Bioanalizy w monitorowaniu oporności na insektycydy

Podsumowanie

Niniejszy artykuł demonstruje i omawia techniki stosowane do badania wrażliwości na pestycydy oraz wykrywania oporności na pestycydy kontaktowe i systemiczne u szkodników z grupy stawonogów.

Streszczenie

Odporność szkodników na pestycydy jest narastającym problemem, ponieważ środki te stanowią integralną część wysokowydajnego rolnictwa produkcyjnego. W sytuacjach, gdy dla konkretnego szkodnika w danym systemie uprawy zarejestrowano niewielką liczbę produktów, możliwości chemicznej kontroli są ograniczone. W konsekwencji te same produkty są stosowane wielokrotnie, co wywiera ciągłą presję selekcyjną na docelowego szkodnika. Rozwój populacji odpornych wiąże się z kosztami zarówno finansowymi, jak i środowiskowymi. Koszt odporności na pestycydy w Stanach Zjednoczonych szacuje się na około 1,5 miliarda dolarów rocznie. W niniejszej pracy opisano protokoły obecnie stosowane do monitorowania populacji stawonogów (w szczególności owadów) pod kątem rozwoju odporności. Test w fiolkach dla osobników dorosłych służy do pomiaru toksyczności insektycydów kontaktowych, a modyfikacja tego testu jest stosowana w przypadku insektycydów systemicznych dla roślin. W tych bioassay owady są wystawione na działanie insektycydu stopnia technicznego, a odpowiedzi (śmiertelność) rejestrowane są w określonym odstępie czasu po ekspozycji. Dane o śmiertelności poddawane są analizie probit log-dozy w celu wyznaczenia szacunkowej stężenia letalnego powodującego śmierć 50% (LC₅₀) populacji docelowych oraz serii granic ufności (CL), służących jako oszacowania zmienności danych. Gdy dane te zostaną zebrane dla szeregu populacji wrażliwych na dany insektycyd, wartość LC₅₀ może służyć jako dane bazowe do przyszłego monitorowania. Po wystawieniu populacji na działanie produktów, wyniki można porównać z wcześniej wyznaczoną wartością LC₅₀ przy użyciu tej samej metodologii.

Protokół

1. Wstęp

Produkcja żywności stała się kwestią najwyższej wagi w obliczu przewidywań, że do 2025 roku populacja świata osiągnie 8,04 miliarda ludzi¹. Pojawi się potrzeba dostarczenia większej ilości roślin uprawnych niż obecnie produkowane. Odpowiednia dostępność żywności nie będzie możliwa bez zastosowania środków ochrony roślin, takich jak pestycydy, w celu zwiększenia ilości plonów i utrzymania ich jakości. Ze względu na historyczne i obecne uzależnienie od pestycydów, przypadki odporności na pestycydy będą nadal występować i być zgłaszane w literaturze naukowej.

Odporność szkodników na pestycydy jest problematyczna, ponieważ produkty te stanowią integralny element wysokowydajnego i wysokojakościowego rolnictwa produkcyjnego. Jednakże nadmierne stosowanie i/lub niewłaściwe użytkowanie pestycydów może prowadzić do wykształcenia odporności, co może być szkodliwe dla produkcji roślin uprawnych. Szkodniki (np. owady, chwasty, patogeny itp.) rozwijają odporność poprzez różnorodne mechanizmy, ale głównym czynnikiem napędzającym rozwój odporności jest brak zarejestrowanych pestycydów¹ o niezależnych mechanizmach działania dostępnych do użytku. Gdy w obrębie konkretnego systemu upraw dla danego szkodnika zarejestrowano niewiele produktów, możliwości kontroli chemicznej są ograniczone. W związku z tym ten sam środek lub środki chemiczne są stosowane wielokrotnie, co wywiera ciągłą presję selekcyjną na szkodnika. Problem ten pogłębia się, gdy szkodnik ma wiele generacji w ciągu jednego roku i każda z nich jest narażona na działanie pestycydów.

