Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Podsumowanie

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Streszczenie

Wiele leków i innych małych cząsteczek stosowanych do modulowania funkcji biologicznych to amfifile, które adsorbują się na granicy fazy dwuwarstwy/roztwór i w ten sposób zmieniają właściwości lipidowej dwuwarstwy. Jest to istotne, ponieważ białka błonowe są sprzężone energetycznie z ich macierzystą dwuwarstwą poprzez oddziaływania hydrofobowe. Zmiany we właściwościach dwuwarstwy zmieniają zatem funkcję białek błonowych, co stanowi pośredni sposób modulowania funkcji białek przez amfifile i możliwy mechanizm działania leków typu „off-target”. Opracowaliśmy wcześniej test elektrofizjologiczny do wykrywania zmian we właściwościach lipidowej dwuwarstwy, wykorzystujący liniowe kanały gramicydyny jako sondy ^3,12. Kanały gramicydyny to minibiałka tworzone przez dimeryzację dwóch nieprzewodzących podjednostek w poprzek dwuwarstwy. Są one wrażliwe na zmiany w otoczeniu błonowym, co czyni je potężnymi sondami do monitorowania zmian we właściwościach lipidowej dwuwarstwy odczuwanych przez białka przebłonowe. Prezentujemy obecnie test fluorescencyjny do wykrywania zmian we właściwościach dwuwarstwy z wykorzystaniem tych samych kanałów jako sond. Test opiera się na pomiarze przebiegu czasowego wygaszania fluorescencji z dużych pęcherzyków jednowarstwowych załadowanych fluoroforem, spowodowanego przenikaniem wygaszacza przez kanały gramicydyny. Stosujemy parę wskaźnik fluorescencji/wygaszacz 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonian (ANTS)/Tl⁺, która była z powodzeniem wykorzystywana w innych testach wygaszania fluorescencji ^5,13. Tl⁺ powoli przenika przez lipidową dwuwarstwę ⁸, ale łatwo przechodzi przez przewodzące kanały gramicydyny ^1,14. Metoda ta jest skalowalna i odpowiednia zarówno do badań mechanistycznych, jak i do wysokoprzepustowego przesiewania małych cząsteczek pod kątem efektów zaburzających dwuwarstwę oraz potencjalnych efektów „off-target”. Stwierdzamy, że wyniki uzyskane za pomocą tej metody są w dobrej zgodności z wcześniejszymi wynikami elektrofizjologicznymi ¹².

Protokół

1. Generowanie liposomów wypełnionych ANTS

1. W dniu 1. usuń rozpuszczalnik organiczny z lipidów.
2. Wyjmij lipidy z zamrażarki i pozostaw je do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
3. Do kolby okrągłodennej o pojemności 25 mL dodaj 0,6 mL roztworu lipidów (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) o stężeniu 25 mg/mL w chloroformie.
4. Ciągle obracaj kolbą podczas suszenia pod strumieniem azotu, aż cały chloroform odparuje, a całą dolną połowę kolby pokryje cienka biała warstwa lipidów.
5. Susz w deskryka-torze pod próżnią przez noc.

1. W drugim dniu należy przygotować próbkę z fluoroforem, który zostanie wbudowany w pęcherzyki.
2. Rehydratować w 10 mM NaNO3₃, 25 mM ANTS (sól sodowa), 10 mM HEPES. Użyć HNO₃ lub NaOH w celu dostosowania pH do 7,0. Każda cząsteczka ANTS posiada 2 Na⁺, dla całkowitego stężenia 150 mM [Na+ ]⁺]. Dodać 1,671 ml elektrolitu, aby otrzymać zawiesinę lipidową o stężeniu 10 mM.
3. Szczelnie zamknąć Parafilmem i dokładnie wymieszać wstrząsarce typu vortex.
4. Osłoń próbkę od światła za pomocą folii i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez noc.

