Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Podsumowanie

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3^{Badania i rozwój} larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Streszczenie

Drosophila melanogaster staje się potężnym systemem modelowym do badania rozwoju i funkcji układu nerwowego, przede wszystkim ze względu na dogodną genetykę i w pełni zsekwencjonowany genom. Ponadto układ nerwowy larw stanowi idealny system modelowy do badania mechanizmów transportu aksonalnego, ponieważ larwalne nerwy segmentalne zawierają pęczki aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w mózgu, a zakończenia nerwowe rozciągają się wzdłuż ciała. W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji białek pęcherzyków synaptycznych w larwalnych nerwach segmentalnych. Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy układu nerwowego, wraz z powiązanymi tkankami, takimi jak mięśnie i połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ), pozostają nienaruszone, nieuszkodzone i gotowe do wizualizacji. Larwy w 3^rd stadium rozwoju niosące różne mutacje są preparowane, utrwalane, inkubowane z przeciwciałami przeciwko białkom pęcherzyków synaptycznych, wizualizowane i porównywane z larwami typu dzikiego. Procedurę tę można dostosować do kilku różnych przeciwciał synaptycznych lub neuronalnych, a zmiany w rozkładzie wielu różnych białek można łatwo zaobserwować w larwalnych nerwach segmentalnych.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj 1x bufor do sekcji, wykorzystując 128 mM NaCl, 4mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, 2 mM KCl, 5mM HEPES oraz 36mM sacharozy. Dostosuj pH roztworu do 7,2 i poddaj sterylizacji przez filtrację.
2. Przygotuj utrwalacz poprzez rozcieńczenie 16% formaldehydu w 1x buforze do sekcji w stosunku 1:1.
3. Przygotuj 1x PBT, używając 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH 7,2 oraz Triton X-100 w stosunku 1:100.
4. Przygotuj 5% albuminę surowiczą bydlęcą (BSA) z 0,01% azotkiem sodu (Na Azide) w 1x PBS.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Do sekcji wykorzystuje się foremki z Sylgardu. Przygotuj foremki, wlewając mieszaninę bazy elastomeru silikonowego Sylgard 184 i czynnika utwardzającego do szalki Petriego. Przed użyciem pozwól mieszaninie całkowicie stwardnieć i wyschnąć.
2. Przed rozpoczęciem sekcji przygotuj czystą pęsetę nr 5, czyste nożyczki Vannasa z prostym ostrzem oraz piny.

3. Disekcja 3^rd Przepoczwyki larwalne

1. Zbierz wędrujące larwy trzeciego (^3.) stadium konkretnego genotypu na szalkę Petriego.
2. Przemyj larwy wodą dejonizowaną, aby usunąć resztki pokarmu.
3. Umieść larwę na podłożu z Sylgardu stroną grzbietową do góry. Przytwierdź larwę szpilkami w części przedniej i tylnej.
4. Nanieś kroplę 1x buforu do sekcji na przytwierdzoną larwę. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietu w pobliżu końca tylnego. Nożyczkami rozetnij kutykulę larwy od końca tylnego aż do końca przedniego.
5. Nanieś kroplę świeżego 1x buforu do sekcji na sekcjonowaną larwę. Za pomocą szpilki chwyć jedną krawędź boczną kutykuli w okolicy środka larwy i przytwierdź ją. Drugą szpilką przytwierdź drugą krawędź boczną kutykuli, zgodnie z rysunkiem. Po każdej stronie bocznej należy użyć dwóch szpilek. Patrz schemat poniżej.
6. Ostrożnie usuń jelita, ciała tłuszczowe i tchawki, pozostawiając jedynie mózg z dwoma płatami optycznymi oraz zwoje brzuszne z przyczepionymi nerwami segmentowymi. Pozostałą część procedury wykonuje się na podłożu z Sylgardu.

4. Fixacja wypreparowanej larwy

1. Inkubować wypreparowaną larwę w utrwalaczu przez 30 minut, wymieniając utrwalacz co 15 minut.
2. Po utrwaleniu płukać larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Należy pamiętać, aby larwa zawsze znajdowała się w buforze.

5. Barwienie przeciwciałami wypreparowanej larwy

1. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT. Optymalne stężenia będą się różnić w zależności od rodzaju przeciwciała.
2. Ostatnie płukanie w 1x PBT zastąpić przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w komorze wilgotnej w temperaturze 4°C przez noc. Komorę wilgotną przygotowuje się, wyścielając plastikowy pojemnik chusteczkami kim-wipes nasączonymi wodą.
3. Następnego dnia preparat z wypreparowaną larwą płukać w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.
4. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT, a następnie inkubować larwę w roztworze przeciwciała drugorzędowego w temperaturze 25°C przez godzinę. Komorę wilgotną owinąć folią aluminiową, aby zapobiec dostępowi światła, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są światłoczułe.
5. Po inkubacji larwę płukać w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.

6. Montowanie i wizualizacja wypreparowanej larwy

1. Przed zamocowaniem larwy na szkiełku, przygotuj szkiełko, nanosząc dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku, pozostawiając wystarczającą przestrzeń na położenie szkiełka nakrywkowego (patrz schemat). Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia.
2. W przestrzeni między pionowymi liniami lakieru na szkiełku umieść kroplę buforu montażowego (patrz schemat). Szkiełko jest teraz gotowe do zamocowania próbki.
   
   
3. Po ostatnim płukaniu w 1x PBT ostrożnie usuń piny boczne. Należy uważać, aby nie przerwać kutykuli.
4. Ostrożnie usuń dwa pozostałe piny, podnieś larwę pęsetą i ułóż ją poziomo na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie jest odwrócona i jest zorientowana stroną brzuszzną do góry.
5. Delikatnie nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci (patrz schemat). Larwa jest teraz gotowa do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   

7. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larwy typu dzikiego z użyciem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych, cysteinowej białku sznurowej (CSP, Zinsmaier et al.1994 ). Zauważmy, że nerwy segmentowe są barwione gładko. Pasek=20μm

Rycina 2: Reprezentacyjny obraz nerwów segmentowych larwy z mutacją białka motorycznego z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych – cysteine string protein (CSP). Należy zauważyć, że w nerwach segmentowych widoczne są masywne akumulacje, które silnie barwią się na CSP (strzałki).

Dyskusja

Nerwy segmentowe larw Drosophila stanowią wydajny system do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Jeśli sekcja larwy w 3^cim stadium rozwojowym zostanie przeprowadzona prawidłowo, wszystkie elementy OUN, ObW oraz powiązanego poziomu tkankowego, takiego jak mięśnie i NMJ, mogą zostać zbadane w obrębie jednej larwy. Niniejszy protokół został zaadaptowany na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996). Protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pinceta Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20
Igły Minutien, stal nierdzewna	Fine Science Tools	26002-10
Nożyczki McPherson-Vannas z prostym ostrzem 8cm	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, medium montażowe	Vector Laboratories	H-1000
Elastomer silikonowy Sylgard 184	Dow Corning	4026148
formaldehyd, 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
dCSP3	Developmental Studies Hybridoma Bank
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004