Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wstęp: Rak jajnika jest zazwyczaj diagnozowany w stadium zaawansowanym, w którym stosunek zachorowań do zgonów jest wysoki, co sprawia, że pozostaje on najbardziej śmiertelnym z wszystkich nowotworów ginekologicznych wśród kobiet w USA 1,2,3. Guzy surowicze są najczęstszymi postaciami raka jajnika 4,5, a myszy transgeniczne Tg-MISIIR-TAg stanowią jedyny model mysi, w którym ten typ guzów rozwija się spontanicznie. Myszy Tg-MISIIR-TAg wykazują ekspresję regionu transformującego SV40 pod kontrolą promotora genu receptora substancji inhibującej mullerowskiej typu II (MISIIR) 6. Zidentyfikowano dodatkowe linie transgeniczne, które wykazują ekspresję transgenu SV40 TAg, ale nie rozwijają guzów jajnika. Myszy niewrażliwe na powstawanie guzów wykazują typową dla myszy C57Bl/6 długość życia i są płodne. Myszy te mogą być wykorzystywane jako syngeneiczni biorcy allograftów komórek nowotworowych izolowanych z myszy Tg-MISIIR-TAg-DR26.
Cel: Chociaż obrazowanie guzów jest możliwe 7, wczesne wykrywanie głęboko położonych nowotworów u małych żywych zwierząt stanowi wyzwanie. Aby umożliwić badania przedkliniczne w immunologicznie nienaruszonym modelu zwierzęcym raka seryzowego jajnika, opisujemy syngeniczny model mysi dla tego typu raka jajnika, który pozwala na obrazowanie in vivo, badania mikrośrodowiska guza oraz odpowiedzi immunologicznej nowotworu.
Metody: W pierwszej kolejności wyizolowano linię komórkową raka mysiego TAg+ (MOV1) z samoistnego guza jajnika pobranego od 26-tygodniowej samicy DR26 Tg-MISIIR-TAg. Następnie przeprowadzono stabilną transdukcję komórek MOV1 za pomocą ssaczego wektora lentiwirusowego TurboFP635 kodującego Katushkę, dalekoczerwoną mutantkę czerwonego białka fluorescencyjnego z ukwiału Entacmaea quadricolor, z maksimami wzbudzenia/emisji przy 588/635 nm 8,9,10. Komórki MOV1Kat zaimplantowano ortotopowo do jajnika 11,12,13,14 u samic myszy Tg-MISIIR-TAg niewrażliwych na powstawanie guzów. Postęp nowotworowy monitorowano za pomocą obrazowania optycznego in vivo, a mikrośrodowisko guza analizowano metodą immunohistochemii.
Wyniki: Ortotopowo zaimplantowane komórki MOV1Kat rozwinęły surowicze guzy jajnika. Guzy MOV1Kat można było wizualizować za pomocą obrazowania in vivo do trzech tygodni po implantacji (ryc. 1); wykazywały one naciek leukocytów, co obserwuje się w przypadku ludzkich raków jajnika 15 (ryc. 2).
Wnioski: Opisujemy ortotopowy model raka jajnika, który jest odpowiedni do in vivo obrazowanie wczesnych guzów dzięki wysokiej stabilności pH oraz fotostabilności Katushki w głębokich tkankach. Proponujemy wykorzystanie tego nowego syngenicznego modelu surowczego raka jajnika do in vivo badania obrazowe oraz monitorowanie odpowiedzi immunologicznych guza i immunoterapii.
Protokół
1. Hodowla komórek
- Przed wstrzyknięciem ortotopowym hodować komórki MOV1Kat, pochodzące z guzów DR26, w kolbie T175 aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Zaplanować użycie od 1 do 5 milionów komórek na jedno wstrzyknięcie, co będzie wymagało 1 lub 2 kolb T175.
- W dniu wstrzyknięcia zebrać komórki i określić ich liczbę za pomocą hemocytometru.
- Po określeniu stężenia komórek, sfragmentować je poprzez wirowanie przez 5 minut przy 300 X g w temperaturze pokojowej.
- Po wirowaniu resuspenderować komórki, aby uzyskać 1 milion komórek w 10 µL sterylnego PBS z 0,002 M EDTA.
2. Przed operacją
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chirurgia i wstrzyknięcia ortotopowe
Ortotopowe wstrzykiwanie do kaleki jajnika wymaga przeszkolenia i precyzji. W związku z tym
- W przypadku braku doświadczenia chirurgicznego, należy najpierw poćwiczyć na preparatach zwłokowych.
- Zaleca się stosowanie samic wieloparnych (po jednym lub dwóch miotach), ponieważ z czasem rozwijają one większe jajniki, co ułatwia wstrzykiwanie i zwiększa przeżywalność w porównaniu z samicami nulliparnymi.
- Ze względu na niewielki rozm.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu NIH P01 AI 068730 (SNC, NS), grantu NIH CA016520/ TAPITMAT (NS), prywatnych funduszy fundacji Claneil Foundation (NS), grantu ovarian SPORE dla FCCC i University of Pennsylvania (P50 CA83638) oraz grantu Fox Chase Cancer Center Core Grant (P30 CA06927) (DCC). Autorzy dziękują za doskonałą pomoc techniczną Optical/Bioluminescence Core Facility pod kierownictwem dr. E.J. Delikatnego na University of Pennsylvania, Anthony'emu Secreto ze Stem Cell and Xenograft Core pod kierownictwem dr. G. Danet-Desnoyers w University of Pennsylvania Cancer Center za przeszkolenie SNC w technice wstrzykiwania ortotopowego oraz Denada Dangaj z University....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Mata grzewcza | Deltaphase | 39 DP | |
| Gaziki z powidonem | Dynarex | 1108 | |
| Gaziki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Maść z sztucznymi łzami | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Strzykawka insulinowa 3cc | BD Biosciences | 309301 | |
| Nić z igłą z kwasu poliglikolowego (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Klej tkankowy | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ zawiesina doustna | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluran | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicylina/streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Wektor ssaczy TurboFP635 | Evrogen | FP721 | |
| Kolby T175 | cellstar | 660-190 |
Bibliografia
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L.,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
