Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Podsumowanie

Analiza pojedynczych komórek jest przeprowadzana za pomocą spektrometrii mas w komórkach roślinnych i zwierzęcych pod ciśnieniem atmosferycznym, wykorzystując zaostrzony światłowód do pobierania próbek komórek w celu przeprowadzenia spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylanie wspomaganą ablacją laserową (LAESI).

Streszczenie

Analiza substancji biochemicznych w pojedynczych komórkach jest istotna dla zrozumienia metabolizmu komórkowego, cyklu komórkowego, adaptacji, stanów chorobowych i innych procesów. Nawet komórki tego samego typu wykazują heterogeniczny skład biochemiczny w zależności od ich warunków fizjologicznych i interakcji z otoczeniem. Konwencjonalne metody spektrometrii mas (MS) stosowane do analizy biomolekuł w pojedynczych komórkach opierają się na rozbudowanym przygotowaniu próbek. Usunięcie komórek z ich naturalnego środowiska oraz intensywne przetwarzanie próbek mogą prowadzić do zmian w składzie komórkowym. Metody jonizacji w warunkach otoczenia umożliwiają analizę próbek w ich naturalnym środowisku i bez konieczności rozbudowanego przygotowania.¹ Techniki oparte na ablacji laserowej materiałów biologicznych w średniej podczerwieni (mid-IR) przy długości fali 2,94 μm wykorzystują gwałtowną ekscytację wody, która prowadzi do eksplozji fazowej.² Techniki jonizacji w warunkach otoczenia oparte na promieniowaniu laserowym mid-IR, takie jak jonizacja przez rozpylanie elektrosprayowe z ablacji laserowej (LAESI) oraz desorpcja laserowa wspomagana matrycą w podczerwieni przy ciśnieniu atmosferycznym (AP IR-MALDI), skutecznie wykazały zdolność do bezpośredniej analizy bogatych w wodę tkanek i płynów biologicznych pod ciśnieniem atmosferycznym.^3-11 W LAESI pióropusz ablacji laserowej mid-IR, składający się głównie z neutralnej materii cząsteczkowej z próbki, łączy się z silnie naładowanymi kroplami elektrosprayu w celu wytworzenia jonów. Niedawno przeprowadzono ablację pojedynczych komórek mid-IR poprzez dostarczenie promieniowania mid-IR za pomocą trawionego włókna. Pióropusz wygenerowany podczas tej ablacji został poddany post-jonizacji przez elektrospray, co umożliwiło analizę różnorodnych metabolitów w pojedynczych komórkach za pomocą LAESI-MS.¹² Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół analizy pojedynczych komórek z wykorzystaniem LAESI-MS. Przedstawiony film demonstruje analizę pojedynczej komórki naskórka z cebulki Allium cepa. Schemat systemu przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywny przykład ablacji pojedynczej komórki oraz widmo masy LAESI z komórki znajdują się na Rysunku 2.

Protokół

1. Komponenty optyczne

1. Ablacja laserowa dla spektrometrii mas (MS) z jonizacją przez laserową ablację i rozpylanie elektrosprayowe (LAESI) jest realizowana za pomocą impulsu laserowego o czasie trwania 5 ns i długości fali 2,94 μm. Do ablacji w niniejszym badaniu wykorzystano strojony oscylator parametryczny sterowany laserem Nd:YAG (Opolette 10, Opotek Inc., Carlsbad, CA). Częstotliwość repetycji wybrano w zakresie od 5 do 100 Hz. Jest to laser klasy IV, który w przypadku bezpośredniej ekspozycji może spowodować poważne i trwałe uszkodzenia oczu lub skóry. Rozproszone odbicie wiązki laserowej może również stanowić zagrożenie dla skóry lub oczu. Należy używać odpowiednich gogli ochronnych do laserów.
2. Włókno optyczne wykonane ze szkła na bazie dwutlenku germanu pozyskano z Infrared Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Jeśli włókno posiada powłoki z Hytrelu i poliimidu, należy postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami w celu ich usunięcia z końców. Podgrzać 1-metylu-2-pirolidynon do temperatury 130-150 °C w dygestorium. Zanurzyć końce włókna przeznaczone do zdjęcia powłoki w tym cieczu przez około 1 min lub do momentu, aż powłoka zacznie mięknąć i odklejać się. Zanurzyć zmiękczoną powłokę w metanolu lub izopropanolu na minutę, a następnie wytrzeć pozostałości powłoki niezrzucającą kłaczków chusteczką. Po usunięciu powłoki przeciąć oba końce włókna ostrzem szafirowym (KITCO Fiber Optics, Virginia Beach, VA) poprzez nacięcie i delikatne przełamanie.
3. Aby uzyskać pożądaną ostrość, należy poddać jeden koniec końcówki włókna trawieniu chemicznemu w 1% (v/v) roztworze kwasu azotowego (czystości reagentowej). Zanurzyć pionowo wybrany koniec włókna w roztworze kwasu na głębokość od 300 do 50 μm po początkowym kontakcie. Po około 15 minutach trawienia końcówka samoistnie oddzieli się od powierzchni kwasu. W rezultacie powstanie zaostrzona końcówka włókna o promieniu krzywizny ~15 μm. Przepłukać wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości kwasu.
4. Zamocować trawiony koniec włókna w mikromanipulatorze (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) i zbliżyć go do powierzchni komórki (odległość ~20 μm) w celu efektywnego dostarczenia energii.
5. Nieutrawiony koniec włókna optycznego należy uchwycić w uchwycie do gołego włókna (BFC30, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). W celu ustawienia optycznego uchwyt włókna zamontowano na translatorku pięcioosiowym (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Energię laserową (0,5 do 1 mJ) wprowadza się do włókna poprzez skupienie wiązki za pomocą soczewki plano-konweksnej z fluorku wapnia lub soczewki ZnSe z powłoką antyrefleksyjną (Infrared Optical Products, Farmingdale, NY) na jego nieutrawionym końcu. Do kierowania wiązką lasera średniofalowego IR na soczewkę skupiającą wykorzystuje się chronione lustra złote (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ).