1. W dniu 3. przygotuj duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV) i usuń cały fluorofor zewnątrz pęcherzyków.
2. Poddaj próbkę sonikacji przez 1 min w sonikatorze o niskiej mocy.
3. Próbkę zamrażaj i rozmrażaj 5-6 razy, za każdym razem pozostawiając ją na 5 minut na suchym lodzie i na 5 minut w ciepłej (~50 °C) wodzie.
4. Przepuść zawiesinę lipidową przez mini-ekstruder Avanti. Skonfiguruj mini-ekstruder, stosując filtr poliwęglanowy 0,1 μm oraz podpory filtra (szczegóły znajdują się w instrukcji ekstrudera). Przepuszczaj zawiesinę w przód i w tył 21 razy, tak aby zawiesina ostatecznie znalazła się w przeciwległej strzykawce. Przy ekstrudowaniu wielu partii pamiętaj, aby zawsze ładować próbki tą samą strzykawką. Podczas ekstrudowania mętna początkowa zawiesina lipidowa powinna stać się prawie przezroczysta (nadal będzie żółta ze względu na fluorofor ANTS). Jeśli ekstrudowanie nagle stanie się łatwiejsze i przesunięcie zawiesiny przez filtr będzie wymagało mniejszego nacisku, filtr mógł pęknąć i będzie wymagał wymiany.
5. Usuń zewnętrzny ANTS, przepuszczając wyekstrudowaną zawiesinę przez kolumnę odsalania PD-10 zgodnie z protokołem grawitacyjnym. Równoważ kolumnę za pomocą 20-30 mL buforu sodowego (140 mM NaNO₃, 10 mM HEPES, pH 7,0; pamiętaj o użyciu HNO₃ lub NaOH do regulacji pH). Dodaj 1,5 mL wyekstrudowanej zawiesiny lipidowej do kolumny i poczekaj, aż wsiąknie. Doprowadź całkowitą objętość próbki do 2,5 mL, dodając 1 mL buforu sodowego. Po całkowitym wchłonięciu buforu przez kolumnę i ustaniu wycieków, eluj liposomy za pomocą 3 mL buforu sodowego i zbierz otrzymaną próbkę. Otrzymany roztwór zapasowy LUV wypełnionych ANTS powinien zawierać około 4-5 mM lipidów i mieć przeźroczysty, mleczno-biały wygląd. Chroniąc próbkę przed światłem, owiń ją folią.
6. Jeśli roztwór zapasowy nie zostanie użyty natychmiast, przechowuj go w temperaturze 13 °C przez maksymalnie 7 dni. Ostrzeżenie: nie zamrażaj ani nie schładzaj roztworu lipidowego poniżej temperatury przejścia z fazy ciekłej w krystaliczną (~12 °C), ponieważ zniszczy to integralność pęcherzyków i spowoduje wyciek fluoroforu.

2. Przygotowanie roztworu fluorescencyjnego

1. Na 24 godziny przed użyciem rozcieńczyć liposomy i inkubować z gramicydyną (w temperaturze 13 °C). Równowaga gramicydyny między wewnętrzną i zewnętrzną monowarstwą pęcherzyków lipidowych jest procesem powolnym i wymaga długiej inkubacji.
>
2. Dokładnie wymieszać roztwór zapasu LUV wypełnionych ANTS za pomocą wortexa, ponieważ LUV mają gęstość >1 g/mL i będą zatem osadzać się w roztworach.
>
3. Zmieszać zapas LUV wypełnionych ANTS w stosunku 1:20 w buforze Na. Wszystkie liposomy przeznaczone do użycia w ciągu jednego dnia doświadczeń zmieszać razem w jednej kolbie, aby zwiększyć jednorodność próbek.
>
4. Oddzielić 3/4 liposomów i dodać 260 nM gramicydyny uprzednio rozcieńczonej w DMSO (50 μg/mL).
>
5. Do pozostałej 1/4 dodać taką samą objętość DMSO (bez gramicydyny), aby utrzymać stałe stężenie rozpuszczalnika we wszystkich próbkach.
>