Z opornością wiążą się zarówno koszty finansowe, jak i środowiskowe². Oporność szkodników prowadzi do konieczności stosowania wyższych dawek i częstszych aplikacji pestycydów w celu osiągnięcia zadowalającego poziomu kontroli. Straty w plonach mogą wystąpić nawet po zwiększeniu zużycia pestycydów z powodu braku skutecznej kontroli nad docelowym szkodnikiem. Pimentel² szacuje koszty oporności na pestycydy w Stanach Zjednoczonych na około 1,5 miliarda dolarów rocznie.

Badania podatności populacji szkodników na pestycydy stanowią proaktywne podejście do wykrywania wszelkich zmian w skuteczności insektycydów i zapewniają wczesne ostrzeżenie w celu modyfikacji strategii zwalczania chemicznego. Poprzez modyfikację ogólnych strategii IPM można przedłużyć użyteczność danego pestycydy, co z kolei jest istotne dla zapewnienia przez rolnictwo wystarczającej ilości żywności i włókien dla świata. Niniejsza publikacja opisuje protokół, który może być wykorzystany do monitorowania podatności na insektycydy i wykrywania rozwoju populacji odpornych na insektycydy przy użyciu testu w fiolkach dla osobników dorosłych³ w przypadku insektycydów kontaktowych oraz modyfikacji tego testu dla systemicznych insektycydów roślinnych ⁴.

2. Metody

2.1 Oświadczenie dotyczące bezpieczeństwa

Podczas pracy z insektycydami ważne jest stosowanie odpowiednich środków ostrożności. Przed kontaktem z pestycydami należy zapoznać się z Kartą Charakterystyki Substancji (MSDS) w celu dobrania odpowiedniego Środka Ochrony Indywidualnej (PPE). Przed przystąpieniem do jakichkolwiek biotestów personel powinien przejść specjalistyczne szkolenie laboratoryjne z zakresu obchodzenia się z pestycydami w warunkach laboratoryjnych.

2.2 Przygotowanie roztworu zapasowego

Przygotuj roztwór zapasowy o znanym stężeniu z substancji czynnej (AI) insektycydu. Wszystkie wymagane stężenia wykorzystane jako warianty w bioanalizie zostaną przygotowane z tego pierwotnego roztworu zapasowego. Na potrzeby niniejszej publikacji jako roztwór zapasowy zostanie przygotowane 100ml roztworu o stężeniu 100 μg/ml; można jednak rozcieńczyć ten początkowy roztwór do dowolnego innego stężenia. Dostosuj ilość odważonej substancji czynnej stopnia technicznego w zależności od procentowej czystości produktu.

Ilość do odważenia = (objętość do przygotowania) X ([# μg / ml roztworu] / [% czystości/100])

Na przykład, aby przygotować 100 ml roztworu insektycydu klasy technicznej o stężeniu 100 μg/ml i czystości 98,5%, należałoby użyć 10152,284 μg technicznego AI:

(100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10152,284 μg

2.2.1 Test w fiolkach dla osobników dorosłych w celu oceny insektycydów kontaktowych

Napełnij częściowo kolbę miarową acetonem i odważ odpowiednią ilość substancji czynnej (AI) insektycydu. Przepłucz łódkę wagową acetonem do kolby, aby usunąć z niej cały insektycyd. Dopełnij kolbę miarową acetonem do kreski pomiarowej. Większość roztworów przechowywanych w warunkach chłodniczych zachowa aktywność bez zauważalnej utraty skuteczności przez około miesiąc.

2.2.2 Modyfikacja testu w fiolce dla osobników dorosłych dla insektycydów systemicznych

Intoksykacja owadów za pomocą systemicznych insektycydów różni się znacząco od tej wywoływanej przez preparaty kontaktowe. Produkty systemiczne zazwyczaj muszą zostać spożyte przez owada, aby stały się aktywne, w przeciwieństwie do insektycydów kontaktowych, gdzie występuje bezpośrednia ekspozycja na produkt. W związku z tym test w fiolce z osobnikami dorosłymi został zmodyfikowany w celu umożliwienia testowania insektycydów systemicznych. Masę substancji czynnej (AI) niezbędną do przygotowania roztworu zapasowego oblicza się w sposób analogiczny do opisanego w sekcji 2.2. Metodyka jest podobna, z wyjątkiem tego, że AI rozpuszcza się w 10% wagowym roztworze miodu i wody. Roztwór ten należy przygotować w ciągu 24 godzin przed rozpoczęciem bioanalizy. Jeśli materiał o stopniu technicznym nie jest rozpuszczalny w wodzie, można przygotować roztwór insektycydu o wysokim stężeniu w acetonie, tak aby do roztworu miodu i wody dodać jedynie niewielką objętość mieszaniny insektycydu z acetonem⁴.

