Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Streszczenie

Większość form życia wykazuje rytmy dobowe w zjawiskach komórkowych, fizjologicznych i behawioralnych, które są sterowane przez endogenne rozruszniki lub zegary okołodobowe (≡24 hr). Zaburzenia w ludzkim systemie okołodobowym wiążą się z licznymi chorobami lub schorzeniami. Znaczny postęp w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw rytmów okołodobowych dokonano dzięki przesiewom genetycznym, w których łatwo mierzalny rytm behawioralny służy jako wskaźnik funkcji zegara. Badania z wykorzystaniem Drosophila wniosły fundamentalny wkład w nasze zrozumienie komórkowych i biochemicznych podstaw rytmów okołodobowych. Standardowym wskaźnikiem behawioralnym mierzonym u Drosophila jest aktywność lokomotoryczna. Generalnie system monitorujący obejmuje specjalnie zaprojektowane urządzenia, które mogą mierzyć ruchy lokomotoryczne Drosophila. Urządzenia te są umieszczone w inkubatorach z kontrolowanym środowiskiem, znajdujących się w ciemni, i opierają się na wykorzystaniu przerwania wiązki światła podczerwonego do rejestracji aktywności lokomotorycznej pojedynczych much zamkniętych w małych probówkach. W pomiarach prowadzonych przez wiele dni Drosophila wykazują dobowe cykle aktywności i nieaktywności, czyli rytm behawioralny sterowany przez endogenny system okołodobowy zwierzęcia. Cała procedura została uproszczona dzięki pojawieniu się komercyjnie dostępnych urządzeń do monitorowania aktywności lokomotorycznej oraz opracowaniu programów komputerowych do analizy danych. Stosujemy system firmy Trikinetics Inc., który jest opisany w niniejszej procedurze i obecnie stanowi najpopularniejszy system wykorzystywany na całym świecie. W ostatnim czasie te same urządzenia monitorujące zostały wykorzystane do badania zachowań związanych ze snem u Drosophila. Ponieważ dobowe cykle czuwania i snu wielu much można mierzyć jednocześnie, a zazwyczaj wystarczy od 1 do 2 tygodni ciągłych danych o aktywności lokomotorycznej, system ten jest idealny do wielkoskalowych przesiewów w celu zidentyfikowania osobników Drosophila wykazujących zmienione właściwości okołodobowe lub związane ze snem.

Protokół

Ogólny schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. W pierwszej kolejności należy przygotować układ do monitorowania aktywności lokomotorycznej z wykorzystaniem urządzeń umieszczonych w inkubatorach z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi, znajdujących się w ciemni. Po zakończeniu tego etapu system może być wykorzystywany we wszystkich kolejnych pomiarach rytmów aktywności lokomotorycznej. W każdym eksperymencie należy (i) przygotować zwierzęta doświadczalne, co może obejmować wytwarzanie zwierząt transgenicznych lub przeprowadzenie niezbędnych krzyżówek, (ii) przygotować szklane probówki do monitorowania aktywności zawierające źródło pokarmu, (iii) umieścić muchy w probówkach i podłączyć monitory aktywności do systemu zbierania danych oraz (iv) zarejestrować i przeanalizować dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, w zależności od tego, jakie parametry okołodobowe lub parametry snu mają zostać zbadane. W niniejszym protokole za „początek” eksperymentu uznaje się moment, w którym muchy w urządzeniach monitorujących zostają po raz pierwszy poddane pożądanym warunkom oświetlenia/ciemności w inkubatorach środowiskowych.

