Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach piskląt

Podsumowanie

Za pomocą mikropipet z cienką końcówką wstrzykujemy plazmidowe DNA do subdomen kurzych somitów lub cew neuronowych. Stężenie plazmidu jest dostosowywane do generowania pojedynczych transfekowanych komórek. Następnie pozwalamy komórkom rozwinąć się w populacje klonalne.

Streszczenie

Głównym tematem w biologii rozwojowej jest zróżnicowanie linii rodowych i wyjaśnienie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wiąże się to z wnikliwą analizą losów pojedynczych komórek w warunkach normalnych i eksperymentalnych. W tym celu warunkiem wstępnym są metody transfekcji, które są ukierunkowane na pojedynczych przodków. Opisujemy tutaj technicznie prostą metodę transfekcji pojedynczych komórek w tkankach kurczaka in-ovo, umożliwiającą niezawodne śledzenie linii, a także manipulację genetyczną. Określone domeny tkankowe są celowane w somitach lub cewie nerwowej, a DNA jest wstrzykiwane bezpośrednio do nabłonka będącego przedmiotem zainteresowania, co powoduje sporadyczną transfekcję pojedynczych komórek. Korzystając z reporterów, populacje klonów mogą być śledzone przez okres do trzech dni, a zachowanie genetycznie zmanipulowanych populacji klonów może być porównane z zachowaniem grupy kontrolnej. Metoda ta wykorzystuje dostępność zarodka pisklęcia wraz z pojawiającymi się narzędziami do manipulacji genetycznej. Porównujemy i omawiamy jej zalety w porównaniu z powszechnie stosowaną metodą elektroporacji, a także sugerujemy możliwe zastosowania i zastosowanie w dodatkowych modelach in vivo. Opowiadamy się za stosowaniem tej metody jako znaczącego uzupełnienia i uzupełnienia istniejących narzędzi do śledzenia linii rodowych i interferencji genetycznej.

Protokół

1. Przygotowanie mikropipet

Wyciągamy nasze pipety na standardowym ściągaczu do pipet Narishige pp-83 o ustawieniu grzania 13,5. Precyzyjne ustawienie musi być skalibrowane, dążąc do średnicy końcówki pipety od 8 do 10 mikronów. Stosujemy rurki ze szkła borokrzemianowego zawierające filament o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,75-0,78 mm. W związku z tym pipety są przechowywane w plastikowym naczyniu, którego końcówki są zabezpieczone przed kontaktem z krawędziami naczynia.

2. Przygotowanie DNA

Plazmid, który nas interesuje, jest transfekowany do DH5α E. coli przy użyciu standardowych procedur. Nocne kultury z pojedynczych kolonii są używane do oczyszczania plazmidu za pomocą zestawów maxi-prep (każdy komercyjny zestaw powinien wystarczyć). Do iniekcji nieklonalnych używamy stężenia plazmidu 1,0 μg/μl. Wyższe stężenia zwiększają zatykanie końcówek pipet. W przypadku zastosowań klonalnych stężenia plazmidów są znacznie niższe i muszą być dostosowane (patrz poniżej). W przypadku pCAGG-GFP stwierdzono, że optymalne stężenie dające wyniki klonalne wynosi około 0,05-0,1 μg/μL. Zwykle stosuje się od jednego do 2 μl plazmidu na eksperyment, a minimalną ilość szybko zielonego proszku (przylegającego do końcówki suchej, ostrej szklanej pipety) dodaje się do plazmidu przed rozpoczęciem eksperymentu. Plazmid jest następnie odwirowywany w wirówce stołowej przez 2 minuty z maksymalną prędkością. Wydaje się, że ta procedura zmniejsza problemy z zapychaniem się pipet.

3. Wstrzykiwanie zarodków

3.1 Przygotowanie zarodków

Do wstrzykiwań używamy zarówno jaj przepiórczych, jak i kurzych. Jaja wysiaduje się w pozycji leżącej na długiej osi do pożądanego etapu rozwojowego. Jaja są przecierane 70% etanolem i pozostawiane do wyschnięcia. Spiczasty koniec jaja przekłuwa się nożyczkami chirurgicznymi (jest to konieczne tylko w przypadku jaj kurzych) i za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml (igła 19G) pobiera się z jaja 1 ml (igła 19G) białka. Otwory są następnie uszczelniane gorącą parafiną.

