Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Podsumowanie

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Streszczenie

Patogeny wirusowe stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego; wirusy nie tylko mogą wywoływać naturalne epidemie chorób ludzkich, ale niepokój budzi również możliwość ich wykorzystania w bioterroryzmie. Lepsze zrozumienie czynników komórkowych wpływających na infekcję ułatwiłoby opracowanie niezwykle potrzebnych środków terapeutycznych. Ostatnie postępy w technologii interferencji RNA (RNAi), w połączeniu z pełnym sekwencjonowaniem genomów kilku organizmów, doprowadziły do optymalizacji szerokozakresowych, komórkowych przesiewów utraty funkcji (loss-of-function screens) w skali całego genomu. Komórki Drosophila są szczególnie podatne na przesiewy w skali genomu ze względu na łatwość i efektywność stosowania RNAi w tym systemie ¹. Co ważne, szeroka gama wirusów może infekować komórki Drosophila, w tym szereg wirusów ssaków o znaczeniu medycznym i rolniczym ^2,3,4. Poprzednie przesiewy RNAi w Drosophila pozwoliły zidentyfikować czynniki gospodarza niezbędne dla różnych etapów infekcji wirusowej, w tym dla wniknięcia, translacji i replikacji RNA ⁵. Ponadto wiele czynników komórkowych wymaganych do replikacji wirusowej w hodowlach komórkowych Drosophila jest również ograniczające w komórkach ludzkich zainfekowanych tymi wirusami ^{4,6,7,8, 9}. Dlatego identyfikacja czynników gospodarza wykorzystywanych podczas infekcji wirusowej dostarcza nowych celów dla terapii przeciwwirusowych. Przedstawiamy tutaj uogólniony protokół wysokoprzepustowego przesiewu RNAi w celu identyfikacji czynników komórkowych zaangażowanych w infekcję wirusową, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Protokół

Część 1: RNAi w płytkach 384-dołkowych

1. Standaryzacja odczynników stosowanych podczas przesiewu jest niezbędna. Testujemy poszczególne partie pożywki Schneidera, płodowej surowicy bydlęcej oraz odczynników barwiących. Następnie rozdzielamy je na alykwoty i używamy tej samej partii przez cały okres przesiewu.
2. W przypadku każdego testu najlepiej jest sprawdzić kilka różnych linii komórkowych, aby ustalić, która z nich jest najbardziej odpowiednia dla uzyskanego odczytu biologicznego. My zazwyczaj stosujemy linię S2-DRSC.
3. Hodowla Muszka owocówka komórki w 25°C w pełnej pożywce Schneidera.
   1. pożywka Schneidera
   2. 10% nieaktywnej termicznie FBS
   3. 1X L-glutamina
   4. 1X antybiotyki penicylina/streptomycyna
4. Muszka owocówka Komórki są półprzylegające i są pasażowane co cztery dni bez trypsynizacji poprzez odpipetowanie komórek z kolby i rozcieńczenie ich w stosunku 1:10 w nowej kolbie. Do eksperymentów należy wykorzystać komórki w fazie logarytmicznej.
5. Zmienność między płytkami oraz z dnia na dzień jest minimalizowana dzięki zastosowaniu automatycznego systemu dozowania cieczy we wszystkich etapach dodawania odczynników do płytek wielodołkowych. Używamy urządzenia WellMate (Matrix).
6. Przygotuj dreny WellMate.
   1. Okapy rozpylające i WellMate przemyć 70% etanolem.
   2. Wyjąć przewody z opakowania i spryskać 70% etanolem.
   3. Włóż kasetę z przewodami w pozycję dozującą w urządzeniu WellMate.
   4. Napełnij przewód 25 ml 70% etanolu w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
   5. Sterylizować dreny w etanolu przez 15 minut, a następnie przepłukać kolejnymi 25 ml etanolu.
   6. Przepłucz dreny, przepuszczając przez nie 50 ml sterylnego PBS.
7. Odseparuj komórki z kolby i policz je. Odwiruj komórki, aby uzyskać o 25% więcej niż jest wymagane (300xg, 5 min). Liczba komórek wysiewanych do każdego dołka musi zostać zoptymalizowana w zależności od czasu trwania analizy. W przypadku przeprowadzania zautomatyzowanej analizy obrazu, idealna dla segmentacji obrazu jest pojedyncza warstwa komórek bez ich skupiania się.
8. Resuspender osad z komórek w bezserykowym medium Schneidera w stężeniu 1,7x10⁶ komórek/ml
9. Przesiewanie przeprowadzamy w płytkach 384-dołkowych, w których wcześniej rozdzielono komercyjnie dostępną bibliotekę dsRNA w stężeniu 250 ng/dołek. Kilka dołków w każdej płytce pozostaje pustych w celu dodania kontroli, które nanosi się ręcznie. Jako kontrolę negatywną stosujemy dsRNA przeciwko lucyferazie. Jako kontrolę skutecznego RNAi stosujemy dsRNA przeciwko Thread (dIAP). Wyciszenie tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do gwałtownej śmierci komórek, co stanowi szybką wizualną metodę oceny jakości wyciszenia. Na koniec, jako kontrolę pozytywną, stosujemy dsRNA przeciwko reporterowi wirusowemu (w tym przypadku beta-galaktosemidazie), aby potwierdzić możliwość zahamowania infekcji wirusowej przy użyciu naszego odczytu testowego. W przypadku nanoszenia dsRNA do płytki w momencie wysiewania komórek, rozdzielić 1 μl nanieść dsRNA w róg dołka, aby ułatwić wizualizację, a następnie odwirować dsRNA na dno dołka (300xg, 1 min) przed dodaniem komórek.
10. Użyj urządzenia WellMate, aby dodać 10 μL przygotowane powyżej komórki do każdego dołka.
11. Osadź komórki na płytkach poprzez wirowanie z prędkością 300 x g przez 1 min.
12. Inkubować w 25°C inkubator przez 45 minut.
13. Dodaj 20 μL uzupełnić pożywkę Schneidera i wirować z prędkością 300xg przez 1 min.
14. Umieść płytki w nawilżonych pojemnikach Tupperware wyłożonych nasączonymi wodą ręcznikami papierowymi. Objętość pojedynczej studzienki w płytce 384-dołkowej jest niewielka, w związku z czym parowanie może znacząco wpłynąć na procesy biologiczne, co z kolei może prowadzić do artefaktów w odczytach z zewnętrznych studzienek. Aby temu zapobiec, płytki należy przechowywać w warunkach wysokiej wilgotności.
15. Inkubować przez trzy dni, aby zapewnić skuteczny knockdown. W tym czasie nie ma potrzeby wymiany pożywki ani otwierania pojemników z nawilżaczem.

