Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Centralnym motywem biologii rozwoju jest dywersyfikacja linii komórkowych oraz wyjaśnienie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wiąże się to z dokładną analizą losów pojedynczych komórek w warunkach prawidłowych i eksperymentalnych. W tym celu niezbędne są metody transfekcji ukierunkowane na pojedyncze komórki progenitorowe. Opisujemy tutaj technicznie prostą metodę transfekcji pojedynczych komórek w tkankach kurczaka in-ovo, która umożliwia wiarygodne śledzenie linii komórkowych oraz manipulacje genetyczne. Celowane są konkretne domeny tkankowe w obrębie somitu lub cewy nerwowej, a DNA jest wstrzykiwane bezpośrednio do interesującego nas nabłonka, co skutkuje sporadyczną transfekcją pojedynczych komórek. Dzięki zastosowaniu genów reporterowych można w konsekwencji śledzić populacje klonalne do trzech dni, a zachowanie genetycznie zmodyfikowanych populacji klonalnych można porównać z grupami kontrolnymi. Metoda ta wykorzystuje dostępność zarodka kury oraz rozwijające się narzędzia do manipulacji genetycznych. Porównujemy i omawiamy jej zalety w stosunku do powszechnie stosowanej metody elektroporacji, a także sugerujemy możliwe zastosowania i użycie w dodatkowych modelach in-vivo. Rekomendujemy stosowanie tej metody jako istotnego uzupełnienia dla istniejących narzędzi do śledzenia linii komórkowych i interferencji genetycznej.
Protokół
1. Przygotowanie mikropipet
Wytwarzamy pipety za pomocą standardowej wyciągarki do pipet Narishige pp-83 przy ustawieniu temperatury na 13,5. Precyzyjne ustawienie musi zostać skalibrowane tak, aby średnica końcówki pipety wynosiła od 8 do 10 mikronów. Stosujemy borokrzemianowe rurki szklane z włóknem o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,75-0,78 mm. Pipety są następnie przechowywane w plastikowym naczyniu, w taki sposób, aby końcówki były chronione przed kontaktem z krawędziami naczynia.
2. Przygotowanie DNA
Plazmidy zainteresowania są transfekowane do DH5α E. coli zgodnie ze standardowymi procedurami. Hodowle nocne z pojedynczych kolonii są wykorzystywane do oczyszczania plazmidów przy użyciu zestawów do maxi-prep (można zastosować dowolny komercyjny zestaw). W przypadku wstrzyknięć nieklonalnych stosujemy stężenie plazmidu 1,0 μg/ μL. Wyższe stężenia zwiększają ryzyko zapychania końcówek pipet. W zastosowaniach klonalnych stężenia plazmidów są znacznie niższe i muszą zostać odpowiednio dostosowane (patrz poniżej). Dla pCAGG-GFP optymalne stężenie pozwalające na uzyskanie wyników klonalnych wyniosło około 0,05-0,1 μg/ μL. W jednym eksperymencie zazwyczaj zużywa się od 1 do 2 μL plazmidu, a przed rozpoczęciem procedury do plazmidu dodaje się minimalną ilość proszku fast-green (przylegającego do końcówki suchej, ostrej pipety szklanej). Następnie plazmid jest wirowany w wirówce stołowej przez 2 minuty z maksymalną prędkością. Ta procedura wydaje się ograniczać problemy z zapychaniem pipet.
3. Iniekcja embrionów
3.1 Przygotowanie embrionów
Do iniekcji wykorzystujemy jaja przepiórcze oraz kurze. Jaja są inkubowane w pozycji leżącej wzdłuż ich długiej osi aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Jaja przecieramy 70% etanolem i pozostawiamy do wyschnięcia. Zaostrzony koniec jaja przebija się nożyczkami chirurgicznymi (jest to konieczne tylko w przypadku jaj kurzych), a następnie z jaja pobiera się za pomocą strzykawki 10 mL (igła 19G) 1 mL (u przepiórek) lub 2 mL (u kur) białka jaja. Otwory są następnie uszczelniane gorącą parafiną.