Przed faktycznym wstrzyknięciem, za pomocą nożyczek chirurgicznych otwiera się okienko w górnej części skorupki jajka. Umieszczenie taśmy klejącej na skorupie i przecięcie jej może pomóc w zmniejszeniu ilości zanieczyszczeń z skorupy. Bufor PBS zawierający antybiotyki jest natychmiast pipetowany do komórki jajowej. Aby uzyskać dostęp do zarodka, błony witelowe i/lub owodniowe są cięte i kierowane za pomocą szpilek przeciw owadom o średnicy 0,14 mm zamontowanych na uchwycie igły. Nietoksyczny tusz (Pelikan #17) jest wstrzykiwany pod blastodermę, aby pomóc w wizualizacji zarodka, za pomocą ciągniętej przez ogień kapilary zamontowanej na aspiratorze.

3.2 Ładowanie i montaż mikropipet

Mikropipety ściągacza mogą być ładowane plazmidem za pomocą ciągniętych ogniem kapilar o odpowiedniej średnicy, zamontowanych na aspiratorze. Minimalna ilość plazmidu jest pobierana za pomocą kapilary i ładowana do pipety od jej otworu przeciwnego do zaostrzonej końcówki i zbliżając się do końcówki od wewnątrz tak bardzo, jak to możliwe. Pipeta jest następnie ładowana do ręcznego wtryskiwacza ciśnienia powietrza zamontowanego na mikromanipulatorze. W razie potrzeby stosuje się minimalny nacisk, aby roztwór plazmidu mógł dotrzeć do końcówki pipety.

3.3 Wstrzyknięcie plazmidu

Pipeta jest manipulowana do płynnego medium jajka, jednocześnie stosując pewne ciśnienie powietrza, aby zapobiec zatkaniu końcówki pipety. Odpowiednia domena tkankowa jest przekłuwana. Zmiana ciśnienia, gdy końcówka wchodzi w tkankę, często wystarcza do uwolnienia plazmidu z widoczną szybką zielenią. Jeśli tak nie jest, należy lekko docisnąć strzykawkę, aż plazmid/fast green zostanie wyrzucony. Proces ten można powtarzać wzdłuż osi zarodka, na przykład w sąsiednich somitach lub wzdłuż zasięgu cewy nerwowej. Po wstrzyknięciu można dodać PBS. Okienko jest uszczelnione za pomocą taśmy klejącej (parafilm nie jest pożądany, szczególnie w przypadku jaj przepiórczych - zwiększa śmiertelność zarodków, prawdopodobnie poprzez blokowanie wymiany tlenu przez skorupkę). Poddane leczeniu zarodki są zwracane do inkubatora. Unikaj wentylacji i umieszczaj w inkubatorze małe pojemniki z wodą, ponieważ pomagają one utrzymać wilgoć i zwiększyć plony.

4. Dostosowywanie parametrów wtrysku i monitorowanie wskaźników sukcesu

Ocena i kalibracja różnych parametrów wtrysku jest kluczowa dla aplikacji przeznaczonych do analizy pojedynczych komórek. Nie każde wstrzyknięcie doprowadzi do pomyślnego oznakowania pojedynczej komórki. Zbyt wysokie stężenie plazmidu może prowadzić do znakowania nieklonalnego, podczas gdy bardzo niskie stężenia skutkują wysokimi wskaźnikami niepowodzeń. Stężenie wstrzykniętego plazmidu musi być zoptymalizowane pod kątem wstrzyknięć klonalnych. Zalecamy rozcieńczenie całego oczyszczonego zapasu plazmidowego zamiast rozcieńczania poszczególnych preparatów do wcześniej określonego stężenia. To ostatnie może wprowadzać pewną wariancję wskaźników sukcesu, prawdopodobnie ze względu na różnice w czystości i innych parametrach, takich jak proporcja superskręconego plazmidu.

4.1 Ocena wskaźników sukcesu na podstawie obserwacji całego wierzchowca

Wstępna ocena wstrzykniętych zarodków może być przeprowadzona przez obserwację całościową pod fluorescencyjną lornetką. Sześć do ośmiu godzin po wstrzyknięciu wystarczy, aby ocenić wskaźniki sukcesu przy użyciu konstruktu GFP wzmocnionego pCAGG. Jest to pod warunkiem, że miejsce docelowe jest na tyle powierzchowne, że jest łatwo widoczne (np. somit grzbietowy, grzbietowa cewa nerwowa, ektoderma itp., patrz rysunek 1A-C). Ten krok jest szczególnie pomocny przy ocenie serii eksperymentalnych wykazujących albo zbyt wiele znakowanych komórek, albo alternatywnie, brak komórek fluorescencyjnych. Jeśli pożądana jest dalsza inkubacja, po obejrzeniu jaja należy dodać do jaja roztwór PBS zawierający antybiotyki i wymienić taśmę uszczelniającą.