2.3 Wyznaczenie zakresu stężeń i przygotowanie roztworów o określonych stężeniach

Wyznaczenie odpowiednich stężeń niezbędnych do ustalenia zakresu odpowiedzi w bioanalizie może być trudne. Aby zdefiniować zakres stężeń, może być konieczne przeprowadzenie kilku powtórzeń, co odbywa się metodą prób i błędów. Ponadto zakres ten może ulec zmianie w czasie, jeśli zmieni się poziom podatności populacji. Przy ustalaniu ostatecznych stężeń należy wziąć pod uwagę liczne inne czynniki, w tym: rodzinę owada, klasę insektycydu, wielkość owada itp. W początkowym wyborze stężeń insektycydu mogą pomóc wcześniej opublikowane wyniki testów w fiolkach z osobnikami dorosłymi. Bioanalizy zostały opublikowane dla: Hemiptera: Aleyrodiidae^5-6, Aphididae⁷, Pentatomidae^8-10 i Miridae^11-14; Thysanaptera: Thripidae¹⁵; Coleoptera: Brentidae¹⁶, Curculionidae¹⁷, Coccinellidae^18-19 i Cybocephalidae¹⁹; Diptera: Culicidae²⁰; Lepidoptera: Tortricidae²¹ i Noctuidae³, ^22-26; Hymenoptera: Braconidae^7,18, Ichneumonidae^26-27, Aphidiidae¹⁸, Encyrtidae⁷ oraz Aphelinidae¹⁸.

Stężenia są przygotowywane na podstawie roztworu „X” μg/ml. Jednak podczas przygotowywania fiolek do testu dla osobników dorosłych, do każdej fiolki zostanie dodane tylko 0,5 ml; w związku z tym stężenie w fiolce będzie stanowiło połowę stężenia przygotowanego roztworu. Po wybraniu stężeń poniższe równanie może pomóc w określeniu ilości roztworu niezbędnej do uzyskania pożądanego stężenia.

(C1)(V1) = (C2)(V2)
Gdzie C1 to stężenie roztworu zapasu; V1 to objętość roztworu zapasu potrzebna do uzyskania nowego stężenia; C2 to przygotowywane stężenie; a V2 to objętość nowego stężenia. Na przykład, aby przygotować 100 mls roztworu o stężeniu 5μg/ml, potrzebne jest 5 mls roztworu zapasu o stężeniu 100μg/ml. Ten roztwór 5μg/ml doprowadzi do pokrycia fiolek stężeniem 2,5μg/vial.

5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml)

2.3.1 Test w fiolkach dla osobników dorosłych w przypadku insektycydów kontaktowych

Napełnić kolby miarowe częściowo, a następnie odmierzyć i przelać obliczoną ilość roztworu zapasu niezbędną do uzyskania pożądanego stężenia. Dopełnić kolbę miarową acetonem do kreski i przejść do sekcji 2.4 lub zabezpieczyć Parafilmem M (Alcan Inc, Neenah, WI) w celu przechowywania w lodówce do późniejszego użycia. Większość roztworów zachowuje stabilność przez 1 miesiąc.

2.3.2 Modyfikacja testu w fiolce dla osobników dorosłych dla insektycydów systemicznych

Proces ten jest taki sam, jak wspomniano wcześniej w punkcie 2.3.1, z wyjątkiem zastąpienia acetonu 10% wagowo roztworem miodu w wodzie. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu miodu i wody, aby uzyskać wszystkie pożądane stężenia. Roztwory te należy wykorzystać w ciągu 24 godzin od przygotowania.

