Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Podsumowanie

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Streszczenie

Wiele leków i innych małych cząsteczek stosowanych do modulowania funkcji biologicznych to amfifile, które adsorbują się na granicy fazy dwuwarstwy/roztwór i w ten sposób zmieniają właściwości lipidowej dwuwarstwy. Jest to istotne, ponieważ białka błonowe są sprzężone energetycznie z ich macierzystą dwuwarstwą poprzez oddziaływania hydrofobowe. Zmiany we właściwościach dwuwarstwy zmieniają zatem funkcję białek błonowych, co stanowi pośredni sposób modulowania funkcji białek przez amfifile i możliwy mechanizm działania leków typu „off-target”. Opracowaliśmy wcześniej test elektrofizjologiczny do wykrywania zmian we właściwościach lipidowej dwuwarstwy, wykorzystujący liniowe kanały gramicydyny jako sondy ^3,12. Kanały gramicydyny to minibiałka tworzone przez dimeryzację dwóch nieprzewodzących podjednostek w poprzek dwuwarstwy. Są one wrażliwe na zmiany w otoczeniu błonowym, co czyni je potężnymi sondami do monitorowania zmian we właściwościach lipidowej dwuwarstwy odczuwanych przez białka przebłonowe. Prezentujemy obecnie test fluorescencyjny do wykrywania zmian we właściwościach dwuwarstwy z wykorzystaniem tych samych kanałów jako sond. Test opiera się na pomiarze przebiegu czasowego wygaszania fluorescencji z dużych pęcherzyków jednowarstwowych załadowanych fluoroforem, spowodowanego przenikaniem wygaszacza przez kanały gramicydyny. Stosujemy parę wskaźnik fluorescencji/wygaszacz 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonian (ANTS)/Tl⁺, która była z powodzeniem wykorzystywana w innych testach wygaszania fluorescencji ^5,13. Tl⁺ powoli przenika przez lipidową dwuwarstwę ⁸, ale łatwo przechodzi przez przewodzące kanały gramicydyny ^1,14. Metoda ta jest skalowalna i odpowiednia zarówno do badań mechanistycznych, jak i do wysokoprzepustowego przesiewania małych cząsteczek pod kątem efektów zaburzających dwuwarstwę oraz potencjalnych efektów „off-target”. Stwierdzamy, że wyniki uzyskane za pomocą tej metody są w dobrej zgodności z wcześniejszymi wynikami elektrofizjologicznymi ¹².

Protokół

1. Generowanie liposomów wypełnionych ANTS

1. W dniu 1. usunąć rozpuszczalnik organiczny z lipidów.
2. Wyjąć lipidy z zamrażarki i pozostawić do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.
3. Do kolby okrągłodennej o pojemności 25 mL dodać 0,6 mL roztworu lipidów (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) w chloroformie o stężeniu 25 mg/mL.
4. Kolbę należy stale obracać podczas suszenia w strumieniu azotu, aż do całkowitego odparowania chloroformu i powstania cienkiej białej warstwy lipidów pokrywającej całą dolną połowę kolby.
5. Suszyć w eksykatorze pod próżnią przez noc.

1. W drugim dniu przygotować próbkę z fluoroforem, który zostanie wbudowany w pęcherzyki.
2. Rehydratyzować w 100 mM NaNO₃, 25 mM ANTS (sól sodowa), 10 mM HEPES. Użyć HNO₃ lub NaOH w celu dostosowania pH do 7,0. Każda cząsteczka ANTS posiada 2 Na⁺, co daje łącznie 150 mM [Na⁺]. Dodać 1,671 mL elektrolitu, aby uzyskać 10 mM zawiesinę lipidową.
3. Zabezpieczyć Parafilmem i dokładnie wymieszać zawiesinę w wortexie.
4. Chronić próbkę przed światłem za pomocą folii i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez noc.

