Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larwalnych Drosophila w 3stadium rozwojowym

Podsumowanie

Larwy Drosophila melanogaster stanowią idealny system modelowy do badania mechanizmów transportu aksonalnego w obrębie larwalnych nerwów segmentowych. Korzystając z tej procedury, larwy w 3.^stadium rozwojowym noszące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Streszczenie

Drosophila melanogaster wyłania się jako potężny system modelowy do badania rozwoju i funkcji układu nerwowego, szczególnie ze względu na jego wygodną genetykę i w pełni zsekwencjonowany genom. Ponadto układ nerwowy larw jest idealnym układem modelowym do badania mechanizmów transportu aksonalnego, ponieważ nerwy segmentowe larw zawierają wiązki aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w mózgu, a ich zakończenia nerwowe kończą się na całej długości ciała. Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji białek pęcherzyków synaptycznych w obrębie larwalnych nerwów segmentalnych. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, wszystkie elementy układu nerwowego, wraz z powiązanymi tkankami, takimi jak mięśnie i NMJ, pozostają nienaruszone, nieuszkodzone i gotowe do wizualizacji. Larwy w trzecim^{stadium rozwojowym} niosące różne mutacje są preparowane, utrwalane, inkubowane z przeciwciałami pęcherzyków synaptycznych, wizualizowane i porównywane z larwami typu dzikiego. Procedura ta może być dostosowana do kilku różnych przeciwciał synaptycznych lub neuronalnych, a zmiany w rozmieszczeniu różnych białek można łatwo zaobserwować w nerwach segmentowych larw.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj 1x bufor preparacyjny przy użyciu 128 mM NaCl, 4mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, 2 mM KCl, 5mM HEPES i 36mM Sacharozy. PH roztworu do 7,2 i wysterylizować filtr.
2. Przygotować utrwalacz, używając 16% formaldehydu rozcieńczonego w stosunku 1:1 i 1x buforu rozwarstwiającego.
3. Przygotować 1x PBT przy użyciu 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,2 i Triton X-100 w stosunku 1:100.
4. Przygotuj 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) z 0,01% Azydkiem Na w 1x PBS.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Do preparacji używa się naczyń Sylgarda. Przygotuj potrawy, wlewając mieszaninę elastomeru silikonowego Sylgard 184 i utwardzacza do szalki Petriego. Poczekaj, aż mieszanina całkowicie zestali się i wyschnie przed użyciem.
2. Przed sekcją zbierz czystą parę kleszczy #5, czystą parę nożyczek vannas z prostym ostrzem i szpilki.

3. Sekcja larw 3^rd Instar

1. Zbierz wędrujące larwy 3 stopnia rozwojowego o określonym genotypie na szalce Petriego.
2. Umyj larwy w wodzie dejonizowanej, aby pozbyć się jedzenia.
3. Umieść larwę na szalce sylgard, grzbietem do góry. Przypnij larwę na jej przednim i tylnym końcu.
4. Umieść kroplę 1x Bufor Rozwarstwiający na przypiętej larwie. Za pomocą cienkich nożyczek przytnij larwę na grzbietowej linii środkowej w pobliżu tylnego końca. Za pomocą nożyczek odetnij naskórek larwy od tylnego końca do przedniego końca.
5. Umieść kroplę nowego 1x Bufor Rozwarstwiającego na wypreparowanej larwie. Za pomocą szpilki wybierz jedną boczną krawędź naskórka w pobliżu środka larwy i przypnij naskórek. Za pomocą innej szpilki przypnij drugą boczną krawędź naskórka, jak pokazano na schemacie. Po każdej stronie bocznej znajdują się dwa kołki. Zobacz diagram poniżej.
6. Ostrożnie usuń jelita, ciała tłuszczowe i tchawicę, pozostawiając tylko mózg z dwoma płatami optycznymi i zwojami brzusznymi z przyczepionymi nerwami segmentowymi. Pozostała część procedury jest wykonywana na szalce sylgardowej.

4. Utrwalenie wypreparowanej larwy

1. Wysiaduj wypreparowaną larwę w fix przez 30 minut, wymieniając poprawkę co 15 minut.
2. Po utrwaleniu płukać larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Ważne jest, aby pamiętać, że larwa powinna zawsze znajdować się w buforze.

5. Barwienie przeciwciał w wypreparowanej larwie

1. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z Azydkiem Na w 1x PBT. Optymalne stężenia będą się różnić dla różnych przeciwciał.
2. Zastąp ostatnie płukanie 1x PBT przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze 4°C przez noc. Wilgotna komora jest zbudowana poprzez wyłożenie plastikowego naczynia chusteczkami nasączonymi wodą.
3. Następnego dnia płucz wypreparowaną larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.
4. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z Na Azide w 1x PBT i inkubować larwę w roztworze przeciwciała drugorzędowego w temperaturze 25°C przez godzinę. Owiń wilgotną komorę folią, aby zapobiec przedostawaniu się światła, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.
5. Po inkubacji płukać larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.

6. Montaż i wizualizacja wypreparowanej larwy

1. Przed zamontowaniem larwy na szkiełku należy przygotować szkiełko, rozprowadzając dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku, z wystarczającą przestrzenią, aby można było usiąść na szkiełku nakrywkowym (patrz schemat). Pozostaw lakier do paznokci do całkowitego wyschnięcia.
2. Umieść kroplę bufora montażowego w przestrzeni między pionowymi liniami lakieru do paznokci na szkiełku (patrz schemat). Slajd jest teraz gotowy do montażu.
   
   
3. Po ostatnim płukaniu 1x PBT, delikatnie wyjmij boczne kołki. Uważaj, aby nie rozerwać naskórka.
4. Ostrożnie usuń dwie pozostałe szpilki i podnieś larwę kleszczami i umieść larwę poziomo na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie jest przewrócona i jest zorientowana brzusznie do góry.
5. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci (patrz schemat). Larwa jest teraz gotowa do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larw larwy typu dzikiego wykorzystujących przeciwciała przeciwko białku cysteiny białka cysteiny białka pęcherzyków synaptycznych (CSP, Zinsmaier et al.1994 ). Zauważ, że nerwy segmentowe są gładko zabarwione. Bar = 20 μm

Rysunek 2: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larw larwy zmutowanej białko motorycznej wykorzystującej przeciwciała przeciwko białku cysteiny białka cysteinowego białka pęcherzyków synaptycznych (CSP). Zauważ, że nerwy segmentowe wykazują masywne nagromadzenia, które barwią się jasno dla CSP (strzałki).

Dyskusja

Nerwy segmentowe larw Drosophila są potężnym systemem do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Jeśli sekcja larw w 3.^stadium rozwojowym zostanie wykonana prawidłowo, wszystkie składniki OUN, PNS i powiązanych tkanek, takich jak mięśnie i NMJ, mogą być badane w obrębie jednej larwy. Zaadaptowaliśmy ten protokół z tego opublikowanego przez Hurda i Saxtona (1996). Protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnych, ale należy przeprowadzić optymalizację przeciwciał....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dumont #5 Kleszcze	Fine Science Tools	11252-20
Minutien Pins, Narzędzia do nauki ze stali nierdzewnej		26002-10
Mcpherson-Vannas Proste ostrze 8 cm Nożyczki	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, Medium montażowe	Vector Laboratories	H-1000
Sylgard 184 Elastomer	silikonowy Dow Corning	4026148
formaldehyd, 16%	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710
dCSP3	Badania rozwojowe Bank hybrydoma Alexa
Fluor 568 Koza Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004