2.4 Przygotowanie fiolek

2.4.1 Test w fiolce dla osobników dorosłych dla insektycydów kontaktowych

Jeśli roztwory były przechowywane w lodówce, należy doprowadzić je do temperatury otoczenia. Objętość acetonu zmienia się w zależności od temperatury, co może wpłynąć na stężenie insektycydu. Szklane fiolki o pojemności 20 ml (przystosowane do nakrętek) należy oznaczyć kolorami dla poszczególnych stężeń, używając farby lub markerów.

Ustaw pipetę wielokrotnego dozowania na objętość 0,5ml/stężenie. Rozpocznij pracę od kontroli z acetonem, następnie przejdź do najniższego stężenia i kontynuuj z coraz wyższymi stężeniami, aż do wykorzystania wszystkich przygotowanych roztworów. Odlej do małego zlewki objętość roztworu stanowiącą w przybliżeniu połowę całkowitej liczby fiolek do opracowania (np. 20ml dla 40 fiolek). Gdy roztwór nie jest używany, należy go przykryć, aby zminimalizować parowanie, które może spowodować zmiany w stężeniu. Pobierz roztwór insektycydu do pipety wielokrotnego dozowania i odmień 0,5ml roztworu do poszczególnych szklanych fiolek.

Bezpośrednio po zastosowaniu preparatu fiolki szklane umieszcza się na komercyjnym urządzeniu do obracania parówek. Wraz z obrotem wałków fiolki szklane rotują, a aceton odparowuje, pozostawiając wnętrze fiolki pokryte insektycydem klasy technicznej. Ciepło może doprowadzić do degradacji insektycydu, dlatego istotne jest, aby grzanie było wyłączone. Można to osiągnąć poprzez odłączenie elementu grzejnego w modelu, który grzeje i obraca jednocześnie i jest sterowany tym samym przełącznikiem, lub poprzez zastosowanie modelu urządzenia do obracania parówek, który posiada niezależne przełączniki dla elementu grzejnego i wałków. Należy unikać przygotowywania większej liczby fiolek, niż pomieści urządzenie; aceton może odparować przed obrotem fiolek szklanych, co może uniemożliwić uzyskanie równomiernej powłoki na ściankach fiolek.

Należy obracać fiolki do momentu odparowania całego acetonu. Na ściankach fiolek może pojawić się cienka warstwa kondensatu acetonu, dlatego każdą fiolkę należy sprawdzić indywidualnie. Czas wymagany do obtoczenia fiolek zależy od warunków laboratoryjnych. Po wyschnięciu fiolek należy je zakręcić i przechowywać w warunkach chłodnych lub ciemnych. Zaobserwowano, że owady spoczywają na nakrętkach z wkładkami stożkowymi lub rozdartymi wkładkami z folii, które zwisają poniżej krawędzi fiolki (unikając w ten sposób powierzchni poddanych działaniu preparatu); dlatego ważne jest stosowanie nakrętek bez wkładki.

Wszelkie pozostałe roztwory, które nie zostały wykorzystane do przygotowania fiolek, należy zutylizować w odpowiedni sposób. Roztwór pozostały w kolbie miarowej można zabezpieczyć Parafilmem i przechowywać w lodówce. Należy datować fiolki w momencie ich przygotowania, ponieważ różne insektycydy mają różny czas przydatności do użycia. Na przykład fiolki powlekane pyretroidami są przydatne przez około miesiąc, natomiast fiolki powlekane bardziej niestabilnymi insektycydami, takimi jak związki fosforoorganiczne, mają czas przydatności wynoszący dwa tygodnie lub mniej.

