Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Podsumowanie

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Streszczenie

Syntetyczne krótkie polimery kwasów nukleinowych, oligonukleotydy (oligos), są najbardziej funkcjonalnymi i rozpowszechnionymi narzędziami biologii molekularnej. Oligonukleotydy mogą być produkowane w celu uzyskania dowolnej pożądanej sekwencji DNA lub RNA i mogą być przygotowywane z uwzględnieniem szerokiej gamy modyfikacji zasad i cukrów. Ponadto oligonukleotydy mogą być projektowane tak, aby naśladować specyficzne zmiany w kwasach nukleinowych, a tym samym mogą służyć jako istotne narzędzia do badania efektów uszkodzeń DNA i mechanizmów naprawy. Stwierdziliśmy, że zawierające RNA oligonukleotydy firmy Thermo Scientific Dharmacon o długości od 50 do 80 nukleotydów mogą być szczególnie odpowiednie do badania in vivo funkcji i konsekwencji hybryd RNA/DNA w chromosomach oraz rybonukleotydów wbudowanych w DNA. Hybrydy RNA/DNA mogą łatwo powstawać podczas replikacji, naprawy i transkrypcji DNA, jednak niewiele wiadomo o stabilności hybryd RNA/DNA w komórkach oraz o tym, w jakim stopniu hybrydy te mogą wpływać na integralność genetyczną komórek. Z tego względu oligonukleotydy zawierające RNA stanowią idealny wektor do wprowadzania rybonukleotydów do chromosomalnego DNA i generowania hybryd RNA/DNA o wybranej długości i składzie zasad. Przedstawiamy tutaj protokół inkorporacji rybonukleotydów do genomu eukariotycznego systemu modelowego drożdży /Saccharomyces cerevisiae/. Nasze laboratorium wykorzystało jednak oligonukleotydy zawierające RNA firmy Thermo Scientific Dharmacon do generowania hybryd RNA/DNA na poziomie chromosomalnym w różnych systemach komórkowych, od bakterii po komórki ludzkie.

Protokół

Uzasadnienie

Wykorzystując oligonukleotydy Thermo Scientific Dharmacon o długości od 50 do 80 merów, przedstawiamy tutaj procedurę opartą na teście korekcji genów, dzięki której oligonukleotydy mogą przenosić informacje genetyczne do genomowego DNA komórek drożdży po przyłączeniu do docelowego DNA chromosomowego. Skuteczne celowanie za pomocą oligonukleotydów ocenia się na podstawie pojawienia się kolonii drożdży wykazujących oczekiwany fenotyp. Jeśli pożądana modyfikacja genetyczna jest zawarta w jednym lub większej liczbie rybonukleotydów włączonych do sekwencji oligonukleotydu, informacja genetyczna przepływa bezpośrednio z fragmentu RNA do docelowego DNA chromosomowego, w związku z czym podczas procesu celowania na poziomie chromosomowym tworzy się hybryda RNA/DNA. Rybonukleotydy zawarte w oligonukleotydzie Thermo Scientific Dharmacon zawierającym RNA mogą służyć jako matryca do celowania genowego poprzez syntezę naprawczą DNA lub mogą zostać wbudowane w DNA i służyć jako matryca podczas replikacji DNA. W tych eksperymentach wykorzystujemy eukariotyczny model systemowy drożdży /Saccharomyces cerevisiae/; jednak podobne podejście można zastosować również u innych organizmów lub typów komórek. W tym filmie używamy oligonukleotydu Thermo Scientific Dharmacon zaprojektowanego z homologią do docelowego locus genomowego drożdży, zawierającego jeden rybonukleotyd w środku, aby skorygować mutację w docelowym genie. Po transformacji oligonukleotydem zawierającym RNA obserwujemy korekcję w miejscu docelowym z określoną częstotliwością, co wskazuje, że fragment RNA oligonukleotydu mógł zostać włączony do DNA chromosomowego i służyć jako matryca do syntezy DNA podczas replikacji DNA. Informacja genetyczna niesiona przez fragment RNA jest stabilnie przekazywana kolejnym pokoleniom komórek. Opisujemy tutaj etapy transformacji komórek drożdży za pomocą oligonukleotydu Thermo Scientific Dharmacon zawierającego RNA oraz metodę wykrywania przenoszenia informacji z RNA do DNA chromosomowego.

