		   
    NaMoO42H2O
    0,391 g/l    		   

    Schemat 1. Przygotowanie pożywki BG-11.

3. Eksperymenty mikroobrazowania ESR

  1. Aby rozpocząć eksperyment obrazowania, należy włączyć system mikroobrazowania ESR i umieścić próbkę w rezonatorze znajdującym się wewnątrz sondy obrazującej.
  2. Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego komputerem, należy ustawić system w tryb „Tune” i wyznaczyć rezonansową częstotliwość mikrofal sondy, która będzie wykorzystywana do pomiarów ESR.
  3. Po tym kroku należy ustawić statyczne pole magnetyczne na wartość odpowiadającą zastosowanej częstotliwości mikrofal, określić parametry czasowe sekwencji impulsów i zaobserwować sygnał ESR, aby upewnić się, że system działa prawidłowo, a próbka jest odpowiednio przygotowana.
  4. Następnie należy ustawić parametry obrazowania, takie jak liczba pikseli, natężenie gradientów oraz czas trwania impulsów gradientowych, na wymagane wartości.
  5. Po konfiguracji należy zebrać trzy trójwymiarowe obrazy ESR za pomocą sekwencji impulsów obrazowania echa Hana (Rysunek 4) z odstępami międzyimpulsowymi wynoszącymi 500, 600 i 700 ns.
  6. Światło kierowane na próbkę jest włączane lub wyłączane w zależności od wymaganych warunków eksperymentalnych.
  7. Podczas akwizycji dane są zapisywane automatycznie. Te surowe pliki danych są następnie przetwarzane za pomocą skryptu w programie Matlab w celu uzyskania obrazów stężenia rodników trytylowych oraz mapy czasu relaksacji T2, która jest przeliczana na obraz stężenia tlenu przy użyciu istniejącej kalibracji.

4. Reprezentatywne wyniki

Wynikami eksperymentu jest kilka trójwymiarowych mikroobrazów ESR zarejestrowanych dla różnych wartości τ. Typowe obrazy danych surowych przedstawiono na Rysunku 5. Trzy górne obrazy, wykonane w ciemności, są bardzo podobne, z wyjątkiem zmniejszenia intensywności sygnału. Z kolei wzór obrazu zmienia się pod wpływem naświetlania ze względu na różne czasy relaksacji w różnych częściach próbki. Dane te można przetworzyć1, aby uzyskać obraz amplitudy, jak pokazano na Rysunku 6, a także obrazy czasu relaksacji, T2 (Rysunek 7). Obrazy T2 są przeliczane na wartości stężenia tlenu za pomocą istniejącej krzywej kalibracyjnej, która wiąże stężenie tlenu z czasem relaksacji zgodnie z równaniem:
Równanie kinetyki chemicznej, schemat szybkości reakcji enzymatycznej, analiza kinetyczna zależna od T2(C,D)

Tutaj T20 to czas relaksacji spin-spin sondy w warunkach anoksycznych (zależny od stężenia sondy, C, oraz jej współczynnika dyfuzji, D), a k to stała proporcjonalności. W większości przypadków współczynnik dyfuzji nie zmienia się znacząco w przypadku żywych próbek (choć w razie potrzeby może on zostać w zasadzie bezpośrednio wyznaczony również za pomocą ESR 6, 10), a stężenie spinów jest wyznaczane podczas procesu obrazowania. Zatem zależność ta może być wykorzystana do bezpośredniego pomiaru stężenia tlenu.

Wracając do rysunku 6, z obrazu amplitudy wynika wyraźnie, że komórki cyjanobakterii znajdowały się głównie po prawej stronie uchwytu próbki. Ponadto, na podstawie rysunku 7 widać, że światło inicjuje produkcję O2 i powoduje znaczny wzrost stężenia O2 w roztworze, głównie w wokselach znajdujących się w pobliżu cyjanobakterii.

Diagram rezonansu spinowego elektronów, energia względem pola magnetycznego, pokazujący ΔE=hv z częstotliwością mikrofal
Rysunek 1: Poziomy energetyczne w rezonansie spinowym elektronów.

Statyczny obraz MRI przedstawiający anatomię, z zaznaczonym guzkiem; schemat mapy pO2 wskazujący poziom tlenu (mmHg).
Rysunek 2: Typowy obraz stężenia tlenu u myszy z guzkiem nowotworowym. Obraz po lewej stronie przedstawia informacje anatomiczne na podstawie obrazu MRI. Myszy wstrzyknięto stabilny wolny rodnik organiczny, a jego charakterystyka ESR pozwala określić stężenie tlenu w jego otoczeniu (po prawej). Wyniki oparte na ESR zostały nałożone na anatomiczny obraz MRI. Pole widzenia wynosi 32 mm.

