Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wstęp: Rak jajnika jest zazwyczaj diagnozowany w stadium zaawansowanym, w którym stosunek zachorowań do zgonów jest wysoki, co sprawia, że pozostaje on najbardziej śmiertelnym z wszystkich nowotworów ginekologicznych wśród kobiet w USA 1,2,3. Guzy surowicze są najczęstszymi postaciami raka jajnika 4,5, a myszy transgeniczne Tg-MISIIR-TAg stanowią jedyny model mysi, w którym ten typ guzów rozwija się spontanicznie. Myszy Tg-MISIIR-TAg wykazują ekspresję regionu transformującego SV40 pod kontrolą promotora genu receptora substancji inhibującej mullerowskiej typu II (MISIIR) 6. Zidentyfikowano dodatkowe linie transgeniczne, które wykazują ekspresję transgenu SV40 TAg, ale nie rozwijają guzów jajnika. Myszy niewrażliwe na powstawanie guzów wykazują typową dla myszy C57Bl/6 długość życia i są płodne. Myszy te mogą być wykorzystywane jako syngeneiczni biorcy allograftów komórek nowotworowych izolowanych z myszy Tg-MISIIR-TAg-DR26.
Cel: Chociaż obrazowanie guzów jest możliwe 7, wczesne wykrywanie głęboko położonych nowotworów u małych żywych zwierząt stanowi wyzwanie. Aby umożliwić badania przedkliniczne w immunologicznie nienaruszonym modelu zwierzęcym raka seryzowego jajnika, opisujemy syngeniczny model mysi dla tego typu raka jajnika, który pozwala na obrazowanie in vivo, badania mikrośrodowiska guza oraz odpowiedzi immunologicznej nowotworu.
Metody: W pierwszej kolejności wyizolowano linię komórkową raka mysiego TAg+ (MOV1) z samoistnego guza jajnika pobranego od 26-tygodniowej samicy DR26 Tg-MISIIR-TAg. Następnie przeprowadzono stabilną transdukcję komórek MOV1 za pomocą ssaczego wektora lentiwirusowego TurboFP635 kodującego Katushkę, dalekoczerwoną mutantkę czerwonego białka fluorescencyjnego z ukwiału Entacmaea quadricolor, z maksimami wzbudzenia/emisji przy 588/635 nm 8,9,10. Komórki MOV1Kat zaimplantowano ortotopowo do jajnika 11,12,13,14 u samic myszy Tg-MISIIR-TAg niewrażliwych na powstawanie guzów. Postęp nowotworowy monitorowano za pomocą obrazowania optycznego in vivo, a mikrośrodowisko guza analizowano metodą immunohistochemii.
Wyniki: Ortotopowo zaimplantowane komórki MOV1Kat rozwinęły surowicze guzy jajnika. Guzy MOV1Kat można było wizualizować za pomocą obrazowania in vivo do trzech tygodni po implantacji (ryc. 1); wykazywały one naciek leukocytów, co obserwuje się w przypadku ludzkich raków jajnika 15 (ryc. 2).
Wnioski: Opisujemy ortotopowy model raka jajnika, który jest odpowiedni do in vivo obrazowanie wczesnych guzów dzięki wysokiej stabilności pH oraz fotostabilności Katushki w głębokich tkankach. Proponujemy wykorzystanie tego nowego syngenicznego modelu surowczego raka jajnika do in vivo badania obrazowe oraz monitorowanie odpowiedzi immunologicznych guza i immunoterapii.
Protokół
1. Hodowla komórek
- Przed wstrzyknięciem ortotopowym hodować komórki MOV1Kat, pochodzące z guzów DR26, w kolbie T175 aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Zaplanować użycie od 1 do 5 milionów komórek na jedno wstrzyknięcie, co będzie wymagało 1 lub 2 kolb T175.
- W dniu wstrzyknięcia zebrać komórki i określić ich liczbę za pomocą hemocytometru.
- Po określeniu stężenia komórek, sfragmentować je poprzez wirowanie przez 5 minut przy 300 X g w temperaturze pokojowej.
- Po wirowaniu resuspenderować komórki, aby uzyskać 1 milion komórek w 10 µL sterylnego PBS z 0,002 M EDTA.
