Ekspresja, solubilizacja w detergencie i oczyszczanie transportera błonowego – białka oporności wielolekowej MexB

Podsumowanie

W niniejszym protokole przedstawiamy ekspresję, solubilizację i oczyszczanie rekombinowanego białka błonowego MexB w formie rozpuszczalnego kompleksu białko-detergent. MexB jest błonowym transporterem oporności wielolekowej pochodzącym z oportunistycznego patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

Wielolekowość (MDR), czyli zdolność komórki nowotworowej lub patogenu do wykazywania oporności na szeroki zakres strukturalnie i funkcjonalnie niezwiązanych ze sobą leków przeciwnowotworowych lub antybiotyków, stanowi obecnie poważny problem zdrowia publicznego. Ta wielolekowość wynika w dużej mierze z obecności zależnych od energii pomp usuwających leki. Pompy te wypompowują leki przeciwnowotworowe lub antybiotyki do środowiska zewnętrznego, obniżając ich stężenie wewnątrzkomórkowe poniżej progu toksyczności. Badamy wielolekowość u Pseudomonas aeruginosa, oportunistycznego patogenu bakteryjnego wywołującego infekcje u pacjentów z wieloma rodzajami urazów lub chorób, np. oparzeniami lub mukowiscydozą, a także u pacjentów z nowotworami, poddawanych dializie lub transplantacji, u których występuje obniżona odporność. Głównymi pompami MDR u P. aeruginosa są kompleksy trójskładnikowe, w skład których wchodzi antyporter proton-lek błony wewnętrznej (RND), kanał błony zewnętrznej (OMF) oraz periplazmatyczne białko łączące (MFP) ^1-8. Białka RND i OMF są białkami transbłonowymi. Białka transbłonowe stanowią ponad 30% wszystkich białek i odpowiadają za 65% obecnych celów terapeutycznych dla leków. Hydrofobowe domeny transbłonowe sprawiają, że białka te są nierozpuszczalne w buforze wodnym. Przed oczyszczeniem białka transbłonowego konieczne jest znalezienie warunków buforowych z dodatkiem łagodnego detergentu, które umożliwią solubilizację białka w formie kompleksu białko-detergent (PDC) ^9-11. W tym przykładzie wykorzystujemy białko RND, transbłonowy transporter MexB z P. aeruginosa, aby zademonstrować sposób ekspresji rekombinacyjnej formy białka transbłonowego, jego solubilizację przy użyciu detergentów, a następnie oczyszczanie kompleksów białko-detergent. Tę ogólną metodę można zastosować do ekspresji, oczyszczania i solubilizacji wielu innych rekombinacyjnie wyrażanych białek błonowych. Kompleksy białko-detergent mogą być później wykorzystane do charakterystyki biochemicznej lub biofizycznej, w tym do wyznaczenia struktury krystalicznej metodą krystalografii rentgenowskiej lub do badań sieciowania.

Protokół

1. Dzień 1:

MexB z Pseudomonas aeruginosa jest kodowany przez pFB101. Gen MexB został namnożony z genomowego DNA P. aeruginosa i wstawiony w miejsca restrykcyjne NdeI i XhoI wektora pET30b+. Konstrukt zawiera C-końcowy znacznik heksahistydynowy.

1. Plazmid jest wykorzystywany do transformacji szczepu E. coli C43(DE3) ¹², a transformanty są wysiewane na agar LB zawierający 30 ug/mL kanamycyny.

2. Dzień 2: Hodowle nocne:

2. Wieczorem 4 kultury LB o objętości 3 mL każda, zawierające 30 ug/mL kanamycyny, są szczepione z świeżych kolonii transformantów. Alternatywnie kultury można zaszczepić z zamrożonego preparatu permanentnego.
   Te małe kultury są hodowane na walcarku w temperaturze 37°C przez noc.

3. Dzień 3: Hodowla kultur o objętości 6 litrów:

3. Rano wykorzystaj kultury nocne do inokulacji 150 mL LB zawierającego 30 ug/mL kanamycyny. Hoduj kulturę w temperaturze 37° C na inkubatorze z wytrząsaniem.
4. Po południu wykorzystaj małą kulturę do inokulacji 6 x 1L pożywki 2XYT zawierającej 30 ug/mL kanamycyny w kolbach Fernbacha. (Użyj 25 mL na kulturę, aby uzyskać rozcieńczenie 1:40). Hoduj kultury w temperaturze 37°C do momentu osiągnięcia OD₆₀₀ na poziomie 0,4-0,6, co zajmuje około 1,5 godziny.
5. Gdy kultury osiągną odpowiednią gęstość, indukuj ekspresję białka poprzez dodanie 0,5 mL 1M IPTG. Umieść wszystkie kolby z powrotem w inkubatorze i kontynuuj ich hodowlę w temperaturze 30°C przez noc.