A. Projekt oligonukleotydu zawierającego RNA użytego w tym doświadczeniu

Zaprojektowaliśmy oligosonę zawierającą RNA w celu korekcji defektu genetycznego w chromosomalnym DNA drożdży S. cerevisiae w locus trp5. Szczep drożdży użyty w protokole zawiera zmutowany gen trp5 z delekcją dwóch zasad oraz jedną mutacją nonsensowną (Rycina 1A). Taki szczep drożdży jest mutantem auksotroficznym względem tryptofanu i nie tworzy kolonii na podłożach bez tryptofanu. Sekwencja DNA genu TRP5 jest dostępna w bazie danych Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Oligosona zawierająca RNA marki Thermo Scientific Dharmacon użyta w tym protokole jest 65-merem z 2-zasadową insercją DNA, zaprojektowaną w celu korekcji mutacji delecyjnej, oraz jednym rybonukleotydem zaprojektowanym w celu korekcji mutacji nonsensownej allelu trp5 (Rycina 1A). Sekwencja oligosony jest następująca:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Oligosona ta została zsyntetyzowana przez firmę Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) w skali 200 nM, została odsolona, odchroniona i użyta bez oczyszczania metodą PAGE.

B. Przygotowanie oligonukleotydu zawierającego RNA do transformacji drożdży (modyfikacja według Storici et al., 2007 ¹)

1. Przed rozpoczęciem prac przetrzeć roztworem do dekontaminacji RNaz materiały, które będą wykorzystane w eksperymencie, w tym probówki z oligosami, pipety, vortex, statywy, obszar roboczy oraz rękawice używane przez badacza, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia RNazami. W każdym kroku należy stosować wodę wolną od RNaz, odczynniki chemiczne, probówki i końcówki do pipet wolne od RNaz. Każdy etap tego eksperymentu musi być wolny od RNaz.
2. Otrzymane od firmy Thermo Scientific Dharmacon oligosy zawierające RNA zawiesić w wodzie wolnej od RNaz do uzyskania roztworu zapasu o stężeniu 250 pmoles/μl i energicznie wymieszać na vortexie, aby rozpuścić osad. Przechowywać w temperaturze -80°C.
3. Bezpośrednio przed transformacją rozmrozić na lodzie oligosy zawierające RNA i rozcieńczyć do stężenia 50 pmoles/μl wodą wolną od RNaz w probówkach wolnych od RNaz. Każda transformacja wymaga 1 nmole oligosów zawierających RNA.
4. Denaturować wybraną ilość oligosów zawierających RNA na bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 2 min, aby wyeliminować struktury drugorzędowe oligosów.
5. Natychmiast po denaturacji umieścić probówkę na lodzie. Przechowywać na lodzie do momentu transformacji.
6. Jako kontrolę w eksperymencie stosuje się odpowiadający im oligo składający się wyłącznie z DNA. Oligo ten należy rozmrozić z temperatury -20 °C i przygotować do transformacji w taki sam sposób jak oligo zawierający RNA, zgodnie z powyższym opisem.