2. Przed operacją
- Przed operacją napełnić strzykawkę insulinową o pojemności 3/10 cc 1 milionem komórek MOV1-Kat w 10 µL PBS EDTA.
- Przenieść mysz znieczuloną izofluranem na podgrzewaną matę. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu. Następnie bezzwłocznie umieścić głowę zwierzęcia w systemie stożka nosowego podłączonego do waporyzatora izofluranu, aby zapewnić znieczulenie przez cały czas trwania zabiegu.
- Po dezynfekcji miejsca wstrzyknięcia gazikami nasączonymi alkoholem, podać podskórnie 5 mg/kg ketoprofenu (lek przeciwbólowy przedoperacyjny) za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 3/10 cc.
- Za pomocą trymera ogolić lewą tylną część grzbietu od połączenia piersiowo-lędźwiowego do nasady ogona zwierzęcia. Nałożyć krem do depilacji, aby całkowicie usunąć włosy. Następnie usunąć nadmiar kremu mokrym ręcznikiem papierowym.
- Po usunięciu włosów wysterylizować ogoloną okolicę za pomocą powidon-jodu i gazików nasączonych alkoholem. Następnie założyć pole operacyjne wokół miejsca nacięcia.
3. Operacja
- Tuż przed operacją ustaw poziom parownika izofluranu na 1,5%.
- Zweryfikuj, czy zwierzę jest całkowicie znieczulone, uciskając poduszkę stopy.
- Następnie zlokalizuj śledzionę pod skórą. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj cięcie grzbietowo-boczne o długości 1-2 cm w górnej prawej części śledziony.
- Przeprowadź preparację przestrzeni zaotrzewnowej. Widoczna będzie tkanka tłuszczowa otaczająca jajnik myszy. Użyj zakrzywionej pęsety, aby uchwycić i odsłonić poduszkę tłuszczową otaczającą jajnik myszy.
- Nawilż narząd kilkoma kroplami sterylnego PBS.
- Użyj zakrzywionej pęsety, aby uchwycić, odsunąć... ustawić... a następnie unieruchomić jajnik do iniekcji.
- Mocno trzymając jajnik pęsetą, wstrzyknij 10 µL komórek nowotworowych MOV1Kat do jajnika. Pewny chwyt zapobiegnie cofaniu się lub wyciekowi płynu.
- Niezwłocznie po iniekcji zwolnij ucisk pęsety. Perforacja w jajniku powinna samoistnie się obkurczyć i zamknąć.
- Używając wchłanialnej nici z kwasu poliglikolowego zamocowanej na igle, zamknij ranę w przestrzeni zaotrzewnowej.
- Zdejmij zwierzę z maski do znieczulenia.
- Naciągnij skórę i zaklej brzegi rany grzbietowo-bocznej kilkoma kroplami kleju tkankowego.
- Na koniec podaj zwierzęciu doustnie 100 µL antybiotyku. Następnie umieść je z powrotem w klatce i monitoruj proces wybudzania. Podawaj zwierzęciu antybiotyk w wodzie pitnej przez jeden tydzień.
4. Obrazowanie in vivo
- Tydzień po ortotopowym wstrzyknięciu komórek nowotworowych MOV1Kat wykonaj obrazowanie in vivo. Rozpocznij od przeniesienia myszy znieczulonej izofluranem do komory obrazowania.
- Zmniejsz poziom dozowania izofluranu w waporyzatorze do 2%.
- Przeprowadź obrazowanie in vivo zgodnie z instrukcjami producenta systemu obrazowania. W tym filmie zostanie użyty system Lumina.
- Aby rozpocząć obrazowanie, kliknij ikonę oprogramowania Living Image na pulpicie. Następnie w panelu sterowania akwizycją IVIS (IVIS Acquisition Control Panel) wybierz „Initialize”. Ustawienia instrumentu są analogiczne do ustawień aparatu fotograficznego.
- W panelu sterowania akwizycją ustaw parametry akwizycji instrumentu. W przypadku fluorescencji zaznacz „Fluorescent”. Zaznacz pole Photograph, aby wraz z każdym obrazem uzyskać zdjęcie.
- Następnie ustaw czas ekspozycji na Auto. W sekcji „Pixel binning or CCD resolution” zaznacz „Medium”. Następnie w sekcji F/stop or aperture zaznacz wartość 2. Dalej wybierz filtr wzbudzenia 535 oraz filtr emisji DsRed.