4. Dzień 4: Zbieranie komórek i oczyszczanie białka:

6. Do roztworów buforowych dodać inhibitory proteaz, DNazę oraz lizozym w następujący sposób: do 50 mL buforu do resuspensji komórek dodać 10 mg DNaseI (stężenie końcowe 0,1 mg/mL), 1 tabletkę inhibitora proteaz Complete EDTA-free oraz szczyptę lizozymu. Do 60 mL buforu do resuspensji błon dodać 1 tabletkę inhibitora proteaz. Do kolejnych 50 mL buforu do resuspensji błon dodać 1 tabletkę inhibitora proteaz. Wszystkie trzy roztwory przechowywać w lodzie.
7. Kultury wirować przez 30 min przy 5,000 rpm w wirówce dużej pojemności w celu zebrania komórek.
8. Komórki resuspender w 100 mL buforu do resuspensji komórek (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 tabletka inhibitora proteaz Complete EDTA-free, 0,1 mg/mL DNAse I, szczypta lizozymu).
9. Zawiesinę komórkową przepuścić dwukrotnie przez prasę francuską (French pressure cell) przy ciśnieniu 12,000 psi (ciśnienie manometryczne 762). Lizat komórkowy zebrać do butelki utrzymywanej w niskiej temperaturze na lodzie.
10. Lizat komórkowy przenieść do probówek wirówkowych SS34 i wirować w celu usunięcia szczątków komórkowych przez 30 min przy 10,000 rpm w temperaturze 4°C przy użyciu rotora SS-34.
11. Ostrożnie przenieść nadsącz do probówek ultrawirówkowych Ti647.5. Wirować przez 50 min przy 40,000 rpm w temperaturze 4°C. Odrzucić nadsącz.
12. Osad zawierający błony komórkowe resuspender w ok. 25 mL buforu do resuspensji błon (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 1 tabletka inhibitora proteaz Complete EDTA-free).
13. Zawiesinę błon przenieść do czystej probówki wirówkowej i wirować przy 40,000 rpm w rotorze Ti647.5 przez 50 min w temperaturze 4 °C.
14. Odrzucić nadsącz i resuspender przemyty osad błon w 25 mL buforu do resuspensji błon (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 1 tabletka inhibitora proteaz Complete EDTA-free).

5. Solubilizacja białka TM:

15. Do resuspendowanych błon (około 25 mL) dodać 6 mL 10% DDM (końcowe stężenie detergentu = 2% DDM). Mieszaninę inkubować w ruchu kołyszącym w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
16. Mieszaninę wirować przy 40 000 rpm przez 40 min w temperaturze 4 °C w rotorze Ti647.5, aby oddzielić rozpuszczalne kompleksy białkowo-detergentowe od białek nierozpuszczalnych. Zebrać nadsącz zawierający kompleksy białka MexB z detergentem.

6. IMAC:

17. Zmieszać supernatant otrzymany po wirowaniu z dużą prędkością z koralikami powinowactwa do metali Talon równoważonymi w buforze do resuspensji. Inkubować przez 1 hr na wirówce rolkowej w temperaturze 4°C.
18. Przesypać zawiesinę do korpusu kolumny do filtracji grawitacyjnej i odrzucić frakcję nieprzwiązaną.
19. Przemyć kolumnę 20 mL (10 objętości kolumny) buforu wiążącego i płuczącego IMAC (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 0.2% DDM).
20. Eluować białko buforem eluującym IMAC (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 250 mM imidazolu, 0.2% DDM).
21. Pobrać próbki po 15 μL z frakcji elucji, zmieszać każdą z 15 μL 2X buforu do próbek SDS w celu analizy metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Wirować przez 30 sec w mikrocentryfużce. Przeanalizować próbki na 10% żelu SDS-poliakrylamidowym, aby oszacować ilość i czystość MexB w każdej frakcji.
22. Połączyć frakcje zawierające kompleksy detergentowe białka MexB i skoncentrować je w koncentratorze wirówkowym w temperaturze 4°C. Należy uważać, aby białko nie wytrąciło się na tym etapie.

