Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Podsumowanie

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3^{Badania i rozwój} larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Streszczenie

Drosophila melanogaster staje się potężnym systemem modelowym do badania rozwoju i funkcji układu nerwowego, przede wszystkim ze względu na dogodną genetykę i w pełni zsekwencjonowany genom. Ponadto układ nerwowy larw stanowi idealny system modelowy do badania mechanizmów transportu aksonalnego, ponieważ larwalne nerwy segmentalne zawierają pęczki aksonów, których ciała komórkowe znajdują się w mózgu, a zakończenia nerwowe rozciągają się wzdłuż ciała. W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji białek pęcherzyków synaptycznych w larwalnych nerwach segmentalnych. Przy prawidłowym wykonaniu wszystkie elementy układu nerwowego, wraz z powiązanymi tkankami, takimi jak mięśnie i połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ), pozostają nienaruszone, nieuszkodzone i gotowe do wizualizacji. Larwy w 3^rd stadium rozwoju niosące różne mutacje są preparowane, utrwalane, inkubowane z przeciwciałami przeciwko białkom pęcherzyków synaptycznych, wizualizowane i porównywane z larwami typu dzikiego. Procedurę tę można dostosować do kilku różnych przeciwciał synaptycznych lub neuronalnych, a zmiany w rozkładzie wielu różnych białek można łatwo zaobserwować w larwalnych nerwach segmentalnych.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować 1x bufor do sekcji, stosując 128 mM NaCl, 4mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, 2 mM KCl, 5mM HEPES oraz 36mM sacharozy. Dostosować pH roztworu do 7,2 i wysterylizować poprzez filtrację.
2. Przygotować utrwalacz poprzez rozcieńczenie 16% formaldehydu w 1x buforze do sekcji w stosunku 1:1.
3. Przygotować 1x PBT, stosując 1x fosforanowy bufor solny (PBS) o pH 7,2 oraz Triton X-100 w stosunku 1:100.
4. Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) z 0,01% azotkiem sodu w 1x PBS.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Do sekcji wykorzystuje się foremki z Sylgardu. Przygotuj foremki, wlewając mieszaninę bazy elastomeru silikonowego Sylgard 184 i utwardzacza do szalki Petriego. Przed użyciem pozostaw mieszaninę do całkowitego utwardzenia i wyschnięcia.
2. Przed przystąpieniem do sekcji przygotuj czystą pęsetę nr 5, czystą nożyczkę Vannasa z prostym ostrzem oraz szpilki.

3. Disekcja larw w 3^rd stadium rozwojowym

1. Przenieś wędrujące larwy trzeciego stadium (^3. instar) o określonym genotypie na szalkę Petriego.
2. Przemyj larwy wodą dejonizowaną, aby usunąć resztki pożywki.
3. Umieść larwę na podłożu z Sylgardu stroną grzbietową do góry. Przymocuj larwę szpilkami w części przedniej i tylnej.
4. Nanieś kroplę 1x buforu do sekcji na przymocowaną larwę. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj nacięcie na linii środkowej grzbietu w pobliżu końca tylnego. Używając nożyczek, przetnij kutykulę larwy od końca tylnego aż do końca przedniego.
5. Nanieś nową kroplę 1x buforu do sekcji na rozcieętą larwę. Za pomocą szpilki chwyć jedną krawędź boczną kutykuli w okolicach środka ciała larwy i przymocuj ją. Używając kolejnej szpilki, przymocuj drugą boczną krawędź kutykuli, zgodnie z rysunkiem. Po każdej stronie bocznej należy użyć dwóch szpilek. Patrz schemat poniżej.
6. Ostrożnie usuń jelita, ciała tłuszczowe i tchawki, pozostawiając jedynie mózg z dwoma płatami optycznymi oraz zwoje brzuszne z przytwierdzonymi nerwami segmentowymi. Pozostałą część procedury przeprowadza się na podłożu z Sylgardu.

4. Fixacja wypreparowanej larwy

1. Inkubuj wypreparowaną larwę w utrwalaczu przez 30 minut, wymieniając utrwalacz co 15 minut.
2. Po utrwaleniu płucz larwę w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut. Należy pamiętać, że larwa powinna być stale zanurzona w buforze.

5. Barwienie przeciwciałami wypreparowanej larwy

1. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT. Optymalne stężenia będą się różnić w zależności od użytego przeciwciała.
2. Ostatnie płukanie w 1x PBT zastąpić przygotowanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w komorze wilgotnej w temperaturze 4°C przez noc. Komorę wilgotną przygotowuje się, wyściełając plastikową tackę nasączonymi wodą chusteczkami Kim-Wipes.
3. Następnego dnia poddać zdyssekowaną larwę płukaniu w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.
4. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z azotkiem sodu w 1x PBT, a następnie inkubować larwę w roztworze przeciwciała drugorzędowego w temperaturze 25°C przez godzinę. Komorę wilgotną należy owinąć folią, aby zapobiec dostępowi światła, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są światłoczułe.
5. Po inkubacji poddać larwę płukaniu w 1x PBT przez 30 minut, wymieniając bufor co 10 minut.

6. Montowanie i wizualizacja zdyssekowanej larwy

1. Przed zamocowaniem larwy na szkiełku, przygotuj je, nakładając dwie pionowe linie lakieru do paznokci na środku, pozostawiając przestrzeń wystarczającą na położenie szkiełka nakrywki (patrz schemat). Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia.
2. W miejscu między pionowymi liniami lakieru na szkiełku umieść kroplę buforu montażowego (patrz schemat). Szkiełko jest teraz gotowe do zamocowania próbki.
   
   
3. Po ostatnim płukaniu w 1x PBT ostrożnie usuń piny boczne. Należy uważać, aby nie przerwać kutykuli.
4. Ostrożnie usuń dwa pozostałe piny, podnieś larwę pęsetą i umieść ją poziomo na przygotowanym szkiełku. Upewnij się, że larwa nie jest odwrócona i jest zorientowana stroną brzuszna do góry.
5. Delikatnie połóż na górze szkiełko nakrywką i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci (patrz schemat). Larwa jest teraz gotowa do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larwy typu dzikiego z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych – cysteinowej białkowej strategii (cysteine string protein) (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Należy zauważyć, że nerwy segmentowe są barwione jednolicie. Pasek = 20μm

Rysunek 2: Reprezentatywny obraz nerwów segmentowych larwy z mutacją białka motorowego z zastosowaniem przeciwciał przeciwko białku pęcherzyków synaptycznych – cysteinowej białku sznurowemu (CSP). Zauważalna jest obecność masywnych akumulacji w nerwach segmentowych, które wykazują silne barwienie na CSP (strzałki).

Dyskusja

Nerwy segmentowe larw Drosophila stanowią wydajny system do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Jeśli sekcja larwy w 3^cim stadium rozwojowym zostanie przeprowadzona prawidłowo, wszystkie elementy OUN, ObW oraz powiązanego poziomu tkankowego, takiego jak mięśnie i NMJ, mogą zostać zbadane w obrębie jednej larwy. Niniejszy protokół został zaadaptowany na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996). Protokół ten można również dostosować do testowania innych przeciwciał neuronalnyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pinceta Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20
Igły Minutien, stal nierdzewna	Fine Science Tools	26002-10
Nożyczki McPherson-Vannas z prostym ostrzem 8cm	Fisher Scientific	50822236
Vectashield, medium montażowe	Vector Laboratories	H-1000
Elastomer silikonowy Sylgard 184	Dow Corning	4026148
formaldehyd, 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
dCSP3	Developmental Studies Hybridoma Bank
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004