C. Transformacja komórek drożdżowych z użyciem oligonukleotydu zawierającego RNA

1. Zaszczep 5 ml bogatego płynnego pożywki YPD komórkami drożdży mutant trp5 i hoduj w temperaturze 30 °C przez noc (patrz Materiały).
2. Przenieś 1,5 ml nocnej hodowli do 50 ml płynnej pożywki YPD.
3. Inkubuj komórki w wytrząsarce w temperaturze 30 °C (225 rpm) przez 4 h.
4. Przygotuj Roztwór 1 i Roztwór 2 bezpośrednio przed transformacją w probówkach wolnych od RNaz (patrz Materiały).
5. Przenieś hodowlę komórkową do 50 ml probówki wolnej od RNaz i wirowaj przy 3000 rpm, co odpowiada 1562 g, przez 2 min. Osad z precypitatu komórkowego ma objętość ok. 0,3 cm³.
6. Odlej nadsącz i przemyj komórki 50 ml wody wolnej od RNaz, a następnie wirowaj przy 3000 rpm przez 2 min.
7. Powtórz krok 6 pięciokrotnie, aby w maksymalnym stopniu usunąć pożywkę hodowlaną oraz ewentualne obecne w niej RNazy.
8. Odlej nadsącz i resuspenderuj komórki w 5 ml Roztworu 1, a następnie wirowaj przy 3000 rpm przez 2 min.
9. Odlej nadsącz i resuspenderuj komórki w 250 μl Roztworu 1. Taka ilość komórek jest wystarczająca do 7-8 transformacji.
10. Odmierz 50 μl zawiesiny komórkowej do probówek do mikrocentryfugi wolnych od RNaz, dodaj 20 μl roboczego roztworu oligo zawierającego RNA (1 nmole), lub 20 μl roboczego roztworu oligo zawierającego tylko DNA (1 nmole), lub 20 μl sterylnej wody bez oligo dla kontroli negatywnej. Następnie dodaj 300 μl Roztworu 2 dla każdej reakcji transformacji. W procesie transformacji nie ma potrzeby dodawania DNA z plemni łososia, ponieważ same oligosy pełnią rolę nośnika.
11. Wymieszaj intensywnie na wortexie, aby jednorodnie połączyć składniki.
12. Inkubuj reakcje transformacji w temperaturze 30 °C przez 30 min w wytrząsarce.
13. Wykonaj szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 15 min.
14. Odwirowuj komórki przy 5000 rpm, co odpowiada 2236 g, przez 4 min.
15. Odlej nadsącz i resuspenderuj komórki w 100 μl sterylnej wody.
16. Pobierz aliquot tej zawiesiny komórkowej, rozcieńcz go sterylną wodą 100 000 razy i wysiej komórki na jednej płytce YPD, używając ok. 15 sterylnych szklanych kulek, a następnie inkubuj w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
17. Wysiej wszystkie resuspenderowane komórki z każdej reakcji transformacji na jedną płytkę Petri z syntetycznej stałej pożywki kompletnej bez tryptofanu (SC-Trp), używając ok. 15 sterylnych szklanych kulek, i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 4-5 dni (Rysunek 2).

