$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Dzień 1:
MexB z Pseudomonas aeruginosa jest kodowany przez pFB101. Gen MexB amplifikowano z genomowego DNA P. aeruginosa i wstawiono do miejsc restrykcyjnych NdeI i XhoI wektora pET30b+. Konstrukt zawiera C-końcowy znacznik heksahistydyny.
- Plazmid służy do transformacji szczepu E. coli C43(DE3) 12, a transformanty są platerowane na agarze LB zawierającym 30 ug / ml kanamycyny.
2. Dzień 2: Nocne kultury:
- Wieczorem ze świeżych kolonii transformantów inokuluje się kultury 4 x 3 ml LB zawierające 30 ug/ml kanamycyny. Alternatywnie, kultury można zaszczepić z zamrożonego trwałego ondulacji.
Te małe kultury są uprawiane na walcu w temperaturze 37°C przez noc.
3. Dzień 3: Uprawa 6-litrowych kultur:
- Rano użyj nocnych kultur do zaszczepienia 150 ml LB zawierającego 30 ug/ml kanamycyny. Hoduj kulturę w temperaturze 37 ° C na shakerze.
- Po południu użyj małej kultury do zaszczepienia 6 x 1 l pożywki 2XYT zawierającej 30 ug/ml kanamycyny w kolbach Fernbacha. (Użyj 25 ml na kulturę do rozcieńczenia 1:40). Hoduj kultury w temperaturze 37°C, aż osiągną OD600 0,4-0,6, około 1,5 godziny
- Gdy kultury osiągną odpowiednią gęstość, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 ml 1M IPTG. Włóż wszystkie kolby z powrotem do wytrząsarki i kontynuuj ich hodowlę w temperaturze 30°C przez noc.
4. Dzień 4: Pobieranie komórek i oczyszczanie białka:
- Dodaj inhibitory proteazy, DNAzę i lizozym do roztworów buforowych w następujący sposób: Do 50 ml buforu do ponownego zawieszania komórek dodaj 10 mg DNazy I (0,1 mg / ml stężenia końcowego), 1 kompletną tabletkę inhibitora proteazy bez EDTA i szczyptę lizozymu. Do 60 ml buforu do sporządzania zawiesiny błonowej dodać 1 tabletkę inhibitora proteazy. Do kolejnych 50 ml buforu do sporządzania zawiesiny błonowej dodać 1 tabletkę inhibitora proteazy. Trzymaj wszystkie trzy roztwory na lodzie.
- Odwirować kultury przez 30 minut 5 000 obr./min w wirówce na dużą skalę w celu zebrania komórek.
- Ponownie zawiesić komórki w 100 ml buforu do resuspensji komórek (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 kompletna tabletka inhibitora proteazy bez EDTA, 0,1 mg/ml DNAzy I, szczypta lizozymu)
- Przepuść roztwór ogniwa dwukrotnie przez francuską celę ciśnieniową przy ciśnieniu 12 000 psi (ciśnienie manometryczne 762). Zbierz lizat komórkowy do butelki chłodnej na lodzie.
- Przenieś lizat komórkowy do probówek wirówkowych SS34 i odwiruj w celu usunięcia resztek komórek przez 30 minut przy 10 000 obr./min w temperaturze 4°C w wirniku SS-34.
- Ostrożnie usunąć supernatant do probówek ultrawirówek Ti647.5. Wirować przez 50 minut przy 40 000 obr./min w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad, który zawiera błony komórkowe, w ok. 25 ml buforu do rezawieszania błon (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 1 kompletna tabletka inhibitora proteazy bez EDTA).
- Przenieść zawiesinę membranową do czystej probówki wirówkowej i odwirować z prędkością 40 000 obr./min w wirniku Ti647.5 przez 50 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić przemyty osad membranowy w 25 ml buforu do ponownego zawieszania membrany (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 1 kompletna tabletka inhibitora proteazy bez EDTA).
5. Solublacja białek TM:
- Do zawieszonych membran (około 25 ml) dodać 6 ml 10% DDM (końcowe stężenie detergentu = 2% DDM) Rozdrabniać mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
- Odwirować mieszaninę z prędkością 40 000 obr./min przez 40 minut w temperaturze 4°C w wirniku Ti647.5 w celu oddzielenia rozpuszczalnych kompleksów detergentów białkowych od nierozpuszczalnych białek. Zachowaj supernatant, który zawiera kompleksy detergentów białkowych MexB.
6. IMAC:
- Zmieszać supernatant otrzymany z wirowania z dużą prędkością z kulkami powinowactwa do metalu szponowego zrównoważonymi w buforze do resuspensji. Inkubować przez 1 godzinę na wałku w temperaturze 4°C.
- Wlej gnojowicę do korpusu kolumny przepływu grawitacyjnego i wylej przepływ.
- Przepłukać kolumnę 20 ml (10 objętości kolumny) buforu wiążącego i płuczącego IMAC (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,2% DDM)
- Eluować białko za pomocą buforu elucyjnego IMAC (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 250 mM imidazolu, 0,2% DDM).
- Pobrać 15 μl próbek frakcji elucyjnych, wymieszać każdą z 15 μl buforu do próbek 2X SDS do analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Odwiruj 30 sekund w mikrowirówce. Przeanalizuj próbki na 10% poliakryloamidowym żelu SDS, aby oszacować ilość i czystość MexB w każdej frakcji.
- Zebrać frakcje zawierające kompleksy detergentów białkowych MexB i skoncentrować je w koncentratorze wirowym w temperaturze 4°C. Należy uważać, aby białko nie wytrąciło się na tym etapie.
7. Kolumna filtracji żelowej:
- Wstępnie zrównoważyć kolumnę Superose 12 HL 30/10 z 24 ml buforem bieżącym (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 0,2% beta-oktyloglukozydu) i poczekaj na płaską linię podstawową.
- Przepłucz pętlę ładowania systemu Akta za pomocą uruchomionego bufora.
- Przefiltrować roztwór białkowy za pomocą filtra strzykawkowego przed nałożeniem go na kolumnę.
- Załadować do 240 μl roztworu białkowego na kolumnę, o stężeniu białka do 5 mg/ml.
- Uruchom 1,5 objętości kolumny (36 ml) buforu, zbierz frakcje 0,25 ml. Kompleksy detergentów białkowych MexB powinny eluować się w postaci piku przy około 10 - 15 ml objętości elucji.
- Pobrać 5 μl próbek frakcji pikowych. Wymieszaj każdą próbkę 1:1 z buforem do próbek 2X SDS. Analizuj próbki na 10% żelu poliakrylamidowym, aby oszacować ilość i czystość MexB w każdej frakcji
- Zbierz frakcje zawierające czysty MexB.
8. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1 przedstawia żel poliakrylamidowy z połączonymi frakcjami kolumny z kolumny IMAC i pojedynczymi frakcjami z kolumny filtracyjnej żelu. Po żelowej kolumnie filtracyjnej białko wydaje się czyste przez barwiony żel poliakrylamidowy Coomassie. Rysunek 2 zawiera ślad z żelowej kolumny filtracyjnej, pokazujący główny pik eluującego z kolumny kompleksu białkowego detergentu. Średnia wydajność białka MexB wynosi około 2 mg na 6 litrów kultury 2XYT.
Rysunek 1. SDS-PAGE żel do oczyszczania PDC MexB. Tor 1, Markery masy cząsteczkowej. 2, Połączone frakcje IMAC. 3-7, Frakcje żelowej kolumny filtracyjnej.
Rysunek 2. Przykład wyników filtracji żelowej dla kompleksów detergentów białkowych MexB (PDC).