Przed właściwym wstrzyknięciem, za pomocą nożyczek chirurgicznych, w górnej części skorupy jaja otwiera się okienko. Przyklejenie taśmy klejącej do skorupy i przecięcie jej przez taśmę może pomóc w ograniczeniu powstawania odłamków skorupy. Do jaja natychmiast pipetuje się bufor PBS zawierający antybiotyki. Aby uzyskać dostęp do zarodka, błony witelinowe i/lub owodni przecina się i odsuwa za pomocą szpilek entomologicznych 0,14 mm zamocowanych w uchwycie do igieł. Pod blastodermę wstrzykuje się nietoksyczny atrament (Pelican #17), aby ułatwić wizualizację zarodka, używając kapilary wyciąganej nad ogniem zamocowanej w aspiratorze.
3.2 Napełnianie i montaż mikropipet
Mikropipety do zaciągania można napełnić plazmidem za pomocą kapilar wyciąganych termicznie o odpowiedniej średnicy, zamontowanych na aspiratorze. Minimalną ilość plazmidu pobiera się za pomocą kapilary i wprowadza do pipety przez otwór znajdujący się naprzeciwko zaostrzonego końcówki, zbliżając się wewnątrz jak najbliżej czubka. Następnie pipetę montuje się w manualnym iniektorze ciśnieniowym osadzonym na mikromanipulatorze. W razie potrzeby przykłada się minimalne ciśnienie, aby umożliwić roztworowi plazmidu dotarcie do końcówki pipety.
3.3 Iniekcja plazmidu
Pipetę wprowadza się do medium ciekłego jaja, stosując niewielki nadciśnienie powietrza, aby zapobiec zapchaniu końcówki pipety. Następnie przebija się odpowiednią domenę tkankową. Zmiana ciśnienia w momencie wnikania końcówki w tkankę często wystarcza do uwolnienia plazmidu z widocznym barwnikiem fast green. Jeśli tak się nie stanie, należy lekko nacisnąć strzykawkę, aż do momentu wtryśnięcia plazmidu/fast green. Proces ten można powtórzyć wzdłuż osi zarodka, na przykład w sąsiednich somytach lub wzdłuż całego cewy nerwowej. Po wykonaniu wstrzyknięć można dodać PBS. Okno zostaje uszczelnione za pomocą taśmy klejącej (nie zaleca się stosowania paraf filmu, zwłaszcza w przypadku jaj przepiórczych – zwiększa on śmiertelność zarodków, prawdopodobnie poprzez blokowanie wymiany tlenu przez skorupę). Potraktowane zarodki przenosi się z powrotem do inkubatora. Należy unikać wentylacji i umieścić w inkubatorze małe pojemniki z wodą, ponieważ pomagają one utrzymać wilgotność i zwiększają przeżywalność.
4. Dostosowanie parametrów wstrzyknięcia i monitorowanie wskaźników sukcesu
Ocena i kalibracja różnych parametrów iniekcji ma kluczowe znaczenie dla zastosowań ukierunkowanych na analizę pojedynczych komórek. Nie każde zdarzenie iniekcyjne doprowadzi do pomyślnego znakowania pojedynczej komórki. Zbyt wysokie stężenie plazmidu może prowadzić do znakowania nieklonalnego, podczas gdy stężenia bardzo niskie skutkują wysokim odsetkiem niepowodzeń. Stężenie wstrzykiwanego plazmidu musi zostać zoptymalizowane pod kątem iniekcji klonalnych. Zalecamy rozcieńczanie całego oczyszczonego zapasu plazmidu zamiast rozcieńczania poszczególnych preparatów do ustalonego stężenia. To drugie podejście może wprowadzić pewną zmienność w odsetku sukcesów, co prawdopodobnie wynika z różnic w czystości i innych parametrów, takich jak proporcja plazmidu superzwiniętego.
4.1 Ocena wskaźników sukcesu poprzez obserwację całego preparatu
Wstępna ocena wstrzykniętych embrionów może być przeprowadzona poprzez obserwację całego preparatu pod binokularem fluorescencyjnym. Od sześciu do ośmiu godzin po wstrzyknięciu jest wystarczającym czasem, aby ocenić skuteczność przy użyciu konstruktu pCAGG-enhanced GFP. Warunkiem jest, aby miejsce docelowe znajdowało się wystarczająco powierzchownie, by było łatwo widoczne (np. grzbietowy somyt, grzbietowa część cewy nerwowej, ektoderma itd., patrz Rycina 1A-C.). Krok ten jest szczególnie pomocny przy ocenie serii eksperymentalnych wykazujących albo zbyt wiele znakowanych komórek, albo przeciwnie, całkowity brak komórek fluorescencyjnych. Jeśli planowana jest dalsza inkubacja, po oględzinach do jaja należy dodać roztwór PBS z antybiotykami, a taśmę uszczelniającą należy wymienić.
