Test fluorescencyjny na bazie gramicydyny; do określania potencjału małych cząsteczek do modyfikowania właściwości dwuwarstw lipidowych

Podsumowanie

Wprowadzamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość wygaszania fluorescencji jako miarę aktywności kanału gramicidyny. Kanały gramicydyny są wykorzystywane jako przetworniki siły molekularnej do monitorowania zmian właściwości dwuwarstwowych lipidów wykrywanych przez białka dwuwarstwowe.

Streszczenie

Wiele leków i innych małych cząsteczek używanych do modulowania funkcji biologicznych to amfifile, które adsorbują na granicy między dwiema warstwami i w ten sposób zmieniają właściwości dwuwarstwowych lipidów. Jest to ważne, ponieważ białka błonowe są energetycznie sprzężone z dwuwarstwą gospodarza przez oddziaływania hydrofobowe. Zmiany we właściwościach dwuwarstwowych zmieniają zatem funkcję białka błonowego, co zapewnia amfifilom pośredni sposób modulowania funkcji białka i możliwy mechanizm "niedocelowego" działania leku. Wcześniej opracowaliśmy test elektrofizjologiczny do wykrywania zmian właściwości dwuwarstw lipidowych przy użyciu liniowych kanałów gramicidyny jako sond ^3,12. Kanały gramikadyny to minibiałka powstałe w wyniku dimeryzacji transdwuwarstwowej dwóch podjednostek nieprzewodzących. Są wrażliwe na zmiany w środowisku błonowym, co czyni je potężnymi sondami do monitorowania zmian właściwości dwuwarstw lipidowych wykrywanych przez białka obejmujące dwie warstwy. Teraz demonstrujemy test fluorescencyjny do wykrywania zmian właściwości dwuwarstwowych przy użyciu tych samych kanałów, co sondy. Test opiera się na pomiarze przebiegu w czasie wygaszania fluorescencji z dużych pęcherzyków jednowarstwowych obciążonych fluoroforem w wyniku wejścia wygaszacza przez kanały gramicidyny. Używamy pary wskaźnik/wygaszacz fluorescencji 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonianu (ANTS)/Tl⁺, która jest z powodzeniem stosowana w innych testach wygaszania fluorescencji ^5,13. Tl⁺ przenika przez dwuwarstwę lipidową ^{powoli 8}, ale łatwo przechodzi przez kanały przewodzące gramicydynę ^1,14. Metoda jest skalowalna i nadaje się zarówno do badań mechanistycznych, jak i wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek pod kątem dwuwarstwowych i potencjalnych efektów "poza celem". Stwierdzamy, że wyniki uzyskane przy użyciu tej metody są dobrze zgodne z wcześniejszymi wynikami elektrofizjologicznymi ¹².

Protokół

1. Generuj liposomy wypełnione MRÓWKAMI

1. W dniu 1 usuń rozpuszczalnik organiczny z lipidów.
2. Wyjmij lipid z zamrażarki i pozwól mu zrównoważyć się do temperatury pokojowej.
3. Dodać 0,6 ml lipidu o stężeniu 25 mg/ml (1,2-dierukoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny) w roztworze chloroformu do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml.
4. Podczas suszenia w atmosferze azotu ciągle obracać kolbę, aż cały chloroform odparuje i cienka biała warstwa lipidów pokryje całą dolną połowę kolby.
5. Suszyć w eksykatorze pod próżnią przez noc.

1. W dniu 2 przygotuj próbkę z fluoroforem, który zostanie włączony do pęcherzyków.
2. Hydrate w 100 mM NaNO₃, 25 mM ANTS (Na sól), 10 mM HEPES. Użyj HNO₃ lub NaOH, aby dostosować pH do 7,0. Każda cząsteczka ANTS ma 2 Na⁺, co daje łącznie 150 mM [Na⁺]. Dodaj 1,671 ml elektrolitu, aby uzyskać 10 mM zawiesinę lipidową.
3. Dokładnie zawiesinę parafilmu i wiru.
4. Chroń próbkę przed światłem folią i pozwól jej leżakować w temperaturze pokojowej przez noc.