Część 2: Zakażanie wirusem Vaccinia

1. Sterylizować wielokanałowy aspirator w preparacie Quatricide przez 15 minut, a następnie opłukać w 70% etanolu.
2. Przygotować urządzenie WellMate zgodnie z powyższym opisem.
3. Przygotować pożywkę Schneidera z 2% FBS do infekcji, rozcieńczając pożywkę kompletną w stosunku 1:5 w pożywce bezsurowiczej.
4. Przefiltrować surowy zapas wirusa przez filtr strzykawkowy 0,8 µm w celu usunięcia szczątków komórkowych lub użyć wirusa oczyszczonego.
5. Rozcieńczyć wirusa vaccinia w pożywce Schneidera z 2% surowicy, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 2.
6. Usunąć PBS z przewodów WellMate i przepłukać je rozcieńczonym wirusem, aż w przewodach nie będzie pęcherzyków powietrza.
7. Używając wysterylizowanego wielokanałowego aspiratora i kolektora próżniowego, delikatnie usunąć pożywkę z płytek z komórkami Drosophila traktowanymi dsRNA.
8. Nanieść 30 μL wirusa na studzienkę na płytkach za pomocą urządzenia WellMate.
9. Wirować płytki przez 1 minutę przy 300xg.
10. Sterylizować przewodów WellMate. Przepłukać je 25 mL 10% roztworu wybielacza, odczekać 10 minut, a następnie przepłukać kolejnymi 25 mL 10% roztworu wybielacza.
11. Przepłukać przewodów 50 mL wody, a następnie 50 mL 70% etanolu. Schować przewodów do opakowania.
12. Przenieść płytki do nawilżonego pojemnika Tupperware. Inkubować w temperaturze 25°C przez 48 godzin.