2.4.2 Zmodyfikowany test w fiolce dla osobników dorosłych dla insektycydów systemicznych

Gąbka florystyczna jest niezbędna jako podłoże do dostarczania roztworu insektycydu owadom ⁴. Za pomocą wycinaka do korków należy wyciąć kawałki gąbki florystycznej (12mm X 12mm). Umieść jeden kawałek gąbki florystycznej w opisanych wcześniej szklanych fiolkach. Napełnij pipetę wielokrotnego napełniania ustawioną na dawkę 0,5ml roztworu i nanieś go na gąbkę florystyczną. Ta objętość cieczy powinna nasycić kawałek gąbki florystycznej, ale nie może przekraczać poziomu gąbki w fiolce. Ponownie postępuj sekwencyjnie, zaczynając od grupy kontrolnej (wyłącznie 10% wagowo roztwór miodu w wodzie), a następnie od najniższych do najwyższych stężeń.

2.5. Przechowywanie fiolek

2.5.1 Test fioalkowy dla osobników dorosłych w przypadku insektycydów kontaktowych

Przechowując fiolki powlekone insektycydem, należy znać właściwości stosowanego środka. Różne insektycydy mają odmienne wymagania dotyczące przechowywania; na przykład pyretroidy są światłoczułe i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej, lecz w ciemności, natomiast insektycydy fosforganiczne są wrażliwe na temperaturę i muszą być przechowywane w zamrażarce. Jeśli insektycydy wymagają przechowywania w zamrażarce, należy je ogrzać do temperatury pokojowej przed wystawieniem na ich działanie owadów.

2.6 Bioanaliza

Zebrać owady do badania. Proces ten można przeprowadzić przy użyciu pułapek z przynętą feromonową, siatek entomologicznych lub wszelkich innych metod masowego odłowu. Owady należy przetrzymać przez 8-24h, aby umożliwić naturalną śmiertelność osobników rannych podczas procesu zbioru; w tym czasie należy zapewnić im pożywienie i źródło wilgoci. Przebadać 10-25 owadów na jedną koncentrację (minimum 10); im większa liczba badanych owadów, tym bardziej wiarygodny będzie zestaw danych. Podczas wyboru owadów do bioassay należy wybierać osobniki zdrowe i aktywne, a odrzucić osobniki letargiczne lub anormalne. Umieścić owady w fiolkach w taki sposób, aby były one narażone na pełen zakres stężeń, a nie tylko na jedno stężenie w danym czasie. Procedura ta zapobiegnie umieszczeniu najzdrowszych i najaktywniejszych osobników w jednej lub kilku koncentracjach. Dodatkowo, jeśli nie jest możliwe przeprowadzenie eksperymentu z minimum 10 owadami na koncentrację, należy poddać działaniu każdego stężenia tak dużą liczbę osobników, jak to możliwe. Następnie należy zebrać więcej owadów z tego samego obszaru próbkowania w krótkim czasie (dwie-trzy tygodnie) i powtórzyć eksperyment. Niektóre owady mogą tracić wrażliwość (nabierać odporności) w miarę postępu sezonu wegetacyjnego; dlatego reakcja osobników zebranych wczesną wiosną może różnić się od reakcji osobników zebranych jesienią²⁸.

Opracuj kryteria oceny śmiertelności. Najczęściej stosowanym kryterium klasyfikacji owadów jako konających lub martwych jest brak skoordynowanych ruchów. Obserwacje te mogą obejmować niezdolność do wyprostowania się po położeniu na grzbiecie, niezdolność do utrzymania skoordynowanego lotu na dystansie 1m lub brak skoordynowanych ruchów po delikatnym dotknięciu tępym narzędziem. Jeśli osobnik potrafi się wyprostować, ale następnie przewraca się, oznacza to brak skoordynowanych ruchów; taki owad powinien zostać uznany za martwego. Owad może mieć trudności z wyprostowaniem się na śliskiej powierzchni, dlatego może być konieczne zapewnienie mu podłoża, które umożliwi uzyskanie przyczepności niezbędnej do wyprostowania się. Zapisz liczbę osobników przeżyjących i martwych, aby obliczyć przeżywalność dla każdego stężenia.