1. W dniu 3 utwórz duże pęcherzyki jednowarstwowe i usuń cały fluorofor z zewnątrz pęcherzyków.
2. Sonikuj przez 1 minutę w sonikatorze o małej mocy.
3. Próbkę zamrażać i rozmrażać 5-6 razy, za każdym razem 5 minut na suchym lodzie i 5 minut w ciepłej (~50 °C) wodzie.
4. Wytłaczaj zawiesinę lipidową za pomocą mini-ekstrudera Avanti. Skonfiguruj mini-ekstruder z filtrem poliwęglanowym 0,1 μm i wspornikami filtrów (szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji ekstrudera). Wytłacz zawiesinę w przód i w tył 21 razy, tak aby zawiesina znalazła się na przeciwległej strzykawce. W przypadku wytłaczania wielu partii należy zawsze pamiętać o załadowaniu próbek tą samą strzykawką. Podczas ekstruzji mętna początkowa zawiesina lipidowa powinna stać się prawie przezroczysta (nadal będzie żółta ze względu na fluorofor ANTS). Jeśli wytłaczanie nagle stanie się łatwiejsze i do przejścia przez filtr potrzebne jest mniejsze ciśnienie, filtr mógł pęknąć i będzie wymagał wymiany.
5. Usuń zewnętrzne ANTS, przesuwając wytłaczaną zawiesinę po kolumnie odsalającej PD-10 przy użyciu protokołu grawitacyjnego. Wyrównaj kolumnę z 20-30 ml buforu Na (140 mM NaNO₃, 10 mM HEPES, pH 7,0, pamiętaj o użyciu HNO₃ lub NaOH do dostosowania pH). Dodać 1,5 ml ekstrudowanej zawiesiny lipidowej do kolumny i pozostawić do wchłonięcia. Doprowadzić całkowitą objętość próbki do 2,5 ml, dodając 1 ml buforu Na. Po całkowitym wprowadzeniu buforu do kolumny i niczym nie wycieka, eluuj liposomy za pomocą 3 ml buforu Na i zbierz otrzymaną próbkę. Otrzymany roztwór podstawowy LUV wypełniony ANTS powinien zawierać około 4-5 mM lipidów i być półprzezroczysty mlecznobiały. Chronić próbkę przed światłem folią.
6. Jeśli roztwór podstawowy nie zostanie natychmiast zużyty, przechowywać w temperaturze 13 °C maksymalnie 7 dni. Ostrzeżenie: nie zamrażaj ani nie schładzaj roztworu lipidowego poniżej temperatury przejścia cieczy do fazy krystalicznej (~12 °C), ponieważ zniszczy to integralność pęcherzyków i fluorofor wycieknie.

2. Wymieszaj roztwór fluorescencyjny

1. 24 godziny przed użyciem rozcieńczyć liposomy i inkubować z gramicidyną (w temperaturze 13 °C). Równoważenie gramicydyny między wewnętrznymi i zewnętrznymi monowarstwami pęcherzyków lipidowych jest procesem powolnym, wymagającym długiej inkubacji.
2. Dokładnie zwirować roztwór podstawowy LUV wypełniony ANTS, ponieważ LUV mają gęstość >1 g/ml i dlatego będą osadzać się w roztworach.
3. Wymieszaj wypełniony ANTS bulion LUV w stosunku 1:20 w buforze Na. Wymieszaj wszystkie liposomy do użycia w ciągu jednego dnia eksperymentów razem w jednej kolbie, aby zwiększyć jednorodność próbki.
4. Oddzielić 3/4 liposomów i dodać 260 nM gramicydyny wstępnie rozcieńczonej w DMSO (500 μg/ml).
5. Do pozostałej 1/4 dodać tę samą objętość DMSO (bez gramicydyny), aby utrzymać stałe stężenie rozpuszczalnika we wszystkich próbkach.