D. Analiza korekcji genu za pomocą oligonukleotydu zawierającego RNA

1. Policz liczbę kolonii wyrosłych na podłożu selektywnym (Rysunek 2) oraz na podłożu YPD, aby obliczyć częstotliwość korekcji genu dla oligo zawierającego RNA, oligo zawierającego tylko DNA oraz dla kontroli bez oligo. Porównaj otrzymane wartości. Stopień spontanicznej rewersji alleli trp5 z delecjami dwóch zasad oraz mutacją nonsensowną wynosi mniej niż 10-9 w użytym szczepie drożdży, zatem w przypadku nie dodania oligo do komórek nie spodziewamy się powstania kolonii na podłożu selektywnym.
2. Wysewuj kilka losowo wybranych kolonii transformantów na podłoże YPD, aby uzyskać izolaty pojedynczych kolonii. Odczekaj dwa dni do wzrostu kolonii, następnie pobierz kilka (co najmniej 5) pojedynczych kolonii i wykonaj paski na podłożu YPD oraz na podłożu selektywnym.
3. Zaprojektuj parę starterów do amplifikacji regionu (250-1 000 bp) targetowanego przez oligo zawierające RNA za pomocą colony PCR (Rysunek 1B). Procedura colony PCR przebiega następująco (modyfikacja według Storici i Resnick, 2006 ²):
   1. Resuspenduj komórki (ok. 1 mm3) pobrane z poszczególnych pasków w 50 μl wody i dodaj 1 jednostkę litykazy. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie inkubuj w bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 5 min, aby rozbić komórki i uwolnić genomiczne DNA do roztworu.
   2. Warunki PCR: Reakcja PCR obejmuje 10 μl roztworu resuspensji komórek, po 50 pmoli starterów forward i reverse, 1 μl dNTPs 10 mM, 1 jednostkę polimerazy Taq, 5 μl buforu 10x i jest uzupełniona sterylną wodą do końcowej objętości 50 μl. Program PCR to 3 min w 95 °C; 30 cykli: 30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C i 1 min w 72 °C; końcowy czas elongacji 7 min w 72 °C; następnie próbki są przechowywane w 4 °C. Dla tej reakcji przyjęto czas elongacji 1 min/kb.
   3. Po wykonaniu PCR próbki są rozdzielane na żelu agarozowym 1% lub 2% (w zależności od oczekiwanej wielkości produktu PCR), aby zaobserwować produkt PCR (Rysunek 3).
4. Jeśli informacja genetyczna przeniesiona przez oligo zawierające RNA tworzy nową stronę restrykcyjną w genomicznym regionie docelowym drożdży (Rysunek 1B), możliwe jest zweryfikowanie poprawnego przeniesienia informacji poprzez trawienie produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym. Jeśli oligo zawierające RNA nie tworzy strony restrykcyjnej, przejdź do kroku 6. Przetraw produkty PCR za pomocą specyficznego enzymu restrykcyjnego. Reakcja trawienia obejmuje 6 μl produktu PCR, bufor, BSA (może nie być wymagane dla niektórych enzymów, patrz instrukcja do użytego enzymu), 0,5 μl enzymu restrykcyjnego i sterylną wodę do objętości 15 μl. Próbki inkubuje się przez 1 h w temperaturze specyficznej dla użytego enzymu.
5. Rozdziel nieprzetrawioną próbkę wraz z próbkami przetrawionymi w tym samym rzędzie żelu agarozowego 2%, aby zaobserwować modyfikację genetyczną przeniesioną przez fragment RNA oligo zawierającego RNA (Rysunek 3).
6. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i przygotuj je do sekwencjonowania DNA. Przekaż próbki do sekwencjonowania z użyciem tych samych starterów, które służyły do amplifikacji produktu.
7. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania DNA przy użyciu oprogramowania umożliwiającego dopasowanie wielu sekwencji do wybranej sekwencji referencyjnej (Rysunek 4).

E. Obróbka zasadowa oligonukleotydu zawierającego RNA (Rycina 5)

1. Do każdej reakcji, w probówce o pojemności 1,5 ml, dodać 1 nmole (4 μl roztworu zapasowego o stężeniu 250 pmoles/μl) oligonukleotydu zawierającego RNA lub oligonukleotydu DNA.
2. Dodać 4 μl 1 M NaOH w celu przeprowadzenia hydrolizy lub alternatywnie dodać 4 μl H₂O jako kontrolę negatywną i inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 65° C przez 1 h. Następnie przenieść z kąpieli wodnej na lód.
3. Zneutralizować dodając 2 μl 1,2 M HCl, 4 μl 1 M Tris-HCl oraz 4 μl H₂O lub alternatywnie 6 μl H₂O i 4 μl 1 M Tris-HCl w przypadku kontroli negatywnej. Przechowywać na lodzie do momentu transformacji.

Rysunek 1. Schematyczna budowa uszkodzonego genu trp5 oraz allela TRP5 skorygowanego za pomocą oligonukleotydu zawierającego RNA. A) Zmutowany gen trp5 zawiera delecję 2 zasad (czarne trójkąty) oraz nonsensowną mutację 1 zasady (gwiazdka). Jednoniciowy oligonukleotyd zawierający RNA z insercją 2 zasad (niebieska pętla) i substytucją 1 zasady RNA (czerwony prostokąt), tworzącą miejsce rozpoznawania dla enzymu restrykcyjnego Van91I (oznaczone nawiasem), jest transformowany do komórek drożdży w celu korekcji defektów genetycznych genu trp5. B) Po naprawie genu TRP5 za pomocą oligonukleotydu zawierającego RNA (skorygowane zasady zaznaczono niebieskimi prostokątami), w genie TRP5 powstaje miejsce Van91I. Fragment o długości 278 bp, zawierający tylko jedno miejsce restrykcyjne Van91I w genie TRP5, jest amplifikowany metodą PCR przy użyciu pary starterów (P1 i P2). Przedstawiono również fragmenty o długości 177 bp i 101 bp, powstałe po trawieniu produktu PCR P1 i P2 enzymem Van91I.