4.2 Ocena klonalności poprzez analizę seryjnych przekrojów
Najlepszą metodą oceny skuteczności wstrzyknięć jest seryjne cięcie wstrzykniętych embrionów i zastosowanie immunohistochemii w celu wizualizacji znakowanych komórek. W tych warunkach czas inkubacji może być tak krótki, jak 4 godziny po wstrzyknięciu. Embriony są utrwalane i przygotowywane do cięcia w parafinie (lub kriosekcji). Następnie sekcje zamontowane na szkiełkach są odparafinowane i barwione immunochemicznie w celu wizualizacji reportera. Wskazane może być zastosowanie metod amplifikacji, takich jak biotyna-streptawidyna. Na koniec wykonuje się skanowanie sekcji seryjnych w celu wykrycia znakowanych komórek wstrzykniętych segmentach. Jeśli w pierwszych próbach uzyskano wiele komórek zamiast pojedynczych, należy rozcieńczyć roztwór plazmidu i powtórzyć proces aż do uzyskania odpowiednich wyników. W przypadku zbyt wysokiej skuteczności może być konieczne zastosowanie rozcieńczeń roztworu plazmidu od 2- do 10-krotnych.
Dla każdego plazmidu do transfekcji należy powtórzyć dokładną kalibrację zapewniającą klonalność.
5. Reprezentatywne wyniki
Zazwyczaj wykonujemy pojedynczą injekcję pCAGG-GFP na jeden somity, celując w 6-12 segmentów na jeden embrion 1 2. W takich warunkach wyraźny sygnał można wykryć podczas obserwacji całego preparatu (whole mount) 8 godzin po injekcji, w co najmniej jednym segmencie u jednego z dziesięciu embrionów. W tych warunkach potwierdzono ponadto, że znakowanie ma charakter klonalny (Rycina 1B,C). Przy zastosowaniu wysokich stężeń DNA u większości embrionów może wystąpić co najmniej jedna udana injekcja, co zwiększa prawdopodobieństwo transfekcji wielu komórek.
Analiza seryjnych przekrojów wykazała, że transfekcje klonalne osiągnięto przy skuteczności na poziomie około 10%. Oznacza to, że w celu uzyskania klonalności technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach stwierdzono, że ponad 93% zdarzeń pozytywnego znakowania miało charakter klonalny 1.
Rysunek 1. Klonalne iniekcje pCAGGS-GFP do progenitorów neuronalnych i szkieletowych. (A-C) Przekroje poprzeczne ukazujące znakowanie grzbietowej części rurki nerwowej (NT) (A), brzuszzobocznego obszaru dermomiotomu (DM) (B) lub centralnego arkusza DM (C), 6 godzin po mikroiniekcji pCAGGS-GFP do pojedynczej komórki progenitorowej. (D) Dwa dni po klonalnej transfekcji centralnego DM, pojedyncze komórki progenitorowe wytworzyły pochodne zarówno w skórze właściwej (D), jak i w mięśniach (M) (patrz ref.1 po szczegóły).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana powyżej metoda jest modyfikacją wcześniej przedstawionej techniki dostarczania barwników lipofilnych do małych podzbiorów komórek lub pojedynczych komórek progenitorowych 3. Posiada ona trzy główne zalety w porównaniu ze standardową techniką elektroporacji. Po pierwsze, umożliwia ona pewne znakowanie dyskretnych obszarów w tkankach docelowych, co pozwala na znacznie większą rozdzielczość przestrzenną niż w przypadku elektroporacji (patrz np. Rysunek 1B,C). Po drugie, pozwala na znakowanie pojedynczych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Shlomi Krispin za obraz cewy nerwowej. W szczególności dziękujemy Yuval Cinnamon za wprowadzenie techniki transfekcji GFP. Praca ta była wspierana przez granty z Israel Science Foundation, Association Francaise contre les Myopathies oraz Deutche Forschungsgemeinshaft, Collaborative Research Centre 488 dla C.K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do pipetowania | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Kapilary | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Igły entomologiczne | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Roztwór Pen-Strep | Biological Industries | 03-031-1B |
Bibliografia
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