1. Konfiguracja systemu monitorowania aktywności lokomotorycznej

1. System monitorowania obejmuje liczne elementy wyposażenia, takie jak specjalistyczne urządzenia monitorujące, inkubatory środowiskowe z możliwością kontroli cyklu dobowego światła, urządzenia do zbierania danych, komputery oraz materiały peryferyjne, takie jak okablowanie służące do połączenia urządzeń monitorujących z urządzeniami do zbierania danych (Rycina 2). Instrukcje dotyczące instalacji Muszka owocówka Systemy gromadzenia danych do monitorowania aktywności (DAM) są dostarczane przez producenta (Trikinetics Inc.).
2. W celu pomieszczenia systemu monitorowania aktywności lokomocyjnej należy wybrać dobrze wentylowane pomieszczenie, najlepiej wyposażone w system kontroli temperatury, które będzie służyć jako dedykowana ciemnia. Ze względu na to, że wszystkie zaangażowane systemy elektryczne (np. komputer i inkubatory) pracują przez dłuższy czas w małym, zamkniętym pomieszczeniu, może dojść do generowania nadmiernego ciepła, co prowadzi do szybkiego wzrostu temperatury w pomieszczeniu. W konsekwencji inkubatory zostaną obciążone dodatkową pracą w celu utrzymania temperatury, co zwiększa prawdopodobieństwo zakłóceń w jej kontroli. Stwierdzono, że nawet w dobrze wentylowanych pomieszczeniach przejście z klimatyzacji latem na ogrzewanie jesienią i zimą może utrudnić utrzymanie stałej temperatury otoczenia. W takich przypadkach w ciemni może być konieczny montaż dodatkowej wentylacji, aby zmniejszyć ryzyko przegrzania. Zaleca się również wyłączanie nieużywanych inkubatorów w celu zminimalizowania emisji zbędnego ciepła.
3. Należy odizolować pomieszczenie od zewnętrznych źródeł światła. Wejście można zabezpieczyć za pomocą drzwi obrotowych lub czarnej zasłony. Zalecamy stosowanie drzwi obrotowych, ponieważ minimalizują one ryzyko przedostania się niepożądanego światła do ciemni. Wewnątrz ciemni nie jest konieczne pracę w całkowitej ciemności, ponieważ system okołodobowy muszek owocowych nie jest wrażliwy na światło podczerwone (a znacznie mniej wrażliwy na światło czerwone w porównaniu do światła zielonego/niebieskiego). W sytuacjach, w których musimy widzieć w ciemni, ale chcemy zachować ogólną ciemność (np. podczas szybkiego wyjmowania lub dodawania urządzenia monitorującego do inkubatora znajdującego się w fazie ciemnej), używamy zwykłej latarki z czerwonym filtrem. Alternatywnie lub dodatkowo, jeśli w ciemni znajdują się lampy fluorescencyjne, należy zakryć je czerwonym papierem filtrującym lub zastosować osobną lampkę biurkową z żarówką wolframową, również zakrytą takim papierem. Jest mało prawdopodobne, aby wystawienie much w ciemności na bardzo krótkotrwałe (kilkusekundowe) działanie światła czerwonego wpłynęło na ich zegary okołodobowe. Ponadto, choć system okołodobowy Muszka owocówka jest bardzo wrażliwa na światło widzialne, dlatego uważamy, że niewielkie szczeliny, przez które wpada światło do ciemni, nie będą miały istotnego znaczenia; w każdym razie dobrą praktyką jest otwieranie drzwi inkubatora, w którym znajdują się monitory, wyłącznie w razie potrzeby. Ponadto należy otwierać tylko jeden inkubator naraz, aby zminimalizować ryzyko naświetlenia inkubatora znajdującego się w fazie ciemnej światłem z inkubatora w fazie jasnej.