Część 3: Barwienie płytek

1. Utrwal płytki w 15 μL 4% formaldehydu/PBS przez 10 minut. Na każdym etapie ciecz jest usuwana za pomocą aspiratora wielokanałowego i kolektora próżniowego. Po utrwaleniu płytek nie jest już wymagane stosowanie sterylnego sprzętu i odczynników.
2. Usuń utrwalacz i za pomocą WellMate dodaj 30 μL PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Inkubuj przez 10 minut i powtórz czynność. Obsługuj WellMate zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że dreny nie muszą być sterylizowane.
3. Do wykrywania infekcji vaccinia stosujemy reporter β-galaktozydazy sterowany wczesnym/późnym promotorem vaccinia.
4. Usuń ciecz i inkubuj komórki w roztworze blokującym (PBST z 2% BSA) przez 10 minut.
5. Rozcieńcz przeciwciało pierwotne w roztworze blokującym, usuń ciecz i dodaj 15 μL przeciwciała do każdej studni za pomocą wielokanałowej pipety wielokrotnej (Matrix).
6. Odwiruj płytki (300xg, 1 min), przykryj przezroczystą naklejką i inkubuj w 4°C przez noc.
7. Usuń przeciwciało pierwotne i za pomocą WellMate przemyj studnie w PBST 3 razy, po 10 minut każdy raz.
8. Rozcieńcz fluorescencyjnie znakowane przeciwciało wtórne (FITC) oraz barwnik jądrowy w roztworze blokującym i dodaj 15 μL do studni za pomocą wielokanałowej pipety wielokrotnej.
9. Inkubuj płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
10. Przemyj studnie w PBST 3 razy, po 10 minut każdy raz, używając WellMate.
11. Zapieczętuj płytkę przezroczystą naklejką, przykryj i przechowuj w 4°C do trzech tygodni.

Część 4: Obrazowanie i analiza obrazu

1. Do obrazowania płytek należy użyć automatycznego mikroskopu przy powiększeniu 20X.
2. Należy wykonać zdjęcia wszystkich jąder komórkowych (DAPI) oraz zainfekowanych komórek (FITC). Czas ekspozycji dla każdego kanału należy zoptymalizować indywidualnie, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny.
3. Funkcję automatycznego ostrzenia należy dopracować, wykonując stos obrazów Z (Z stack) w odstępach 1um, obejmujący płaszczyzny powyżej i poniżej przewidywanej płaszczyzny ostrości. Po zlokalizowaniu optymalnej płaszczyzny ostrości należy odpowiednio dostosować ustawienia autofokusa.
4. Należy obrazować całą płytkę, wykonując co najmniej trzy zdjęcia na studnię zarówno w kanale Hoechst (DAPI), jak i kanale wirusowym (FITC). Miejsca należy wybierać z kilku różnych obszarów w obrębie jednej studni, aby uzyskać obrazy reprezentatywne dla całej studni.
5. Należy użyć oprogramowania MetaXpress do utworzenia dziennika w celu segmentacji obrazu oraz modułów Count Nuclei do obliczenia całkowitej liczby komórek wykazujących pozytywne barwienie jąder (całkowita liczba komórek) oraz infekcji (FITC) dla każdej płytki.
6. Należy obliczyć procent infekcji (100*FITC pozytywne/całkowita liczba komórek) i zastosować transformację logarytmiczną.
7. W celu identyfikacji kandydatów stosuje się odporny wskaźnik Z (robust Z score) oparty na medianie i rozstępie międzykwartylowym każdej płytki. Metoda ta jest niewrażliwa na wartości odstające i dane niesymetryczne, co zapewnia większą moc w identyfikowaniu nawet słabych lub umiarkowanych trafień 10. Dla każdej płytki od danych poddanych transformacji logarytmicznej odejmuje się medianę. Następnie otrzymane wartości dzieli się przez 0,74 razy rozstęp międzykwartylowy (różnica między wartościami 75^th percentyla a 25^th percentyla). Współczynnik 0,74 jest stosowany w celu przybliżenia standardowego rozkładu normalnego.
8. Odporny wskaźnik Z jest miarą odległości w odchyleniach standardowych od mediany płytki. Na przykład, wartość robust Z-score równa 2 wskazuje, że % infekcji w studni oddalony jest o ok. 2 odchylenia standardowe od mediany płytki lub p<0,05.
9. Liczbę komórek należy przeanalizować w celu identyfikacji kandydatów cytotoksycznych. Oblicza się odporny wskaźnik Z dla liczby jąder. Kandydaci z wartością robust Z<-2 w badaniach powtórzonych są uznawani za cytotoksyczne.
10. Studnie, w których odporny wskaźnik Z dla procenta infekcji wynosi >2 lub <-2 w badaniach powtórzonych (p<0,0025) przy braku cytotoksyczności, są uznawane za potencjalnych kandydatów z przesiewu pierwotnego.
11. Kandydaci pozytywni są walidowani przy użyciu niezależnych odczynników. dsRNA są generowane przeciwko interesującym genom z innego regionu mRNA i testowane w opisany wyżej sposób.
12. Geny, dla których dwa niezależne dsRNA wykazują ten sam fenotyp, mogą zostać zakwalifikowane do dalszych badań.