2.6.1 Test w fiolkach dla osobników dorosłych w przypadku insektycydów kontaktowych

Umieść owada (lub owady) w fiolce i lekko zakręć nakrętką. Pokrywka musi zapobiegać ucieczce owada, ale jednocześnie być na tyle luźna, aby umożliwić przepływ powietrza. W większości bioassayów entomologicznych w każdej fiolce umieszcza się tylko jednego owada; jednak małe owady, np. mączniki lub tripsy, mogą być eksponowane w liczbie nawet do 30 osobników na fiolkę^{6, 15}. Fiolki należy ustawić pionowo w temperaturze pokojowej do momentu oceny śmiertelności owadów w punkcie końcowym bioassayu. Czas ekspozycji może różnić się w zależności od gatunku i prawdopodobnie od zastosowanego insektycydu^3,5-27. Podczas ustalania początkowych poziomów toksyczności dla nowego owada lub substancji chemicznej należy monitorować osobniki w wielu zaplanowanych punktach czasowych po ekspozycji. Badania można zakończyć, gdy śmiertelność przy najwyższym stężeniu wyniesie 100%, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej przeżywalności (<10% śmiertelności) w kontroli nie traktowanej insektycydem. Jeśli przy najwyższym stężeniu nie osiągnięto 100% śmiertelności przy wysokiej przeżywalności w grupie kontrolnej, bioassay należy powtórzyć, stosując zakres wyższych stężeń. Idealnie poziomy śmiertelności powinny wzrastać wraz ze wzrostem stężenia insektycydu.

Niektóre owady, w przypadku ekspozycji przez 24 godziny, wymagają źródła wilgoci (np. małego fragmentu materiału roślinnego) ¹². Podczas pracy z delikatnymi owadami korzystne jest ustalenie, jak długo owad może przeżyć w fiolce bez źródła wilgoci przed wystawieniem go na działanie insektycydu w teście dla osobników dorosłych w fiolce. Informację tę można uzyskać, umieszczając owady w fiolkach z dostępem do źródła wilgoci oraz bez niego i monitorując ich przeżywalność w czasie przed przeprowadzeniem właściwych badań nad insektycydami.

2.6.2 Zmodyfikowany test w fiolce dla osobników dorosłych w przypadku insektycydów systemicznych

Przed rozpoczęciem bioanalizy należy ustalić, czy owad może żywić się i przeżyć na gąbce florystycznej nasyconej roztworem miodu i wody w nieobecności insektycydu. Umieść owady w fiolkach z gąbką florystyczną nasyconą wyłącznie miodem i wodą (lub miodem i wodą z największą objętością acetonu użytego do przygotowania stężeń z niezespółczalnym w wodzie insektycydem technicznym) i monitoruj przeżywalność przez kilka dni. Ta modyfikacja testu w fiolkach dla osobników dorosłych została zbadana jedynie w przypadku Miridae ⁴ oraz Pentatomidae ²⁹; w związku z tym określenie czasu trwania testu wymaga więcej eksperymentów niż w przypadku bioanalizy insektycydów kontaktowych. Na przykład w przypadku Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) śmiertelność oceniano 24 godziny po ekspozycji na tiametoksam, ale 72 godziny dla imidakloprydu⁴. Śmiertelność Oebalus pugax F. oceniano po 96 godzinach ekspozycji na dinotefuran²⁹. Zatem przeżywalność owadów w fiolkach kontrolnych musi być konsekwentnie wysoka przez kilka dni, zanim będzie można dokonać dokładnej oceny śmiertelności wynikającej z intoksykacji insektycydem.

Umieść owada/owady w fiolce scyntylacyjnej z nasyconą gąbką florystyczną. Zamiast zakręcać fiolki pokrywkami, zapieczętuj je za pomocą kuli z waty. Postaw fiolki pionowo w temperaturze pokojowej do momentu oceny śmiertelności owadów. Jak wspomniano wcześniej, oceniaj śmiertelność w regularnych odstępach czasu. Badanie można zakończyć, gdy osiągnięta zostanie 100% śmiertelność przy najwyższym stężeniu oraz wysoka przeżywalność (<10% śmiertelności) w grupie kontrolnej. Może być konieczne przetestowanie dodatkowych stężeń.

2.6.3 Analiza danych

Skoryguj śmiertelność w grupie kontrolnej, stosując wzór według Abbotta³⁰.