1. W dniu 3. przygotować duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV) i usunąć cały fluorofor z ich zewnętrznej strony.
2. Sonicować przez 1 min w sonikatorze o niskiej mocy.
3. Próbkę zamrozić i rozmrozić 5-6 razy, za każdym razem pozostawiając ją przez 5 minut na suchym lodzie i 5 minut w ciepłej (~50 °C) wodzie.
4. Wytłoczyć zawiesinę lipidową za pomocą mini-ekstrudera Avanti. Wyposażyć mini-ekstruder w filtr poliwęglanowy 0,1 μm oraz podpory filtra (szczegóły znajdują się w instrukcji ekstrudera). Wytłoczyć zawiesinę w przód i w tył 21 razy, tak aby zawiesina ostatecznie znalazła się w przeciwległej strzykawce. W przypadku wytłaczania wielu partii należy pamiętać, aby zawsze ładować próbki tą samą strzykawką. Podczas ekstruzji mętna początkowa zawiesina lipidowa powinna stać się prawie przezroczysta (nadal będzie żółta ze względu na fluorofor ANTS). Jeśli proces wytłaczania nagle stanie się łatwiejszy i przesuwanie przez filtr będzie wymagało mniejszego ciśnienia, może to oznaczać pęknięcie filtra, który należy wówczas wymienić.
5. Usunąć zewnętrzny ANTS, przepuszczając wytłoczoną zawiesinę przez kolumnę odsalającą PD-10 zgodnie z protokołem grawitacyjnym. Równoważyć kolumnę 20-30 mL buforu Na (140 mM NaNO₃, 10 mM HEPES, pH 7.0; do regulacji pH należy użyć HNO₃ lub NaOH). Nałożyć 1,5 mL wytłoczonej zawiesiny lipidowej na kolumnę i pozwolić jej wsiąknąć. Doprowadzić całkowitą objętość próbki do 2,5 mL, dodając 1 mL buforu Na. Po całkowitym wniknięciu buforu do kolumny i ustaniu wycieków, eluować liposomy 3 mL buforu Na i zebrać otrzymaną próbkę. Uzyskany roztwór stokowy LUV wypełnionych ANTS powinien zawierać około 4-5 mM lipidów i mieć półprzezroczysty, mlecznobiały kolor. Chronić próbkę przed światłem za pomocą folii.
6. Jeśli roztwór stokowy nie zostanie zużyty natychmiast, przechowywać go w temperaturze 13 °C przez maksymalnie 7 dni. Ostrzeżenie: nie zamrażać ani nie chłodzić roztworu lipidów poniżej temperatury przejścia z fazy ciekłej w krystaliczną (~12 °C), ponieważ zniszczy to integralność pęcherzyków i doprowadzi do wycieku fluoroforu.

2. Przygotowanie roztworu fluorescencyjnego

1. Na 24 godziny przed użyciem rozcieńczyć liposomy i inkubować z gramicydyną (w 13 °C). Równoważenie gramicydyny między wewnętrzną a zewnętrzną monowarstwą pęcherzyków lipidowych jest procesem powolnym, wymagającym długiej inkubacji.
2. Dokładnie wymieszać roztwór stokowy LUV wypełnionych ANTS za pomocą wstrząsarki vortex, ponieważ LUV mają gęstość >1 g/mL i będą zatem sedymentować w roztworach.
3. Zmieszać roztwór stokowy LUV wypełnionych ANTS z buforem sodowym w proporcji 1:20. Wszystkie liposomy przeznaczone do użycia w ciągu jednego dnia eksperymentów należy zmieszać w jednej kolbie, aby zwiększyć jednorodność próbek.
4. Odprowadzić 3/4 liposomów i dodać 260 nM gramicydyny uprzednio rozcieńczonej w DMSO (500 μg/mL).
5. Do pozostałej 1/4 dodać taką samą objętość DMSO (bez gramicydyny), aby utrzymać stałe stężenie rozpuszczalnika we wszystkich próbkach.