3. Konfiguracja urządzenia do fluorescencji

1. Do pomiaru szybkości wygaszania fluorescencji używamy spektrofluorometru z systemem przepływu zatrzymanego (stopped-flow) Applied Photophysics SX.20 z kontrolą temperatury.
2. Włącz instrumenty z godzinnym wyprzedzeniem, aby umożliwić ich rozgrzanie. Komponenty obejmują: komputer, elektroniczną jednostkę sterującą, łaźnię wodną (chłodnicę i grzałkę), zasilacz lampy oraz butlę z azotem.
3. Ustaw warunki rejestracji za pomocą oprogramowania Pro-Data SX.
4. Ustaw długość fali wzbudzenia monochromatora na 352 nm, a szerokość szpary wzbudzenia na 1/1.
5. Do rejestracji emisji użyj filtra górnoprzepustowego λ=45 nm.
6. Użyj ustawienia „Pressure Hold”, które pozwala instrumentowi utrzymać ciśnienie azotu podczas rejestracji, co zapobiega oscylacjom ciśnienia (i artefaktom pomiarowym) w ciągu pierwszych kilku milisekund.
7. Ustaw parametr „Time” na 1 s oraz „Points” na 500.
8. Użyj pola powtórzeń i dostosuj liczbę pomiarów; zazwyczaj stosujemy odpowiednio 9 i 13 powtórzeń dla serii z buforem i wygaszaczem.
9. Temperaturę łaźni wodnej należy ustawić na 25°C; temperaturę należy monitorować w oprogramowaniu SX.
10. Ustaw objętość tłoczenia (drive volume) na 120 μL, co oznacza, że przy każdym pomiarze instrument miesza 60 μL z każdej z dwóch strzykawek. Przy takiej konfiguracji instrumentu objętość 120 μL zapewnia czas martwy wynoszący ≈ 1.2 ms.
11. Dostosuj wysokie napięcie (wzmocnienie) detektora fluorescencji tak, aby sygnał z liposomów ANTS wynosił około 8. Dla standardowej mieszaniny eksperymentalnej wzmocnienie powinno wynosić 40-420 V. Niektóre leki wykazują fluorescencję, co może prowadzić do nasycenia sygnału fluorescencji; w takich przypadkach należy zmniejszyć wzmocnienie/napięcie.
12. Zawsze wprowadzaj fluorescencyjną próbkę do lewej strzykawki, a bufor/wygaszacz do prawej strzykawki. Pamiętaj o dokładnym wymieszaniu na wortexie wszystkich próbek zawierających liposomy przed ich wprowadzeniem i miej na uwadze, że LUV z czasem osiadają w strzykawce.

4. Przeprowadzenie eksperymentu

1. Przygotować próbkę LUV obciążonych ANTS z dodatkiem rozpuszczalnika lub związku, a następnie wprowadzić do spektrofluorometru wraz z buforem Na lub wygaszaczem Tl (50 mM TlNO₃, 94 mM NaNO₃, 10 mM HEPES przy pH 7.0).
2. Użyć 1,5 mL rozcieńczonego roztworu ANTS-LUV, z gramicydyną lub bez niej, przygotowanego w dniu poprzednim.
3. Dodać związek w pożądanym stężeniu lub rozpuszczalnik w przypadku prób kontrolnych. Stężenie rozpuszczalnika należy utrzymać na minimalnym poziomie i zachować stałe dla wszystkich próbek. Stężenia będą wymagały dostosowania dla każdego nowego (nieznanego) związku, aby uzyskać pożądany zakres zależności dawka-odpowiedź. Inkubować przez 10 min w temperaturze 25°C w ciemności.
4. Wymieszać próbkę LUV wortexie i wprowadzić do lewej strzykawki. Wprowadzić bufor Na lub wygaszacz Tl do prawej strzykawki.
5. Dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza z obu próbek, przesuwając tłoki strzykawek w przód i w tył.
6. Przed zamknięciem zaworów upewnić się, że obie strzykawki są napełnione w równym stopniu. Nierówne napełnienie spowoduje przedwczesne zmieszanie roztworów przed dotarciem do komory pomiarowej.
7. W przypadku pierwszej próbki zarejestrować fluorescencję z buforem Na, powtórzyć 4 razy, dostosować wysokie napięcie (wzmocnienie) w razie potrzeby i powtórzyć 5 razy.
8. Dla pozostałych próbek zarejestrować 9 powtórzeń z buforem Na.
9. Zastąpić bufor Na wygaszaczem Tl i zarejestrować 13 powtórzeń.
10. Przepłukać wodą i przejść do kolejnej próbki. Jako kontrole stosujemy próbki: bez gramicydyny i z rozpuszczalnikiem, bez gramicydyny i z maksymalnym stężeniem związku oraz z gramicydyną i rozpuszczalnikiem.