Rycina 2. Wynik transformacji z użyciem oligo zawierającego RNA. A) Komórki drożdży transformowane bez użycia oligo nie tworzą żadnych kolonii na podłożu SC-Trp, patrz szalki a-b. B) Szalki c-g przedstawiają kolonie drożdży rosnące na SC-Trp po transformacji komórek 1 nmole oligo zawierającego RNA. C) Szalki h-l przedstawiają kolonie drożdży rosnące na SC-Trp po transformacji komórek 1 nmole odpowiadającego kontrolnego oligo składającego się wyłącznie z DNA.

Rysunek 3. Wykrywanie transferu informacji genetycznej z oligo zawierającego RNA do chromosomalnego DNA drożdży poprzez trawienie restrykcyjne produktu PCR amplifikującego docelowy region genomiczny. Elektroforeza w 2% żelu agarozowym próbek PCR amplifikowanych za pomocą P1 i P2 i trawionych enzymem restrykcyjnym Van91I. Ścieżki 1, 8 i 15, drabinka DNA z zaznaczonymi po lewej stronie rozmiarami 100, 200, 300, 400 i 500 bp; ścieżka 2, produkt PCR locus trp5 amplifikowany z DNA genomicznego szczepu mutant trp5; ścieżka 3, produkt PCR amplifikowany z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii Trp+ targetowanej przez oligo zawierające tylko DNA; ścieżki 4-7, produkty PCR amplifikowane z DNA genomicznego pochodzącego z kolonii Trp+ targetowanych przez oligo zawierające RNA; ścieżki od 9 do 14, trawienie restrykcyjne enzymem Van91I produktów PCR ze ścieżek od 2 do 7. Obecność prążków nietrawionego produktu PCR w ścieżkach 10 do 14 można wyjaśnić częściowym trawieniem przez Van91I w locus TRP5 (CCACATTCTGG). Biorąc pod uwagę, że miejsce cięcia dla Van91I (CCANNNN NTGG) może mieć wiele sekwencji, miejsce wygenerowane w TRP5 może nie być optymalnym celem dla enzymu. W rzeczywistości, po sekwencjonowaniu wszystkich powyższych produktów PCR nie wykryto żadnych dodatkowych zmian poza tymi wprowadzonymi przez oligo (patrz Rysunek 4). Prążek PCR o rozmiarze 278 bp amplifikowany przez primery P1 i P2 oraz prążki produktów trawienia przez Van91I o rozmiarach 177 bp i 101 bp są wskazane strzałkami po prawej stronie.

Rycina 4. Wyniki sekwencjonowania DNA wykazujące korekcję genu za pomocą oligo zawierającego RNA. A) Elektroferogram DNA regionu genomowego będącego celem oligo zawierającego RNA. G w sekwencji DNA (niebieska ramka) pochodzi z rG w oligo zawierającym RNA. Zaznaczono również ramką insercję zasad CG. Wyniki sekwencjonowania wszystkich pozostałych produktów PCR są równie wyraźne, a sygnały fluorescencyjne znajdują się znacznie powyżej poziomu tła. B) Sekwencje regionu TRP5 transformantów Trp+ będących celem oligo zawierającego tylko DNA (T1) oraz oligo zawierającego RNA (T2-T5) są zgodne z sekwencją konsensusu na górze i zostały porównane z sekwencją komórek mutantów trp5 przed celowaniem oligonukleotydami (DNA genomowe, czerwone tło). Naprawcze oligo zawierające RNA na dole posiada dwuzasadową insercję DNA oraz jednobazową (G) substytucję RNA zaznaczoną na czerwono. Regiony w niebieskich ramkach z żółtym tłem pokazują, że oligo zawierające RNA, jak i oligo zawierające tylko DNA, precyzyjnie skorygowały mutację delecyjną oraz mutację nonsensowną we wszystkich badanych próbkach. Linie przerywane wyznaczają pozycję sekwencji oligo zawierającego RNA. Prosz kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