3. Konfiguracja urządzenia do fluorescencji

1. Używamy spektrofluorometru z zatrzymanym przepływem SX.20 firmy Applied Photophysics z kontrolą temperatury do pomiaru szybkości wygaszania fluorescencji.
2. Włącz instrumenty z godzinnym wyprzedzeniem, aby umożliwić rozgrzewkę. Elementami składowymi są: komputer, elektroniczna jednostka sterująca, łaźnia wodna (zarówno chłodnica, jak i grzałka), zasilacz lampy oraz zbiornik azotu.
3. Skonfiguruj warunki nagrywania za pomocą oprogramowania Pro-Data SX.
4. Ustaw długość fali wzbudzenia monochromatora na 352 nm i apertury o szerokości szczeliny dla wzbudzenia na 1/1.
5. Do zarejestrowania emisji należy użyć filtra górnoprzepustowego λ=455 nm.
6. Użyj ustawienia "Utrzymanie ciśnienia", które umożliwia instrumentowi utrzymanie ciśnienia azotu podczas nagrywania, a tym samym zapobiega wahaniom ciśnienia (i artefaktom nagrywania) w ciągu pierwszych kilku milisekund.
7. Ustaw "Czas" na 1 s, a "Punkty" na 5000.
8. Użyj pola powtórzeń i dostosuj liczbę powtórzeń, zwykle używamy 9 i 13 powtórzeń odpowiednio dla przebiegów buforowania i wygaszania.
9. Temperatura łaźni wodnej powinna być ustawiona na 25°C; temperatura powinna być monitorowana w oprogramowaniu SX.
10. Ustaw objętość dysku na 120 μl, co oznacza, że za każdym razem, gdy urządzenie uruchamia próbkę, miesza 60 μl z każdej z dwóch strzykawek. Przy tej konfiguracji instrumentalnej objętość 120 μl daje czas martwy ≈ 1,2 ms.
11. Dostosuj wysokie napięcie (wzmocnienie) na detektorze fluorescencji, aby moc wyjściowa liposomu ANTS wynosiła około 8. Dla standardowej mieszaniny doświadczalnej wzmocnienie powinno wynosić 400-420 V. Niektóre leki są fluorescencyjne, dzięki czemu mogą nasycać sygnał fluorescencyjny. W takich przypadkach wzmocnienie/napięcie powinno zostać zmniejszone.
12. Próbkę fluorescencyjną należy zawsze ładować do lewej strzykawki, a bufor/wygaszacz do prawej strzykawki. Upewnij się, że dokładnie zwirowałeś wszystkie próbki zawierające liposomy przed załadowaniem i pamiętaj, że LUV z czasem osiądą w strzykawce.

4. Przeprowadzanie eksperymentu

1. Przygotować próbkę LUV obciążonych ANTS rozpuszczalnikiem lub związkiem i załadować do spektrofluorometru razem z buforem Na lub wygaszaczem Tl (50 mM TlNO₃, 94 mM NaNO₃, 10 mM HEPES przy pH 7,0).
2. Użyć 1,5 ml rozcieńczonego roztworu ANTS-LUV, z gramicydyną lub bez, przygotowanego poprzedniego dnia.
3. Dodać związek o pożądanym stężeniu lub rozpuszczalnik do kontroli. Stężenie rozpuszczalnika należy utrzymywać na minimalnym i stałym poziomie we wszystkich próbkach. Stężenia będą musiały zostać dostosowane do każdego nowego (nieznanego) związku, aby osiągnąć pożądany zakres dawka-odpowiedź. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 25°C w ciemności.
4. Zmieszać próbkę LUV i załadować ją do lewej strzykawki. Załadować bufor Na lub wygaszacz Tl do prawej strzykawki.
5. Dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza z obu próbek, popychając strzykawki do przodu i do tyłu.
6. Upewnij się, że obie strzykawki są załadowane równomiernie przed zamknięciem zaworów. Nierównomierne obciążenie spowoduje wstępne wymieszanie roztworów, zanim dotrą one do komory zapisu.
7. Dla pierwszej próbki należy zarejestrować fluorescencję za pomocą bufora Na, powtórzyć 4 razy, w razie potrzeby wyregulować wysokie napięcie (wzmocnienie) i powtórzyć 5 razy.
8. Dla pozostałych próbek nagrać 9 powtórzeń z buforem Na.
9. Zastąp bufor Na wygaszaczem Tl i zapisz 13 powtórzeń.
10. Spłukać wodą i kontynuować z następną próbką. Jako próbki kontrolne używamy próbek z: bez gramicydyny i z rozpuszczalnikiem, bez gramicidyny i o maksymalnym stężeniu związku, zarówno z gramicydyną, jak i rozpuszczalnikiem.