7. Kolumna do filtracji żelowej:

23. Przedrównoważyć kolumnę Superose 12 HL 30/10, przepuszczając przez nią 24 mL buforu do prowadzenia (50 mM NaP, pH 7.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,2% beta-octylglucoside), a następnie odczekać do uzyskania płaskiej linii bazowej.
24. Przepłukać pętlę załadowczą systemu Akta buforem do prowadzenia.
25. Przesączyć roztwór białka przez filtr strzykawkowy przed naniesieniem na kolumnę.
26. Nanieść na kolumnę do 240 μL roztworu białka o stężeniu do 5 mg/mL.
27. Przepuścić 1,5 objętości kolumny (36 mL) buforu, zbierając frakcje o objętości 0,25 mL. Kompleksy białka MexB z detergentem powinny eluować jako pik przy objętości elucji około 10-15 mL.
28. Pobrać próbki o objętości 5 μL z frakcji odpowiadających piki. Każdą próbkę wymieszać w stosunku 1:1 z 2X buforem do próbek SDS. Próbki poddać analizie na żelu poliakrylamidowym 10%, aby oszacować ilość i czystość białka MexB w każdej frakcji.
29. Połączyć frakcje zawierające czyste białko MexB.

8. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 przedstawia żel poliakryloamidowy z połączonymi frakcjami z kolumny IMAC oraz pojedynczymi frakcjami z kolumny do filtracji żelowej. Po filtracji żelowej białko wydaje się być czyste w żelu poliakryloamidowym barwionym Coomassie. Rysunek 2 zawiera zapis z kolumny do filtracji żelowej, pokazujący główny pik kompleksu białko-detergent wypływającego z kolumny. Średnia wydajność białka MexB wynosi około 2 mg na 6 litrów hodowli w pożywce 2XYT.

Rysunek 1. Żel SDS-PAGE z procesu oczyszczania PDCs MexB. Ścieżka 1, Markery masy cząsteczkowej. 2, Połączone frakcje IMAC. 3-7, Frakcje z kolumny do filtracji żelowej.

Rycina 2. Przykład wyników filtracji żelowej dla kompleksów białka MexB z detergentem (PDC).

Dyskusja

Oprócz oporności wielolekowej wiele kluczowych procesów komórkowych, w tym transport jonów, komunikacja międzykomórkowa, transport pęcherzykowy, utrzymanie struktury komórkowej oraz interakcje gospodarz-patogen, angażuje białka wbudowane w błonę komórkową. Białka transbłonowe stanowią ponad 30% znanych białek i są celem większości stosowanych obecnie farmaceutyków. Nieprawidłowe fałdowanie lub aktywność białek transbłonowych prowadzi do poważnych chorób genetycznych, w tym mukowiscydozy i cukrzycy. Pomimo ogromnego znacz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
bufor do próbek SDS	Bio-Rad	161-0737
szczep E. coli C43(DE3)	Lucigen	60345-1
siarczan kanamycyny	Sigma-Aldrich	K4378
pożywka 2XYT	Fisher Scientific	BP2466-2
pożywka LB	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
Lizozym	Sigma-Aldrich	L7651
Tabletki z kompletnym inhibitorem proteaz bez EDTA	Roche Group	11 873 580 001
NaP jednodstawkowy	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dwudstawkowy	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecyl-β-D-maltopiranozyd	Anatrace	D310
probówki 15 ml	Corning	430052
Wstrząsarka See-Saw Rocker	Fisher Scientific	SSL 4
Żywica do powinowactwa metalicznego Talon	Clontech Laboratories	635503
imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
10% żele poliakryloamidowe SDS PAGE	Bio-Rad	161-1454
bufor do elektroforezy Tris/glicyna/SDS PAGE	Bio-Rad	161-0732
Markery masy cząsteczkowej wstępnie barwione Kaleidascope	Bio-Rad	161-0324
Kolumna Superose 12 30/10	GE Healthcare	12 10/300 GL
Odwirnik koncentrujący Amicon	EMD Millipore	UFC801024
Filtr strzykawkowy	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Kolby Fernbacha	Fisher Scientific	09-552-39
Wstrząsarka do kolb Fernbacha	Fisher Scientific
System Akta	GE Healthcare
Wirówka wielkoskalowa J6 z rotorem JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
Butelki wirówkowe 1 l	Beckman Coulter Inc.	969329
Wirówka RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor kątowy SS34 i probówki	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Ultrawirówka stacjonarna Sorvall	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor T647.5 i probówki z nakrętkami	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Komora ciśnieniowa French Pressure Cell	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032