4.2 Ocena klonalności za pomocą analizy przekroju szeregowego

Najlepszym sposobem oceny wskaźników udanych wstrzyknięć jest seryjne cięcie wstrzykniętych zarodków i użycie immunohistochemii do wizualizacji oznaczonych komórek. W tych warunkach czas inkubacji może wynosić nawet 4 godziny po wstrzyknięciu. Zarodki są utrwalane i przetwarzane do sekcji parafinowej (lub kriosekcji). Szklane sekcje są następnie odparafinowane i barwione immunologicznie w celu wizualizacji reporterowej. Pożądane mogą być metody amplifikacji, takie jak biotyna-streptawidyna. Na koniec sekcje szeregowe są skanowane w celu wykrycia oznakowanych komórek w wstrzykniętych segmentach. Jeżeli po wstępnych próbach otrzyma się więcej niż pojedyncze komórki, zapas plazmidu musi zostać rozcieńczony i proces powtarzany, aż do osiągnięcia odpowiednich wyników. W przypadku zbyt wysokich wskaźników powodzenia może być konieczne dwukrotne do 10-krotnego rozcieńczenia roztworu podstawowego plazmidu.

Dla każdego plazmidu, który ma być transfekowany, powinna być powtórzona dokładna kalibracja, która zapewnia klonalność.

5. Reprezentatywne wyniki

Zazwyczaj przeprowadzamy pojedyncze wstrzyknięcie pCAGG-GFP na somit, celując w 6-12 segmentów na zarodek ^{1 2}. Przy takim ustawieniu wyraźny sygnał może być wykryty przez obserwację całego wierzchowca 8 godzin po wstrzyknięciu, w co najmniej jednym segmencie jednego zarodka na dziesięć. W tych warunkach potwierdzono ponadto, że znakowanie jest klonalne (ryc. 1B,C). W przypadku stosowania wysokich stężeń DNA, większość zarodków może wykazywać co najmniej jedno udane wstrzyknięcie, co zwiększa prawdopodobieństwo, że wiele komórek zostało przetransfekowanych.

Analiza sekcji seryjnej wykazała, że transfekcje klonalne były osiągane, gdy wskaźnik sukcesu wynosił około 10%. Oznacza to, że aby osiągnąć klonalność, technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach, ponad 93% pozytywnych zdarzeń znakowania okazało się klonalnymi ¹.

Rysunek 1. Klonalne wstrzyknięcia pCAGGS-GFP do neuronalnych i szkieletowych komórek progenitorowych. (A-C) Przekroje poprzeczne pokazujące znakowanie grzbietowej cewy nerwowej (NT) (A), domeny brzuszno-bocznej dermomyotomu (DM) (B) lub centralnego arkusza DM (C), 6 godzin po mikrowstrzyknięciu pCAGGS-GFP do pojedynczego przodka. (D) Dwa dni po transfekcji klonalnej centralnego DM, pojedyncze przodki wytworzyły pochodne zarówno w skórze właściwej (D), jak i mięśniach (M) (patrz odnośnik ¹ w celu uzyskania szczegółów).

Dyskusja

Opisana powyżej metoda jest modyfikacją wcześniej opisanej techniki dostarczania barwników lipofilowych do podzbiorów małych komórek lub pojedynczych komórek progenitorowych ³. Ma trzy główne zalety w porównaniu ze standardową techniką elektroporacji. Po pierwsze, zapewnia sposób do pewnego znakowania dyskretnych miejsc w tkankach docelowych, co pozwala na znacznie większą rozdzielczość przestrzenną niż elektroporacja (patrz na przykład rysunek 1B, C). Po drugie, umożliwia znakowanie pojedynczych komórek, umoż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki do pipet	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Kapilary	Drummond Scientific	2-000-100
Igły do owadów	Watkins Doncaster	E6871
Roztwór Pen-Strep	Przemysł biologiczny	03-031-1B