- W sekcji field of view kliknij View B, aby obrazować pojedynczą mysz.
- Następnie kliknij acquire, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
- Po zakończeniu akwizycji obrazu użyj narzędzia Region of Interest (ROI), aby zmierzyć sygnał. Kliknij ikonę pomiaru, aby wyświetlić wartości sygnału i powierzchnię.
- Na koniec kliknij „save”, aby zapisać obraz w folderze użytkownika.
- Po zapisaniu obrazów przerwij podawanie izofluranu i zwróć mysz do klatki. Mysz powinna obudzić się natychmiast.
5. Reprezentatywne wyniki
-Stosując ten protokół, wzrost ortotopowego raka jajnika in vivo można monitorować przez co najmniej 3 tygodnie za pomocą nieinwazyjnej procedury.
Rycina 1. Komórki MOV1Kat lub PBS jako kontrolę negatywną wstrzykiwano ortotopowo do jajnika myszy niepredysponowanych do tworzenia nowotworów (odpowiednio zwierzę po prawej i zwierzę po lewej). Obrazowanie in vivo przeprowadzono 2 tygodnie później. Emisję fluorescencji generowaną przez komórki MOV1Kat przeszczepione do jajnika zmierzono i porównano z emisją u myszy z grupy kontrolnej negatywnej.
Rysunek 2. Przemrożone skrawki guzów jajnika MOV1Kat zostały zabarwione biotynilowanym przeciwciałem mAb anty-CD4, a następnie substratem DAB (ciemnobrązowy) w celu wykrycia limfocytów naciekających guz (czarna strzałka). Komórki poddano przeciwbarwieniu metyl zielenią w celu wizualizacji jąder komórkowych (niebieski). Komórki nowotworowe (czerwone strzałki) różniły się morfologicznie od limfocytów T. Przeszkło przedstawiono w powiększeniu 40x.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chirurgia i wstrzyknięcia ortotopowe
Ortotopowe wstrzykiwanie do kaleki jajnika wymaga przeszkolenia i precyzji. W związku z tym
- W przypadku braku doświadczenia chirurgicznego, należy najpierw poćwiczyć na preparatach zwłokowych.
- Zaleca się stosowanie samic wieloparnych (po jednym lub dwóch miotach), ponieważ z czasem rozwijają one większe jajniki, co ułatwia wstrzykiwanie i zwiększa przeżywalność w porównaniu z samicami nulliparnymi.
- Ze względu na niewielki rozm...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu NIH P01 AI 068730 (SNC, NS), grantu NIH CA016520/ TAPITMAT (NS), prywatnych funduszy fundacji Claneil Foundation (NS), grantu ovarian SPORE dla FCCC i University of Pennsylvania (P50 CA83638) oraz grantu Fox Chase Cancer Center Core Grant (P30 CA06927) (DCC). Autorzy dziękują za doskonałą pomoc techniczną Optical/Bioluminescence Core Facility pod kierownictwem dr. E.J. Delikatnego na University of Pennsylvania, Anthony'emu Secreto ze Stem Cell and Xenograft Core pod kierownictwem dr. G. Danet-Desnoyers w University of Pennsylvania Cancer Center za przeszkolenie SNC w technice wstrzykiwania ortotopowego oraz Denada Dangaj z University of Pennsylvania/ OCRC za pomoc przy operacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Mata grzewcza | Deltaphase | 39 DP | |
| Gaziki z powidonem | Dynarex | 1108 | |
| Gaziki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Maść z sztucznymi łzami | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Strzykawka insulinowa 3cc | BD Biosciences | 309301 | |
| Nić z igłą z kwasu poliglikolowego (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Klej tkankowy | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ zawiesina doustna | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluran | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicylina/streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Wektor ssaczy TurboFP635 | Evrogen | FP721 | |
| Kolby T175 | cellstar | 660-190 |
Bibliografia
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L., et al. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev 22. , 255-288 (2001).
- Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
- Connolly, D. C., et al. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
- Hensley, H., et al. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
- Deliolanis, N. C., et al. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
- Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
- Shcherbo, D., et al. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
- Kiguchi, K., et al. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis 16. , 751-756 (1998).
- Bao, R., et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
- Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45. , 1-36 Forthcoming.
- Milne, K., et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. , (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