5. Analizowanie danych

1. Prześlij wyniki do komputera analitycznego. Wczytaj wszystkie dane do MATLAB w celu analizy. Dla każdej próbki należy odczytać wszystkie powtórzenia buforowania i wygaszania, z wyłączeniem pierwszych czterech w każdym przypadku, ponieważ zawierają one artefakty mieszania. Zakładając objętość dysku 120 μl, potrzeba nieco mniej niż czterech strzałów, aby całkowicie usunąć poprzednią mieszaninę z rurki o zatrzymanym przepływie.
2. Powtórzenia buforu dla wszystkich próbek powinny być bardzo podobne. Jeśli występuje znaczne przesunięcie sygnału fluorescencji, które zależy od stężenia związku, wówczas sam związek może być fluorescencyjny i może być konieczne najpierw odjęcie tego dodatkowego sygnału fluorescencji przed normalizacją próbek.
3. Ręcznie przejrzyj ślady i usuń "złe" powtórzenia: powtórzenia zawierające skoki lub odchylenia od wielowykładniczości spowodowane mieszaniem artefaktów i/lub pęcherzyków.
4. Znormalizować liczbę powtórzeń wygaszania do średniej wartości początkowej powtórzeń buforu dla każdej próbki. Połącz średnie ze wszystkich próbek na jednym wykresie w celu wizualizacji.
5. Ślady zarejestrowane bez gramicydyny powinny być podobne i prawie nie wykazywać wygaszania fluorescencji; może wystąpić powolna redukcja sygnału fluorescencji z powodu powolnego wycieku Tl⁺ przez dwuwarstwę pęcherzyków 8. Jeśli próbka bez gramicydyny i modyfikatora wykazuje znaczne wygaszanie, oznacza to, że pęcherzyki uległy pogorszeniu i nie powinny być dalej używane. Jeśli próbki bez gramicydyny, ale z modyfikatorem, wykazują znaczne wygaszenie, wówczas modyfikator zaburza dwuwarstwę pęcherzyków do tego stopnia, że umożliwia fluoroforowi lub wygaszaczowi przejście przez dwuwarstwę.
6. Jeśli związek zmienia właściwości dwuwarstwy lipidowej, co jest wykrywane przez kanały gramicidyny, przebieg fluorescencji w czasie zostanie widocznie zmieniony.
7. Dla każdej próbki rozciągnięta wykładnicza np. ⁴) jest dopasowana do pierwszych 2-100 ms znormalizowanej krzywej wygaszania fluorescencji poszczególnych powtórzeń i szybkości ⁴ obliczonej przy 2 ms. Średnie i odchylenia standardowe są obliczane dla danej próbki ze wszystkich pojedynczych powtórzeń.
8. Na koniec określ względną zmianę szybkości tłumienia, normalizując do najbliższej próbki kontrolnej w czasie, która zawiera gramicydynę i nie zawiera modyfikatora.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Podstawy testu opartego na wygaszaniu fluorescencji w celu wykrycia zmian we właściwościach dwuwarstwy lipidowej. U góry po lewej: Zbliżenie na pojedynczy pęcherzyk lipidowy z ANTS plus NaNO₃ w środku i NaNO₃ plus TlNO₃ na zewnątrz. U góry po prawej: Sygnał fluorescencyjny zarejestrowany za pomocą (od góry do dołu) pęcherzyków wypełnionych ANTS bez wygaszania, z wygaszaczem, z wygaszaczem i wstępnie domieszkowanych gramicydyną 87, 260 i 780 nM. U dołu: Schematyczne przedstawienie komory mieszania z zatrzymanym przepływem.