3. Konfiguracja urządzenia do pomiaru fluorescencji

1. Do pomiaru szybkości gaszenia fluorescencji wykorzystujemy spektrofluorometr stopped-flow Applied Photophysics SX.20 z kontrolą temperatury.
2. Włącz instrumenty z godzinnym wyprzedzeniem, aby umożliwić ich rozgrzanie. Elementy zestawu to: komputer, elektroniczna jednostka sterująca, łaźnia wodna (chłodziarka i grzałka), zasilacz lampy oraz butla z azotem.
3. Skonfiguruj warunki pomiaru za pomocą oprogramowania Pro-Data SX.
4. Ustaw długość fali wzbudzenia monochromatora na 352 nm oraz szerokość szczelin dla wzbudzenia na 1/1.
5. Do rejestracji emisji użyj filtra górnoprzepustowego λ=455 nm.
6. Użyj ustawienia „Pressure Hold”, które umożliwia instrumentowi utrzymanie ciśnienia azotu podczas pomiaru, co zapobiega oscylacjom ciśnienia (i artefaktom pomiarowym) w ciągu pierwszych kilku milisekund.
7. Ustaw parametr „Time” na 1 s oraz „Points” na 5000.
8. Skorzystaj z pola powtórzeń i dostosuj liczbę pomiarów; zazwyczaj stosujemy 9 powtórzeń dla buforu i 13 powtórzeń dla gaśnika.
9. Temperaturę łaźni wodnej należy ustawić na 25°C; temperaturę należy monitorować w oprogramowaniu SX.
10. Ustaw objętość tłoczenia na 120 μL, co oznacza, że przy każdym pomiaru instrument miesza 60 μL z każdej z dwóch strzykawek. Przy tej konfiguracji instrumentu objętość 120 μL zapewnia czas martwy wynoszący ≈ 1.2 ms.
11. Dostosuj wysokie napięcie (wzmocnienie) detektora fluorescencji tak, aby sygnał z liposomów ANTS wynosił około 8. Dla standardowej mieszaniny eksperymentalnej wzmocnienie powinno wynosić 400-420 V. Niektóre leki wykazują fluorescencję, co może prowadzić do nasycenia sygnału. W takich przypadkach należy zmniejszyć wzmocnienie/napięcie.
12. Zawsze wprowadzaj fluorescencyjną próbkę do lewej strzykawki, a bufor/gaśnik do prawej strzykawki. Pamiętaj o dokładnym wymieszaniu na wirówce wszystkich próbek zawierających liposomy przed ich wprowadzeniem oraz miej na uwadze, że LUV z czasem osiadają w strzykawce.

4. Przeprowadzanie eksperymentu

1. Przygotować próbkę LUV obciążonych ANTS z rozpuszczalnikiem lub związkiem i wprowadzić do spektrofluorometru wraz z buforem Na lub wygaszaczem Tl (50 mM TlNO₃, 94 mM NaNO₃, 10 mM HEPES przy pH 7.0).
2. Użyć 1,5 mL rozcieńczonego roztworu ANTS-LUV, z gramicydyną lub bez niej, przygotowanego w dniu poprzednim.
3. Dodać związek w pożądanym stężeniu lub rozpuszczalnik w przypadku kontroli. Należy utrzymać stężenie rozpuszczalnika na minimalnym i stałym poziomie we wszystkich próbkach. Stężenia będą wymagały dostosowania dla każdego nowego (nieznanego) związku, aby uzyskać pożądany zakres zależności dawka-odpowiedź. Inkubować przez 10 min w temperaturze 25°C w ciemności.
4. Wymieszać próbkę LUV za pomocą wortexa i wprowadzić do lewej strzykawki. Wprowadzić bufor Na lub wygaszacz Tl do prawej strzykawki.
5. Dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza z obu próbek, przesuwając tłoki strzykawek w przód i w tył.
6. Upewnić się, że obie strzykawki są wypełnione w takim samym stopniu przed zamknięciem zaworów. Nierówne wypełnienie spowoduje przedwczesne zmieszanie się roztworów przed dotarciem do komory pomiarowej.
7. Dla pierwszej próbki zarejestrować fluorescencję z buforem Na, powtórzyć 4 razy, dostosować wysokie napięcie (wzmocnienie) w razie potrzeby i powtórzyć 5 razy.
8. Dla pozostałych próbek zarejestrować 9 powtórzeń z buforem Na.
9. Zastąpić bufor Na wygaszaczem Tl i zarejestrować 13 powtórzeń.
10. Przepłukać wodą i kontynuować z następną próbką. Jako kontrole stosujemy próbki: bez gramicydyny z rozpuszczalnikiem, bez gramicydyny z maksymalnym stężeniem związku oraz z gramicydyną i rozpuszczalnikiem.