4. Należy zakupić zasilacz awaryjny UPS (Uninterrupted Power Supply) o wystarczającej mocy, aby zasilić komponenty systemu monitorowania aktywności w przypadku przepięć, skoków napięcia lub awarii zasilania w budynku. Zasilacz UPS należy podłączyć do obwodu zasilania awaryjnego budynku, jeżeli taki jest dostępny. Należy mieć na uwadze, że nawet jeśli sprzęt jest podłączony do gniazda awaryjnego, podczas przerwy w dostawie prądu może wystąpić krótki okres przejściowy w momencie przełączania systemu na zasilanie awaryjne. W czasie tego przejścia utrata zasilania nawet przez kilka sekund może doprowadzić do wyłączenia komputerów i zgaśnięcia świateł w inkubatorze. Dlatego ważne jest, aby komputery służące do gromadzenia danych o aktywności oraz system sterujący oświetleniem w inkubatorze były podłączone nie tylko do zasilania awaryjnego, ale również do zasilacza UPS. Jeśli system sterujący oświetleniem w inkubatorze nie jest regulowany bezpośrednio przez inkubator (co ma miejsce w większości przypadków), wystarczy podłączyć inkubator do zasilania awaryjnego bez UPS, ponieważ kilkusekundowa przerwa w dostawie prądu nie wpłynie na temperaturę w komorze. Należy zauważyć, że ogólnie urządzenie UPS podtrzymuje pracę sprzętu jedynie przez 5–30 min w przypadku braku zasilania; jego głównym celem jest ochrona przed tymczasową utratą prądu podczas przejścia z zasilania sieciowego na awaryjne.
5. Skonfiguruj komputer (PC lub Macintosh) przeznaczony wyłącznie do gromadzenia danych i/lub sterowania oświetleniem inkubatorów. Ponieważ system DAM będzie pracował w trybie ciągłym i bez nadzoru, zaleca się, aby komputer ten miał zainstalowane minimalne oprogramowanie, a najlepiej nie posiadał połączenia z siecią w celu zminimalizowania ryzyka awarii. Ponadto system wymaga przenośnego nośnika danych, np. dysku Zip, nagrywarki CD/DVD lub pamięci USB, aby umożliwić pobieranie zgromadzonych danych do późniejszej analizy.
6. Ręcznie i starannie ułóż sieć linii telefonicznych wokół półek w inkubatorach z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi, aby umożliwić łatwe podłączanie i odłączanie monitorów aktywności. Można wykorzystać standardowe linie telefoniczne, adaptery i rozdzielacze zakupione w sklepach z elektroniką. Zainstaluj wiele linii telefonicznych w taki sposób, aby zbiegały się one w jedną główną linię i prowadziły na zewnątrz inkubatora, by połączyć się z komputerem.
7. Podłącz urządzenia monitorujące znajdujące się wewnątrz inkubatorów do komputera za pomocą jednostki interfejsu zasilania (znanej jako Blue box firmy Trikinetics Inc.), która służy do zasilania monitora aktywności (Trikinetics Inc.) poprzez linię telefoniczną. Jednostka interfejsu zasilania pełni również rolę interfejsu do przesyłania danych, przełączając sygnał z linii telefonicznej na kabel USB. Opcjonalny kontroler światła w tej samej jednostce, do którego można podłączyć przewód zasilający system oświetlenia inkubatora, umożliwia sterowanie harmonogramem oświetlenia okołodobowego inkubatora za pomocą komputera.
8. Zasłoń potencjalne źródła światła z diod LED urządzenia elektronicznego lub uszczelnij nieszczelności w drzwiach inkubatora za pomocą taśmy naprawczej lub czarnej tkaniny, aby zapewnić pomiar rytmów swobodnych w warunkach braku niepożądanego światła.

2. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych

1. Fenotypy behawioralne u muszek owocówek, takie jak rytm okołodobowy oraz aktywność związana ze snem i spoczynkiem, są bardzo wrażliwe na różnice genotypowe i wiekowe badanych zwierząt (Koh et al. 2006). Dlatego kluczowe jest ocenianie tych fenotypów przy użyciu odpowiednich zwierząt kontrolnych, które są hodowane w tych samych warunkach środowiskowych i są w tym samym wieku. Ponadto w rytmie okołodobowym występuje dymorfizm płciowy (Helfrich-Föster 2000). Powszechną praktyką w badaniach aktywności lokomotorycznej jest stosowanie dorosłych samców muszek hodowanych w 25°C w wieku od 1 do 5 dni. Samce są tradycyjnie używane zamiast samic, ponieważ aktywność związana ze składaniem jaj wpływałaby na prawdziwy pomiar aktywności lokomotorycznej. Ze względu na dymorfizm płciowy, badanie samic może być niekiedy informacyjne. Pożywka składająca się z 5% sacharozy i 2% agaru bacto zapobiegnie rozwojowi jaj niedziewiczych samic oraz przemieszczaniu się wyklutych larw, co mogłoby spowodować błędne odczyty aktywności. Alternatywnie można zastosować dziewicze samice, choć mogą występować różnice w profilach aktywności między samicami kopulowanymi a dziewiczymi (Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000).
2. Podczas badania parametrów okołodobowych i snu/spoczynku u konkretnych, interesujących badacza mutantów, zaleca się krzyżowanie wsteczne linii mutantów z linią typu dzikiego o tym samym tle genetycznym, np. w1118 lub yw. Pozwoli to wyeliminować genetyczne modyfikatory z drugiego locus, które mogłyby potencjalnie maskować fenotyp okołodobowy lub sen/spoczynek. Ponieważ u samców Drosophila nie zachodzi crossing-over, lepiej jest przeprowadzić krzyżowanie wsteczne poprzez krzyżowanie samic mutantów z samcami typu dzikiego. Linia typu dzikiego będzie również służyć jako odpowiednia kontrola dla eksperymentu. Zarówno kontrolne muchy typu dzikiego, jak i mutanty należy zasiać w tym samym czasie na standardowej pożywce dla Drosophila około 10 do 14 dni przed eksperymentem dotyczącym rytmu aktywności lokomotorycznej (przepis na pożywkę dostępny w Bloomington Drosophila Stock Center; http://flystocks.bio.indiana.edu/). Po wyjściu z poczwarki potomstwa należy zebrać samce w wieku od 1 do 5 dni i odstawić je do wykorzystania w eksperymentach.
3. Dzięki licznym narzędziom i zasobom genetycznym, takim jak linie much z nadekspresją, RNAi oraz tkankowo-specyficznymi sterownikami GAL4 dostępnymi w różnych centrach zasobów na całym świecie, możliwe jest badanie efektów nadekspresji lub wyciszania specyficznych genów w sposób tkankowo- i czasowo-specyficzny (Brand and Perrimon 1993; McGuire et al. 2004; Osterwalder et al. 2001). Aby zbadać parametry okołodobowe i snu/spoczynku za pomocą tego podejścia, muchy niosące konstrukty transgeniczne z tkankowo-specyficznym lub indukowanym lekiem sterownikiem GAL4 (np. samce) krzyżuje się z muchami niosącymi konstrukty transgeniczne z genami docelowymi przyłączonymi do respondera UAS (np. dziewicze samice) około 14 dni przed rozpoczęciem eksperymentów nad aktywnością lokomotoryczną. Po wyjściu z poczwarki potomstwa należy zebrać samce w wieku od 1 do 5 dni i odstawić je do wykorzystania w eksperymentach. Linie rodzicielskie użyte do krzyżowania są rutynowo stosowane jako kontrole w eksperymentach. Odpowiednimi kontrolami są również potomstwa z krzyżówek linii respondera UAS i sterownika GAL4 z muchami typu dzikiego o tym samym tle genetycznym.
4. Jak wskazano w krokach (2) i (3), czas potrzebny na przygotowanie zwierząt eksperymentalnych różni się znacznie w zależności od charakteru i projektu eksperymentu. W przypadku, gdy konieczne jest wygenerowanie zwierząt transgenicznych lub wykonanie schematów krzyżowania, oczywiście potrzeba będzie więcej czasu. Z powodów logistycznych rozwój Drosophila od stadium jaja do dorosłej muchy w 25°C trwa około 14 dni.