Rysunek 5. Obróbka zasadami zapobiega korekcji genu przez oligo zawierające RNA. Częstotliwość transformacji przy użyciu oligo zawierającego RNA (R) przedstawiono na czerwonym słupku, a przy użyciu oligo zawierającego tylko DNA (D) na niebieskich słupkach. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej dla 3 niezależnych transformacji dla każdego oligo. Oligo zawierające tylko DNA wykazuje podobną częstotliwość transformacji bez i z zastosowaniem obróbki NaOH. W przeciwieństwie do tego, częstotliwość transformacji przy użyciu oligo zawierającego RNA spada do 0 po obróbce NaOH. Zatem preparat z oligo zawierającym RNA nie jest zanieczyszczony oligo zawierającym tylko DNA, zatem zaobserwowana częstotliwość transformacji jest specyficzna dla oligo zawierającego RNA.

Dyskusja

Fakt, że RNA może przekazywać informacje genetyczne bezpośrednio do genomowego DNA w komórkach, odkryto dzięki zastosowaniu syntetycznych oligosów zawierających RNA (oligosy zsyntezowane przez Dharmacon) ¹. Stanowiło to dowód koncepcji, że komórki mogą wykorzystywać cząsteczki zawierające RNA lub sekwencje złożone wyłącznie z RNA jako matryce do syntezy DNA. Zastosowanie oligosów zawierających RNA doprowadziło nie tylko do wykazania, że informacje genetyczne mogą być przekazywane bezpośrednio z RNA do genomowego DNA bez konieczności tworzenia pośredniej kopii DNA odwrotnej transkrypcji, ale także do udowodnienia, że RNA może służyć jako matryca homologiczna w naprawie uszkodzeń DNA ^1,3. Oligosy mogą składać się wyłącznie z RNA lub zawierać tylko jeden rybonukleotyd wbudowany w sekwencję DNA, jak w przedstawionym tutaj przykładzie. Oligo zawierający RNA posiada jeden wbudowany rybonukleotyd zaprojektowany w celu korekcji mutacji nonsensownej w wadliwym allelu genomowym trp5. Przeniesienie informacji genetycznej z rybonukleotydu do genomowego DNA objawia się zmianą fenotypu (wzrost komórek na pożywce pozbawionej tryptofanu) w komórkach docelowych. Częstość korekcji genu uzyskaną za pomocą oligo zawierającego RNA jest mierzona i porównywana z częstością dla kontrolnego oligo złożonego wyłącznie z DNA. Przeprowadzając ten test korekcji genów w różnych tłach komórkowych, w których mutujemy różne geny drożdży, możemy wykryć, który czynnik lub czynniki specyficznie wpływają na celowanie oligosów zawierających RNA. W ten sposób możemy odkryć mechanizmy, za pomocą których komórki regulują stabilność hybryd RNA/DNA. Poprzez projektowanie różnych wariantów oligosów zawierających RNA możemy określić prawdopodobieństwo, że dany odcinek RNA posłuży jako matryca w modyfikacji DNA, a także określić stabilność specyficznych sekwencji RNA wbudowanych w DNA. Co więcej, możemy zidentyfikować, jakie są preferowane substraty in vivo dla czynników oddziałujących z hybrydami RNA/DNA.