Obrazy optyczne i ESR przedstawiające litery STU; obrazowanie i analiza elektronowego rezonansu spinowego.
Rysunek 3: Dwa przykłady wysokorozdzielczych obrazów ESR w mikroskali z próbek wytworzonych fotolitograficznie z proszku N@C60 (lewo) oraz paramagnetycznych kryształów LiPc (prawo)

Schemat sekwencji impulsów, proces echa spinowego, impulsy MW, gradienty Gx, Gy, Gz, spektroskopia NMR.
Rycina 4: Typowa sekwencja impulsów w obrazowaniu Hana, przedstawiająca impulsy mikrofalowe (MW) oraz gradienty Gx, Gy i Gz.

Spektroskopia absorpcyjna przejściowa; 6 zestawów danych wykazujących τ=500-700ns, w warunkach ciemności/oświetlenia; schemat.
Rysunek 5: Typowe mikroobrazy ESR z surowych danych: a, b i c to surowe dane z próbki Cyanobacterium bez oświetlenia, zmierzone odpowiednio dla τ = 500, 600, 700 ns. Elementy d, e i f są analogiczne do a, b i c, ale z oświetleniem. Intensywność przedstawiono w skali arbitralnej (jest ona jednak spójna w obrębie każdego zestawu trzech surowych obrazów w ciemności lub przy oświetleniu)

Mapa cieplna spektroskopowa; gradient stężenia od 0 do 25 µM; analiza rozkładu chemicznego.
Rysunek 6: Obraz amplitudy odpowiadający stężeniu rodników w roztworze (skala dowolna).

Porównanie ciemności i światła w wynikach obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM); mapy zakodowane kolorami.
Rysunek 7: T2 obrazy oraz odpowiadające im wartości [O2] w warunkach ciemności (lewo) i oświetlenia (prawo).

Dyskusja

Niniejszy protokół pokazuje, w jaki sposób mikroobrazowanie ESR może zostać zastosowane do mapowania stężenia tlenu w pobliżu żywych, małych próbek. Wykazano rozdzielczość przestrzenną rzędu ~30 x 30 x 100 μm, przy czułości na stężenie tlenu w zakresie bliskim mikromolarnemu oraz bezwzględnej czułości na tlen poniżej femtomola na voksel. Zastosowanie mikroobrazowania ESR do mapowania tlenu w pobliżu komórek uzupełnia obecnie dostępne techniki oparte na mikroelektrodach lub fluorescencji/fosforescencji. Ponadto, przy zastosowaniu odpowiedniej sondy paramagnetycznej, metoda ta znajdzie bezpośrednie zastosowanie w wewnątrzkomórkowym mikroobrazowaniu tlenu – możliwości, którą innym metodom bardzo trudno jest osiągnąć. W najbliższej przyszłości planujemy dalsze udoskonalenie tej metodologii, aby uzyskać obrazy żywych próbek z rozdzielczością kilku mikronów, dostarczając parametry kontrastu, takie jak stężenie nadtlenku, kwasowość (pH), współczynnik dyfuzji sondy i, oczywiście, stężenie tlenu. Możliwości te są komplementarne względem obecnych metodologii opartych na optyce, zarówno pod względem rodzaju kontrastu, jak i charakterystyki próbek (np. nieprzezroczyste, grube próbki oraz w niektórych przypadkach pomiary wewnątrzkomórkowe w przeciwieństwie do zewnątrzkomórkowych).

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była częściowo finansowana z grantu nr 213/09 z Israeli Science Foundation, grantu nr 2005258 z fundacji BSF, grantu nr 201665 z Europejskiej Rady ds. Badań (ERC) oraz przez Russell Berrie Nanotechnology Institute na Technionie. Dziękujemy prof. Noamowi Adirowi i Farisowi Salamie z Wydziału Chemii Schulich na Technionie za pomoc w dostarczeniu i obsłudze cyjanobakterii. Wyrażamy głęboką wdzięczność za pomoc i wsparcie Svetlany Yoffis z Jednostki Mikro- i Nanofabrykacji na Technionie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WirówkaKendroHeraus, 75003235
W pełni zdeutrowany rodnik triarylmetylowy (trytylowy)NowosybirskZsyntetyzowany w Nowosybirsku metodą opisaną w referencji 6.
Bufor BG-11Instrukcję przygotowania zawiera Schemat 1 oraz referencje 8, 9.
StrzykawkaHamilton CoMicroliter 7000.5
Utwardzanie promieniami UVNorland Products, Inc.NOA63 lub NOA61.

Bibliografia

  1. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).
  2. Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
  3. Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why? NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
  4. Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR imaging and in vivo EPR. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
  5. Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
  6. Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).
  7. Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
  8. Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
  9. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
  10. Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroobrazowanie ESRywe kom rkicyjanobakterieobrazowanie tr jwymiarowesondy paramagnetycznepomiar czasu relaksacjigradienty pola magnetycznegorozdzielczo przestrzenna

Powiązane artykuły