Część 5: Reprezentatywne obrazy i interpretacja wskaźników zakażenia

Rysunek 1. W studzienkach niezinfekowanych nie obserwuje się żadnego barwienia białek wirusa vaccinia, podczas gdy reprezentatywna zainfekowana studzienka zawiera komórki wykazujące pozytywne barwienie na białko beta-galaktozydazy (βgal) ekspresjonowane przez vaccinia, zmierzone za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wirus = kolor zielony, jądra komórkowe = kolor niebieski.

Rycina 2. Automatyczne oprogramowanie do analizy obrazu ilościowo określa stopień infekcji na każdym obrazie przy użyciu parametrów ustawionych przez użytkownika. Na reprezentatywnym obrazie całkowita liczba jąder komórkowych oraz liczba komórek wykazujących ekspresję antygenu wirusowego są zliczane na podstawie wielkości i intensywności barwienia powyżej lokalnego tła.

Rycina 3. Wyciszenie genu thread (dIAP) służy jako kontrola pozytywna dla skutecznego wyciszenia genów docelowych za pomocą RNAi. Wyciszenie tego czynnika antyapoptotycznego prowadzi do gwałtownej śmierci komórek. Jądra komórkowe=niebieskie.

Rycina 4. Wyciszenie ekspresji lucyferazy służy jako kontrola negatywna dla wpływu traktowania dwuniciowym RNA na infekcję. Deplecja lucyferazy nie wpływa na infekcję w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu dsRNA. Wirus = zielony, jądra komórkowe = niebieskie.

Rycina 5. Knockdown białka βgal służy jako kontrola pozytywna dla redukcji infekcji, ponieważ w teście poziomy białka βgal są wykorzystywane jako wskaźnik infekcji. Deplecja βgal skutkuje zmniejszeniem odsetka zainfekowanych komórek. Wirus = zielony, jądra = niebieskie.

Rycina 6. Wyciszenie ekspresji czynnika komórkowego Rab5 prowadzi do zmniejszenia odsetka zainfekowanych komórek. Ponieważ wiadomo, że Rab5 uczestniczy w endocytozie, czynnik ten prawdopodobnie przyczynia się do krowianka wnikanie wirusa. Jest to przykład wartości odstającej z przesiewu. Wirus = zielony, jądra komórkowe = niebieskie.

Dyskusja

Przesiewowe badania RNAi w całym genomie Drosophila stanowią solidną i wydajną metodę badania komórkowych komponentów infekcji wirusowej. Liczne wirusy ssaków infekują komórki Drosophila, co może być wykorzystane do identyfikacji składników wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz białkowych czynników gospodarza niezbędnych do replikacji wirusa, które mogą stanowić nowe cele terapeutyczne. Przed przeprowadzeniem przesiewu test musi zostać starannie zoptymalizowany pod kątem typu komórek, ich liczby oraz poziomu infekcji, a także musi być odpowiednio kontrolowany, z uwzględnieniem zarówno pozytywnych, jak i negatywnych celów wirusowych i komórkowych¹¹. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem przesiewu zapewnić wystarczającą separację między kontrolami pozytywnymi a negatywnymi, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny testu. Po przeprowadzeniu przesiewu kandydatów można podzielić na kategorie funkcjonalne, aby ustalić, które mechanizmy gospodarza przyczyniają się do infekcji. W przypadku wirusów ssaków, takich jak vaccinia, w ramach analizy wtórnej należy określić udział homologów ssaków za pomocą RNAi. Razem te solidne metody przesiewowe pozwolą nam uzyskać wgląd w złożone mechanizmy, za pomocą których wirusy oddziałują z komórkami gospodarza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hodowla komórkowa
Schneider’podłoża do hodowli tkanek	GIBCO, by Life Technologies	11720
GlutaMAX 100X	GIBCO, by Life Technologies	35050
Penicylina/streptomycyna (pen/strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F6178
Przesiewy
Genomowa biblioteka dsRNA	Ambion
płytki 384-dołkowe, czarne z przezroczystym dnem	Corning	3712
Uszczelki aluminiowe	Corning	6569
Przezroczyste uszczelki	Denville Scientific	B1212-4
Witaj kolego	Matlab	201-10001
kolektor 24-pinowy	Drummond Scientific	3-000-101
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie	Invitrogen
zautomatyzowany mikroskop ImageXpressMicro	Molecular Devices
oprogramowanie do analizy obrazów MetaXpress	Molecular Devices