3. Przygotowanie probówek do pomiaru aktywności

1. Probówki do testów aktywności stanowią siedlisko dla much podczas eksperymentu. Są to cienkie (średnica ok. 5 mm; należy zauważyć, że firma Trikinetics oferuje różne rozmiary w zależności od badanego gatunku Drosophila) szklane probówki o długości 5 mm, które na jednym końcu zawierają pożywkę, a na drugim są zamknięte za pomocą sznurka lub plastikowym korkiem. Ponieważ szklane probówki do testów aktywności mogą być wielokrotnie używane, opiszemy procedury przygotowawcze, przyjmując za punkt wyjścia zużyte/nieoczyszczone probówki z poprzednich eksperymentów. W przypadku korzystania z nowych probówek należy przejść bezpośrednio do kroku (11).
2. Zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych probówek, ponieważ pożywka w ich wnętrzu ma tendencję do wysychania i z czasem ulega zanieczyszczeniu grzybami, nawet przy przechowywaniu w temperaturze 4°C. Zazwyczaj są one przygotowywane od kilku dni do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu. Dlatego ważne jest określenie liczby probówek potrzebnych do każdego doświadczenia przed ich przygotowaniem.
3. Wyjąć korki (sznurkowe lub plastikowe) z używanych probówek i umieścić je w dużym szklanym zlewce. Probówki powinny wypełniać zlewkę maksymalnie do połowy. Nalać do zlewki wodę z kranu, upewniając się, że probówki są całkowicie zanurzone.
4. Podgrzewać zlewkę z szklanymi probówkami w kuchence mikrofalowej, aż woda zacznie gwałtownie wrzeć, aby roztopić wosk i pożywkę agarową.
5. Należy zachować ostrożność, ponieważ woda jest gorąca. Wyjąć zlewkę z kuchenki mikrofalowej i zamieszać probówki za pomocą szpatułki lub plastikowej pipety 10 mL, aby uwięziony wosk wypłynął na powierzchnię. Następnie powtórzyć krok (4).
6. Wyjąć zlewkę z kuchenki mikrofalowej i poczekać, aż ostygnie. Umieszczenie zlewki w pomieszczeniu chłodniczym (jeśli jest dostępne) przyspieszy ten proces.
7. W miarę stygnięcia wody wosk zbierze się na jej powierzchni i stopniowo zetnie. Zestniały wosk należy po prostu usunąć ręcznie. Pozwoli to pozbyć się większości wosku z probówek.
8. Przenieść probówki do nowej zlewki ze świeżą wodą z kranu i powtórzyć kroki (4) i (5).
9. Ponieważ większość wosku została usunięta w kroku (7), nie trzeba czekać na jego zastygnięcie. Wystarczy wylać wodę ze zlewki i przenieść probówki do kolejnej nowej zlewki. Należy pamiętać, że woda jest nadal gorąca.
10. Powtórzyć kroki (4) i (5) po raz ostatni. Wylać wodę ze zlewki i odczekać, aż probówki ostygną.
11. Umieścić je pionowo w szklanych zlewkach o pojemności 250 mL lub 500 mL. Należy upewnić się, że nie są one upakowane zbyt ciasno. Sterylizować je w autoklawie w cyklu suchym lub po prostu wysuszyć w suszarce laboratoryjnej.
12. Oddzielnie, w celu przygotowania pożywki do napełnienia probówek, przygotować roztwór 5% sacharozy (Sigma) i 2% agaru Bacto (BD) w wodzie destylowanej lub wodzie z kranu. Roztwór należy wysterylizować w autoklawie. Sterylna pożywka może być użyta natychmiast lub przechowywana w temperaturze 4°C przez dłuższy czas. Po zastygnięciu pożywki będzie konieczne jej roztopienie w kuchence mikrofalowej w celu napełnienia probówek. Niewykorzystaną część pożywki można przechowywać i użyć w późniejszym terminie.
13. Pożywka podczas napełniania probówek powinna mieć idealnie temperaturę około 65°C. Jeśli będzie zbyt gorąca, wewnątrz probówek skropli się zbyt dużo wody. Jeśli nie będzie wystarczająco gorąca, pożywka zastygnie przed równomiernym wypełnieniem probówek. Aby napełnić probówki pożywką, użyć pipety 10 mL do naniosienia płynnego roztworu pożywki wzdłuż wewnętrznej ścianki szklanej zlewki, pozwalając pożywce wypełniać probówki od dołu, aż zostaną wypełnione w jednej trzeciej ich objętości. Delikatnie zakręcić zlewką, aby upewnić się, że wszystkie probówki, zwłaszcza te w środku zlewki, są równomiernie wypełnione roztworem pożywki. Odczekać do całkowitego zastygnięcia pożywki w temperaturze pokojowej lub w 4°C. Przejść do następnego kroku po ustąpieniu kondensacji wewnątrz szklanych probówek.
14. Aby wyjąć probówki ze zlewki, należy pchnąć je w stronę dna zlewki i jednocześnie skręcić, tak aby zastygła pożywka wewnątrz probówek oddzieliła się od dna zlewki. Wyjąć probówki ze zlewki, najlepiej w jednym pęczku.
15. Przetrzeć każdą probówkę z osobna ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar pożywki z zewnętrznej powierzchni. Odstawić probówki do czystego pojemnika.
16. Wziąć ogólny laboratoryjny blok grzejny bez uchwytu na probówki i ostrożnie przykryć otwór grzejny kilkoma warstwami mocnej folii aluminiowej. Do wyłożonego folią otworu włożyć granulki parafiny (wosku) w celu ich roztopienia.
17. Trzymając probówki za koniec bez pożywki, zanurzyć koniec z pożywką w roztopionym wosku. Zanurzyć woskową część w szklanej zlewce z zimną wodą, aby przyspieszyć krzepnięcie wosku. Powtórzyć czynność raz. Zanurzanie woskowanych probówek w wodzie zapobiegnie ich sklejaniu się.
18. Probówki można użyć od razu lub przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4°C przez tydzień. Dłuższe przechowywanie doprowadzi do nadmiernego wyschnięcia pożywki. Jeśli probówki są przechowywane w 4°C, należy je przed użyciem ogrzać do temperatury otoczenia, pozostawiając je na blacie laboratoryjnym.