5. Analiza danych

1. Przenieś wyniki na komputer analityczny. Wczytaj wszystkie dane do programu MATLAB w celu ich analizy. Dla każdej próbki wczytaj wszystkie powtórzenia dla buforu i wygaszacza, pomijając cztery pierwsze w każdym przypadku, ponieważ zawierają one artefakty mieszania. Zakładając objętość napędu wynoszącą 120 μL do całkowitego usunięcia poprzedniej mieszaniny z przewodów układu stopped-flow potrzeba nieco mniej niż czterech cykli przepływu.
2. Powtórzenia buforu dla wszystkich próbek powinny być bardzo zbliżone. Jeśli występuje znaczna zmiana sygnału fluorescencji, która zależy od stężenia związku, może to oznaczać, że sam związek wykazuje fluorescencję i przed normalizacją próbek konieczne może być odjęcie tego dodatkowego sygnału fluorescencji.
3. Ręcznie przejrzyj ślady i usuń „wadliwe” powtórzenia: powtórzenia zawierające piki lub odchylenia od wielowykładniczości wynikające z artefaktów mieszania i/lub pęcherzyków powietrza.
4. Znormalizować powtórzenia dla gasiciela do średniej wartości początkowej powtórzeń dla buforu dla każdej próbki. Połączyć średnie wartości wszystkich próbek na jednym wykresie w celu wizualizacji.
5. Zapisy zarejestrowane bez dodatku gramicydyny powinny być do siebie podobne i nie wykazywać niemal żadnego gaszenia fluorescencji; może wystąpić powolny spadek sygnału fluorescencji wynikający z powolnego wycieku Tl+⁺ przez dwuwarstwę pęcherzyków 8. Jeśli próbka bez gramicydyny i bez modyfikatora wykazuje znaczące gaszenie, oznacza to, że pęcherzyki uległy degradacji i nie powinny być dalej wykorzystywane. Jeśli próbki bez gramicydyny, ale z modyfikatorem, wykazują znaczące gaszenie, oznacza to, że modyfikator zaburza dwuwarstwę pęcherzyków w takim stopniu, że umożliwia to przenikanie fluoroforu lub wygaszacza przez dwuwarstwę.
6. Jeśli związek zmieni właściwości dwuwarstwy lipidowej, co zostanie wykryte przez kanały gramicydyny, przebieg fluorescencji w czasie ulegnie widocznej zmianie.
7. Dla każdej próbki zastosowano rozciągniętą funkcję wykładniczą np. ⁴) dopasowuje się do pierwszych 2–10 ms znormalizowanej krzywej gaszenia fluorescencji poszczególnych powtórzeń, a szybkość ⁴ obliczone w odstępie 2 ms. Średnie i odchylenia standardowe dla danej próbki obliczono na podstawie wszystkich pojedynczych powtórzeń.
8. Na koniec należy wyznaczyć względną zmianę szybkości gaszenia poprzez normalizację do najbliższej w czasie próbki kontrolnej zawierającej gramicydynę i pozbawionej modyfikatora.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Podstawy analizy opartej na wygaszaniu fluorescencji w celu wykrywania zmian we właściwościach dwuwarstwy lipidowej. Góra po lewej: powiększenie pojedynczego pęcherzyka lipidowego z ANTS oraz NaNO2₃ od wewnątrz oraz NaNO₃ plus TlNO₃ na zewnątrz. Góra po prawej: sygnał fluorescencji zarejestrowany przy użyciu (od góry dołu) pęcherzyków wypełnionych ANTS bez wygaszacza, z wygaszaczem, z wygaszaczem i uprzednio domieszkowanych gramicydyną w stężeniach 87, 260 i 780 nM. Dół: schematyczna reprezentacja komory mieszania w układzie stopped-flow.