5. Analiza danych

1. Przenieś wyniki na komputer analityczny. Wczytaj wszystkie dane do programu MATLAB w celu analizy. Dla każdej próbki wczytaj wszystkie powtórzenia z buforem i wygaszaczem, z wyłączeniem czterech pierwszych w każdym przypadku, ponieważ zawierają one artefakty mieszania. Przy objętości napędu 120 μL potrzeba nieco mniej niż czterech cykli, aby całkowicie usunąć poprzednią mieszaninę z drenu stop-flow.
2. Powtórzenia z buforem dla wszystkich próbek powinny być bardzo podobne. Jeśli występuje znaczne przesunięcie sygnału fluorescencji, które zależy od stężenia związku, może to oznaczać, że sam związek jest fluorescencyjny i konieczne może być uprzednie odjęcie tego dodatkowego sygnału fluorescencji przed normalizacją próbek.
3. Przejrzyj ręcznie zapisy i usuń „wadliwe” powtórzenia: powtórzenia zawierające piki lub odchylenia od wieloexponentialności wynikające z artefaktów mieszania i/lub pęcherzyków powietrza.
4. Znormalizuj powtórzenia z wygaszaczem do średniej wartości początkowej powtórzeń z buforem dla każdej próbki. Połącz średnie wszystkich próbek na jednym wykresie w celu wizualizacji.
5. Zapisy zarejestrowane bez gramicydyny powinny być podobne i wykazywać niemal całkowity brak wygaszania fluorescencji; może wystąpić powolny spadek sygnału fluorescencji z powodu powolnego wycieku Tl⁺ przez dwuwarstwę pęcherzyków 8. Jeśli próbka bez gramicydyny i bez modyfikatora wykazuje znaczne wygaszanie, oznacza to, że pęcherzyki uległy degradacji i nie powinny być dalej używane. Jeśli próbki bez gramicydyny, ale z modyfikatorem, wykazują znaczne wygaszanie, oznacza to, że modyfikator zaburza dwuwarstwę pęcherzyków do tego stopnia, że umożliwia przenikanie fluoroforu lub wygaszacza przez dwuwarstwę.
6. Jeśli związek zmienia właściwości dwuwarstwy lipidowej, co jest wykrywane przez kanały gramicydyny, przebieg czasowy fluorescencji ulegnie widocznej zmianie.
7. Dla każdej próbki do pierwszych 2-100 ms znormalizowanej krzywej wygaszania fluorescencji z poszczególnych powtórzeń dopasowuje się funkcję wykładniczą rozciągniętą ( np. ⁴), a szybkość ⁴ jest obliczana dla czasu 2 ms. Średnie i odchylenia standardowe dla danej próbki oblicza się ze wszystkich poszczególnych powtórzeń.
8. Na koniec określ względną zmianę szybkości wygaszania poprzez normalizację do najbliższej w czasie próbki kontrolnej zawierającej gramicydynę i pozbawionej modyfikatora.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Podstawy testu opartego na gaszeniu fluorescencji do wykrywania zmian we właściwościach lipidowej dwuwarstwy. Górny lewy róg: Powiększenie pojedynczego pęcherzyka lipidowego z ANTS oraz NaNO₃ wewnątrz i NaNO₃ oraz TlNO₃ na zewnątrz. Górny prawy róg: Sygnał fluorescencji zarejestrowany przy użyciu (od góry do dołu) pęcherzyków wypełnionych ANTS bez środka gaszącego, ze środkiem gaszącym, oraz ze środkiem gaszącym i uprzednio domieszkowanych gramicydyną w stężeniach 87, 260 i 780 nM. Dół: Schematyczne przedstawienie komory mieszania w układzie stopped-flow.