Choć przeprowadzono kilka badań in vitro, wykorzystujących głównie krótkie oligonukleotydy zawierające RNA, w celu scharakteryzowania funkcji czynników zdolnych do rozpoznawania RNA w hybrydzie z DNA, takich jak enzymy RNaza H ⁴, funkcje in vivo RNaz H, a także tożsamość innych białek, które mogłyby wpływać na stabilność hybrydy RNA/DNA, pozostają w większości nieznane. Możliwość wykorzystania oligonukleotydów zawierających RNA o znacznej długości (50 do 80-merów) i optymalnej jakości (takich jak oligonukleotydy zawierające RNA firmy Thermo Scientific Dharmacon) otworzyła drogę do badania szerokiego zakresu procesów molekularnych bezpośrednio in vivo w wybranych komórkach. Jak pokazano w tym filmie, transformacja z użyciem oligonukleotydów zawierających RNA wymaga w zasadzie tylko kilku dodatkowych kroków w porównaniu z transformacją za pomocą cząsteczek DNA, aby zapobiec degradacji przez RNazy. Zatem transformacja z użyciem oligonukleotydów zawierających RNA nie ogranicza się do systemu drożdżowego, lecz może być zastosowana w każdym organizmie lub typie komórek, w których transformacja za pomocą oligonukleotydów DNA jest efektywna.

Podsumowując, celowanie w komórki za pomocą oligosów zawierających RNA daje możliwość generowania hybryd RNA/DNA oraz rybonukleotydów wbudowanych w DNA in vivo w komórkach. Stabilność, funkcję i konsekwencje tych wygenerowanych in vivo hybryd RNA/DNA można analizować i charakteryzować, co potencjalnie pozwala na odkrycie nieznanych mechanizmów naprawy DNA oraz ujawnienie nowych strategii celowania w geny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Odczynniki i pożywki do transformacji (zmodyfikowane na podstawie Storici i Resnick, 2006
YPD (Yeast Peptone Dextrose): Na 1 L: 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu sojowego, 20 g dekstrozy. Do sporządzenia stałej pożywki YPD dodać 15 g agaru. Autoklawować przed użyciem. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór 1: 0,1 M octanu litu. Przygotować bezpośrednio przed transformacją. Roztwór 1 jest roztworem roboczym, dlatego przygotowuje się go bezpośrednio z proszku. Nie sporządza się roztworu zapasowego. Przechowywać w temperaturze pokojowej. LiAc zwiększa przepuszczalność ściany komórkowej drożdży dla DNA. Roztwór 2: 0,1 M octanu litu i 50% glikolu polietylenowego 4000. Roztwór 2 jest również roztworem roboczym i przygotowuje się go bezpośrednio z proszku. Nie sporządza się roztworu zapasowego. Przechowywać w temperaturze pokojowej. PEG wspomaga osadzanie się oligonukleotydów na komórkach drożdży. Oligonukleotydy zawierające RNA (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mery, odsolone, odchronione i nieoczyszczone. Resuspendować do stężenia 250 pmoles/μl. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Oligonukleotydy zawierające tylko DNA, 50-80-mery, odsolone i nieoczyszczone. Resuspendować do stężenia 50 pmoles/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Stała pożywka SC-Trp (syntetyczna pożywka kompletna pozbawiona tryptofanu). Szklane koraliki o średnicy 0,5 cm, wysterylizowane w autoklawie. RNase-off: roztwór do dekontaminacji z RNaz. Sterylne probówki do wirowania, wolne od DNaz i RNaz. Sterylne probówki stożkowe, wolne od DNaz i RNaz. Sterylne końcówki do pipet z filtrem ZAP, wolne od DNaz i RNaz: 1-200 µL, 100-1000 µL.
B. Materiały do colony PCR.
Startery DNA, odsolone i nieoczyszczone. Rozpuścić w sterylnej wodzie do stężenia 50 pmoles/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Polimeraza DNA Taq, bufor, dNTPs. Probówki do PCR.
C. Oczyszczanie produktów PCR.
Zestaw do oczyszczania PCR.
D. Elektroforeza w żelu.
Agaroza. 1 x bufor do elektroforezy TBE (45 mM Tris-boranu i 1 mM etylenodiaminotetraoctanu) rozcieńczony z 10x TBE. Prefabrykowany marker masy cząsteczkowej. Barwnik do nakładania DNA.
E. Trawienie restrykcyjne.
Enzymy restrykcyjne, bufory 10x, BSA.
F. Obróbka alkaliczna oligonukleotydu zawierającego RNA.
1 M roztwór NaOH. 1,2 M roztwór HCl. 1 M roztwór Tris-HCl, pH 7,4.