Rycina 2: Zrzut ekranu z oprogramowania Pro-Data SX przedstawiający poszczególne panele wspomniane w opisie układu doświadczalnego.

Rycina 3: Wielokrotne powtórzenia pomiarów sygnału fluorescencji z LUV obciążonych ANTS w buforze sodowym. Pierwsze cztery powtórzenia są zawsze pomijane, ponieważ zawierają artefakty mieszania. Przewody łączące strzykawki z próbkami z komorą mieszającą mają określoną objętość, w związku z czym pierwsze kilka powtórzeń odzwierciedla zawartość poprzednich cykli: w powtórzeniach 1 i 2 jest to woda, w powtórzeniu 3 mieszanina wody i próbki, w powtórzeniu 4 głównie próbka, a w pozostałych powtórzeniach wyłącznie próbka.

Rysunek 4: Wielokrotne powtórzenia pomiarów sygnału fluorescencji z LUV obciążonych ANTS w buforze Na oraz z wygaszaczem Tl. Pierwsze cztery powtórzenia zostały usunięte dla obu warunków. Dodatkowo, w przypadku pomiarów z wygaszaczem Tl, należy usunąć powtórzenie 8 ze względu na artefakty, najprawdopodobniej będące pęcherzykami powietrza.

Rysunek 5: Wpływ kapsaicyny (Cap) na przebieg czasowy wygaszania fluorescencji ANTS. (A) Znormalizowany sygnał fluorescencji w czasie 1 s, szare kropki oznaczają wyniki ze wszystkich powtórzeń (n > 5 na warunek); czerwone linie oznaczają średnią ze wszystkich powtórzeń. (B) Pierwsze 10 ms, szare kropki oznaczają wyniki z pojedynczego powtórzenia dla każdego warunku; czerwone linie to dopasowania wykładnicze rozciągnięte (2–10 ms) do tych powtórzeń. Przerywana niebieska linia oznacza znacznik 2 ms, czas, w którym wyznaczana jest szybkość gaszenia. Zarówno w A, jak i w B górny ślad pokazuje wyniki w obecności Tl⁺; kolejne dwa ślady przedstawiają wyniki w nieobecności gA, z Tl⁺ ± Cap; cztery dolne ślady przedstawiają wyniki z zastosowaniem 260 nM gA oraz Tl⁺, gdzie liczby oznaczają [Cap] w μMSzybkości gaszenia dla 0, 10, 30 i 90 μM Wartości Cap, wyznaczone na podstawie szybkości funkcji wykładniczej rozciągniętej, wynoszą odpowiednio 36±6, 69±6, 85±8 oraz 247±27 (średnia ± odchylenie standardowe, n > odpowiednio 8).

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy szybki test oparty na fluorescencji do określania potencjału modyfikującego dwuwarstwę przez leki i inne małe amfifile. Związki modyfikujące właściwości dwuwarstwy mogą zmieniać funkcję białek błonowych w sposób pośredni i nieswoisty, co prawdopodobnie przyczynia się do efektów leków typu „off-target”. Test wykorzystuje właściwości kanałów gramicydynowych jako sond zmian we właściwościach dwuwarstwy ¹², które są wykrywane przez białka przechodzące przez dwuwarstwę. Wyniki uzyskane za pomocą t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicydyna	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucylo-sn-glycero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
zestaw do mini-ekstruzji	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
kolumna odsalająca PD-10	Sigma-Aldrich	54805