Rycina 2: Zrzut ekranu z oprogramowania Pro-Data SX ilustrujący poszczególne panele wspomniane w opisie konfiguracji eksperymentalnej.

Rycina 3: Wielokrotne pomiary powtórzone sygnału fluorescencji z LUV obciążonych ANTS w buforze Na. Pierwsze cztery powtórzenia są zawsze wykluczane, ponieważ zawierają artefakty mieszania. Przewody łączące strzykawki z próbkami z celą mieszającą mają określoną objętość, w związku z czym pierwsze kilka powtórzeń odzwierciedla zawartość poprzednią: w powtórzeniach 1 i 2 jest to woda, w powtórzeniu 3 mieszanina wody i próbki, w powtórzeniu 4 głównie próbka, a w pozostałych powtórzeniach wyłącznie próbka.

Rycina 4: Wielokrotne pomiary sygnału fluorescencji z LUV obciążonych ANTS w buforze Na oraz z Tl-gasicielem. Z obu serii pomiarów usunięto cztery pierwsze powtórzenia. Dodatkowo, w przypadku pomiarów z Tl-gasicielem, powtórzenie 8 musi zostać usunięte z powodu artefaktów, najprawdopodobniej pęcherzyków powietrza.

Rycina 5: Wpływ kapsaicyny (Cap) na przebieg czasowy wygaszania fluorescencji ANTS. (A) Znormalizowany sygnał fluorescencji w czasie 1 s, szare kropki oznaczają wyniki ze wszystkich powtórzeń (n > 5 na warunek); czerwone linie oznaczają średnią ze wszystkich powtórzeń. (B) Pierwsze 100 ms, szare kropki oznaczają wyniki z pojedynczego powtórzenia dla każdego warunku; czerwone linie to dopasowania funkcją wykładniczą rozciągniętą (2–100 ms) do tych powtórzeń. Przerywana niebieska linia oznacza znacznik 2 ms, czyli czas, w którym określana jest szybkość wygaszania. Zarówno w A, jak i B górny ślad pokazuje wyniki w obecności Tl⁺; dwa kolejne ślady pokazują wyniki w obecności gA, z Tl⁺ ± Cap; cztery dolne ślady pokazują wyniki z 260 nM gA i Tl⁺, gdzie liczby oznaczają [Cap] w μM. Szybkości wygaszania dla 0, 10, 30 i 90 μM Cap, określone na podstawie szybkości funkcji wykładniczej rozciągniętej, wynoszą odpowiednio 36±6, 69±6, 85±8 i 247±27 (średnia ± s.d., n > 8).

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy szybki test oparty na fluorescencji do określania potencjału modyfikującego dwuwarstwę przez leki i inne małe amfifile. Związki modyfikujące właściwości dwuwarstwy mogą zmieniać funkcję białek błonowych w sposób pośredni i nieswoisty, co prawdopodobnie przyczynia się do efektów leków typu „off-target”. Test wykorzystuje właściwości kanałów gramicydynowych jako sond zmian we właściwościach dwuwarstwy ¹², które są wykrywane przez białka przechodzące przez dwuwarstwę. Wyniki uzyskane za pomocą t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicydyna	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucylo-sn-glycero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
zestaw do mini-ekstruzji	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
kolumna odsalająca PD-10	Sigma-Aldrich	54805