2. Konfiguracja elektrosprayu

1. System do elektrorsikowania można zbudować, wykorzystując następujące komponenty: metalowe złącze z przewodzącą przelotką z perfluoroelastomeru, kształtki, tulejkę rurki, port igłowy (np. U-435, M215, F-31Nx, F-242x, 9013, odpowiednio IDEX Health & Sciences, Oak Harbor, WA) oraz kapilary z topionego kwarcu (np. CT360-10-50-5, New Objective Inc., Woburn, MA). Zalecany emiter wykonany jest ze stali nierdzewnej i posiada stożkową końcówkę o średnicy wewnętrznej 50 μm (np. MT320-50-5-5, New Objective Inc., Woburn, MA).
2. Do elektrorsikowania przygotować 50% roztwór metanolu z 0,1% kwasem octowym (v/v). Roztwór jest pompowany z prędkością od 200 do 30 nl/min za pomocą pompy strzykawkowej (Harvard Apparatus, Holliston, MA), używając np. strzykawki 50 μl (812, Hamilton Company, Reno, NV).
3. Do metalowego złącza przyłożyć wysokie napięcie w zakresie od 2 80 do 3 0 V za pomocą regulowanego zasilacza (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA), aby uzyskać stabilny prąd elektrorsikowania. Należy upewnić się, że wszystkie połączenia elektryczne są bezpieczne i ekranowane, a ekran jest odpowiednio uziemiony. Bezpośredni kontakt z odsłoniętym wysokim napięciem może doprowadzić do porażenia prądem.

3. Obsługa próbek

1. Pobierz żywą próbkę tkanki lub komórek z odpowiedniego źródła i przechowuj je zgodnie z zaleceniami przed przeprowadzeniem analizy. Cebulki Allium cepa do niniejszej demonstracji zostały zakupione w lokalnym sklepie. Przetnij cebulkę wzdłuż za pomocą skalpela chirurgicznego. Odetnij fragment łuski o długości kilku centymetrów w postaci paska. Zdejmij nienaruszoną jednowarstwę wewnętrznej tkanki epidermy.
2. Wykorzystaj wilgotną powierzchnię epidermy, aby zamocować tkankę na uprzednio oczyszczonym szklanym przedmioty szkiełku mikroskopowym. Przytrzymaj szkiełko za pomocą uniwersalnego uchwytu do płytek (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) zamontowanego na trójosiowej stole translacyjnej w celu pozycjonowania. Wykonaj pomiar widma masowego natychmiast po zamocowaniu próbki, aby zapobiec degradacji komórek.

4. System wizualizacji

1. Do wyboru komórek do analizy oraz utrzymania odległości między zaostrzonym końcem włókna a powierzchnią komórki stosuje się dwa mikroskopy dalekiego zasięgu. Ten drugi jest zamontowany pod kątem 15°-30° mierzonym od powierzchni. System ten składa się z wideo-mikroskopu dalekiego zasięgu (optyka precyzyjnego zoomu 7x, Edmund Optics, Barrington, NJ) z korygowanym w nieskończoność obiektywem 5x (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) wyposażonym w kamerę CCD (Marlin F131, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany) do monitorowania i przechwytywania obrazu.
2. Drugi wideo-mikroskop jest zamontowany prostopadle do powierzchni próbki w celu wizualizacji komórek z góry. System ten zapewnia sprzężenie zwrotne wizualne, pozwalające na ustawienie końcówki włókna nad komórką wybraną do ablacji i analizy. Składa się on z optyki precyzyjnego zoomu 7x (Edmund Optics, Barrington, NJ), wyposażonej w korygowany w nieskończoność obiektyw 10x z długą odległością roboczą (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) oraz kamerę CCD.