Skorygowana śmiertelność (%) = ((% przeżywalność kontrola - % przeżywalność badana)/% przeżywalność kontrola) x 100

Przeanalizuj dane za pomocą analizy probit logarytmu dawki, aby wyznaczyć stężenie letalne wymagane do zabicia 50% populacji (LC₅₀) oraz ustalić 95% przedziały ufności (CL). Do wyznaczania LC₅₀ dostępnych jest wiele programów komputerowych (SAS: PROC PROBIT ³¹, Polo-Plus ³²).

3. Uwagi

1. Pracę z acetonem i insektycydami należy prowadzić pod dygestorium z ujemnym przepływem powietrza.
2. Podczas napełniania kolb miarowych najlepiej przygotować dwie butelki myjące z acetonem: jedną przystosowaną do szybkiego dozowania cieczy oraz drugą do dozowania powolnego. W celu stworzenia większego otworu można usunąć część rurki wylotowej, co pozwoli na szybkie podawanie dużych objętości. Gdy poziom acetonu zbliży się do kreski pomiarowej, należy zmienić butelkę na tę o wolniejszym przepływie, aby uzyskać większą kontrolę nad ilością dozowanej cieczy. Jeśli kolba zostanie napełniona powyżej kreski pomiarowej, należy pozostawić ją bez korka i pozwolić acetonowi odparować do poziomu kreski.
3. Należy uwzględnić ilość roztworu treściwego niezbędną do przygotowania danej koncentracji; na przykład, jeśli kolba jest wypełniona w ¾ objętości, a konieczne jest dodanie 30 ml, poziom cieczy może przekroczyć kreskę pomiarową.

Dyskusja

Wartość LC₅₀ może służyć do ustalenia bazowej podatności populacji docelowej lub populacji docelowych. Dane te mogą być wykorzystane w przyszłych badaniach monitorujących lub w celu bezpośredniego porównania bieżących wyników z wcześniej wyznaczoną wartością LC₅₀, aby stwierdzić, czy podatność populacji docelowej uległa zmianie. Rzeczywiste wartości LC₅₀ można porównywać pomiędzy populacjami, analizując 95% przedziały ufności; jeśli górne i dolne granice tych przedziałów na siebie nie nachodzą, prawdopodobnie populacja przeszła istotną zmianę podatności, co w niektórych sytuacjach jest oznaką oporności³³. Wartości LC₅₀ mogą być również wykorzystywane do badania sezonowych zmian podatności na insektycydy²⁸ lub do porównywania reakcji między gatunkami bądź różnymi substancjami aktywnymi (AI) insektycydów. W wielu pracach dane te wykorzystano także do porównania reakcji między samcami a samicami¹⁰ lub między osobnikami dorosłymi a stadiami młodocianymi^10,34. Czasami przedziały ufności są szerokie lub niemożliwe do obliczenia. Aby uzyskać węższe przedziały ufności, należy przeprowadzić bioassay z większą liczbą owadów i/lub większą liczbą stężeń.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zlewka szklana 50-100 ml
Kolba miarowa z korkami (można używać kolb bursztynowych dla pestycydów wrażliwych na światło, takich jak pyretroidy)
Szklane fiolki scyntylacyjne 20 ml z niepowlekanymi zakrętkami
Metoda kolorowania fiolek (farba lub markery)
Aceton
Komercyjny roller do hot-dogów (element grzewczy odłączony)
2 butelki myjące (jedna zmodyfikowana tak, aby otwór był duży dla szybkiego dozowania cieczy, a druga z małym otworem wylewki dla powolnego dozowania cieczy)
Mała łódka ważka (należy upewnić się, że wszystkie materiały plastikowe są odporne na aceton)
Dostęp do wagi o dokładności 0,001 g lub wyższej
Parafilm M
Pipeta repetoryczna
Odpowiednie końcówki
Pipety szklane pasujące do kolby miarowej
Dygestorium (używane do usunięcia zapachu acetonu)
Miejsce do przechowywania roztworów insektycydów i fiolek [lodówka (roztwory), ciemne pomieszczenie lub zamrażarka, w zależności od substancji chemicznej (fiolki)]