Rysunek 2: Zrzut ekranu z oprogramowania Pro-Data SX ilustrujący różne panele, do których odwołuje się opis konfiguracji eksperymentalnej.

Rysunek 3: Wielokrotne powtarzanie oznaczania sygnału fluorescencji z LUV załadowanych ANTS z buforem Na. Pierwsze cztery powtórzenia są zawsze wykluczane, ponieważ zawierają artefakty mieszania. Rurka łącząca strzykawki z próbką z komorą mieszania ma określoną objętość, dlatego kilka pierwszych powtórzeń da nam odczyt tego, co wcześniej znajdowało się w przewrocie: woda dla powtórzenia 1 i 2, pewna kombinacja wody i próbki dla powtórzenia 3, głównie próbka dla powtórzenia 4 i tylko próbka dla pozostałych powtórzeń.

Rysunek 4: Wielokrotne powtarzanie oznaczania sygnału fluorescencji z LUV załadowanych ANTS z buforem Na, a także z wygaszaczem Tl. Pierwsze cztery powtórzenia zostały usunięte z obu warunków. Dodatkowo, w przypadku pomiarów wygaszania tl, powtórzenie 8 musi zostać usunięte z powodu artefaktów, najprawdopodobniej pęcherzyków powietrza.

Rysunek 5: Wpływ kapsaicyny (Cap) na przebieg czasowy wygaszania fluorescencji ANTS. (A) Znormalizowany sygnał fluorescencji w ciągu 1 s, szare kropki oznaczają wyniki ze wszystkich powtórzeń (n > 5 na warunek); Czerwone linie oznaczają średnią wszystkich powtórzeń. (B) Pierwsze 100 ms, szare kropki oznaczają wyniki pojedynczego powtórzenia dla każdego warunku; Czerwone linie to rozciągnięte wykładniczo dopasowania (2 - 100 ms) do tych powtórzeń. Kropkowana niebieska linia oznacza znak 2 ms, czas, w którym określa się szybkość hartowania. Zarówno w A, jak i B górny ślad pokazuje wyniki przy braku Tl⁺; kolejne dwa ślady pokazują wyniki przy braku gA, z Tl⁺ ± Cap; cztery dolne ścieżki pokazują wyniki z 260 nM gA i Tl⁺, gdzie liczby oznaczają [Cap] w μM. Szybkości hartowania dla nasadki 0, 10, 30 i 90 μM, określone szybkością rozciągniętego wykładnika, wynoszą odpowiednio 36±6, 69±6, 85±8 i 247±27 (średnia ± s.d., n > 8).

Dyskusja

Zademonstrowaliśmy szybki test oparty na fluorescencji do określania dwuwarstwowego potencjału modyfikującego leków i innych małych amfifilów. Związki, które modyfikują właściwości dwuwarstwowe, mogą zmieniać funkcję białka błonowego w pośredni, niespecyficzny sposób, prawdopodobnie przyczyniając się do "niedocelowych" efektów leku. Test wykorzystuje moc kanałów gramicydyny jako sond do zmian właściwości dwuwarstwowych ¹² , które są wykrywane przez białka obejmujące dwie warstwy. Wyniki uzyskane za pomocą t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Zestaw mini-wytłaczarki	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Kolumna odsalająca	Sigma-Aldrich	54805