5. Pozyskiwanie widm masowych

1. Włącz laser, elektrospray oraz spektrometr mas, np. system kwadrupolowo-czasowy (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Zoptymalizuj geometrię źródła jonów LAESI, dostosowując wzajemne położenie punktu ablacji i emitera elektrosprayu względem siebie oraz wlotu spektrometru mas, aby uzyskać maksymalną intensywność jonów.
2. Wybierz analizowaną komórkę, korzystając z systemu wizualizacji z widokiem z góry. Po wyborze przesuń stół z próbką tak, aby wybrana komórka znalazła się bezpośrednio pod zaostrzonym końcem światłowodu. Za pomocą mikroskopu z widokiem z boku ponownie ustaw odległość końcówki od powierzchni komórki na ~20 μm.
3. Kieruj impulsy laserowe na wybraną komórkę poprzez trawioną końcówkę światłowodu. Prowadzi to do perforacji ściany komórkowej i wyrzutu cytoplazmy w postaci cząsteczek materii. Po pojonizacji przez elektrospray powstałe jony są zbierane przez spektrometr mas, a następnie rejestrowane są widma masowe.
4. Po akwizycji danych przełącz laser, elektrospray i spektrometr mas w tryb czuwania lub wyłącz je. Przechowuj ablowaną próbkę tkanki A. cepa do ewentualnej obserwacji pod mikroskopem świetlnym.

6. Reprezentatywne wyniki

Pomyślna ablacja pojedynczej komórki skutkuje przerwaniem ściany komórkowej i zarejestrowaniem widma masy LAESI. Nieudany eksperyment zazwyczaj objawia się brakiem ablacji i/lub brakiem widma masy. W celach demonstracyjnych przedstawiamy wyniki analizy LAESI-MS pojedynczej, zatopionej komórki epidermy cebuli A. cepa. Rysunek 2a przedstawia reprezentatywny obraz z mikroskopii optycznej po pobraniu próbki z komórki. Ściana komórkowa jest perforowana, a zakres perforacji jest ograniczony przez granice z sąsiednimi komórkami. Komórki przyległe wydają się być nienaruszone. Rysunek 2b przedstawia reprezentatywne widmo masy LAESI uzyskane z komórki. Wykryto szeroką gamę jonów z komórki A. cepa, które na podstawie ich dokładnych mas, rozkładów izotopowych, a w niektórych przypadkach tandemowych widm mas, zostały wstępnie przypisane do endogennych metabolitów. Jony wykryte w pojedynczej komórce były podobne do tych zaobserwowanych podczas analizy tej samej tkanki metodą konwencjonalnego LAESI-MS wielu komórek.¹³

Rysunek 1. Schemat analizy pojedynczych komórek metodą LAESI-MSImpuls lasera średniej podczerwieni (mid-IR) jest wprowadzany do światłowodu i dostarczany do próbki umieszczonej na szkiełku przedmiotowym. Zaostrzony koniec światłowodu skupia światło w docelowej komórce, a dostarczona energia powoduje jej rozerwanie. Powstała chmura ablacyjna (czerwone kropki) łączy się z chmurą elektrosprayową (czarne kropki), a kroplami ulegają koalescencji (zielone kropki), co prowadzi do powstania jonów specyficznych dla próbki. Jony te są analizowane i wykrywane przez spektrometr mas (MS). Dwa mikroskopy wideo do obserwacji z dużej odległości, Mikroskop 1 i Mikroskop 2, służą odpowiednio do monitorowania odległości między końcem światłowodu a powierzchnią komórki oraz do wyboru komórki do analizy.

Rysunek 2a. Ślad ablacji na pojedynczej komórce naskórka A. cepa żarówki. Sąsiednie komórki nie wykazują widocznych uszkodzeń i w konsekwencji mogą być analizowane osobno.

Rycina 2b. Widmo masowe odpowiadające ablacji pojedynczej A. cepa komórka epidermy wykazuje obecność metabolitów pierwotnych i wtórnych.

Dyskusja

Zawartość wody w cytoplazmie komórki oraz wytrzymałość na rozciąganie ściany lub błony komórkowej są kluczowymi czynnikami warunkującymi ablację pojedynczych komórek podczas analizy LAESI-MS. Fluencję lasera należy dostosować tak, aby osiągnąć progi ablacji dla różnych typów komórek. Dostarczona fluencja lasera zależy od energii impulsu laserowego oraz od odległości między końcówką światłowodu a powierzchnią komórki. Kluczowe jest zminimalizowanie zaburzeń komórek sąsiednich podczas analizy pojedynczej komórki. Utrzymywanie energii lasera na poziomie progu ablacji ogranicza wpływ analizy na komórki przyległe.

Jednym z potencjalnych zastosowań jest wykorzystanie pojedynczych komórek jako naturalnych pikseli objętościowych (wokseli) w obrazowaniu chemicznym metodą MS. W porównaniu z gromadzeniem danych na sztucznej, często prostokątnej siatce, obrazowanie chemiczne tkanki w skali jednej komórki z większą dokładnością zachowuje organizację przestrzenną oddziaływań biochemicznych między komórkami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy	Fluka	45727
Metanol	Fluka	65548
1-metylu-2-pirolidynon	Sigma-Aldrich	M79603
Woda	Fluka	39259