4. Umieszczanie much w probówkach do badania aktywności i system monitorowania aktywności lokomocyjnej

1. Przed umieszczeniem much w probówkach do monitorowania aktywności, włącz inkubatory, w których będą znajdować się monitory aktywności. Dostosuj temperaturę za pomocą sterowników inkubatora i ustaw cykl światło/ciemność za pomocą kontrolera światła systemu DAM lub własnego systemu sterowania oświetleniem inkubatora, zgodnie z planem eksperymentu. Czas potrzebny na umieszczenie much w probówkach powinien być wystarczający do ustabilizowania się temperatury.
2. Zanurz muchy w anestezji za pomocą dwutlenku węgla.
3. Używając cienkiego pędzla, ostrożnie przenieś pojedynczą muchę do probówki do monitorowania aktywności.
4. Chwyć pęsetą środek kawałka włóczki o długości około pół cala i wsuń go w koniec probówki pozbawiony pożywki, aby zablokować otwór i zapobiec ucieczce muchy podczas eksperymentu, zapewniając jednocześnie dopływ powietrza do probówki. Alternatywnie, do zamknięcia otworu można użyć plastikowych nakrętek z małymi otworami (Trikinetics, Inc.).
5. Upewnij się, że probówki leżą na boku do momentu przebudzenia się muchy; w przeciwnym razie istnieje ryzyko, że mucha przyklei się do pożywki.
6. Włóż probówki do monitorów aktywności. W przypadku nowszych, bardziej kompaktowych modeli monitorów Trikinetics (Trikinetics DAM2 i DAM2-7) konieczne jest przymocowanie probówek gumkami recepturkami, aby upewnić się, że wiązka podczerwieni przechodzi przez środek probówki.
7. Umieść monitory aktywności w inkubatorach i podłącz je do systemu zbierania danych za pomocą przewodów telefonicznych. Używając oprogramowania do zbierania danych systemu DAM, sprawdź, czy wszystkie monitory są prawidłowo podłączone i czy dane są zbierane z każdego z nich. Monitor emituje wiązkę światła podczerwonego przez środek każdej szklanej probówki. Aktywność lokomotoryczna much jest rejestrowana jako surowe dane binarne, gdzie „jeden” jest zapisywany za każdym razem, gdy wiązka podczerwieni zostanie przerwana, a „zero” w przypadku braku przerwania wiązki.

5. Projekt eksperymentalny w celu rejestracji danych do wyznaczenia okresowości i amplitudy rytmu okołodobowego

1. Muchy synchronizuje się i dostraja (entrainment), poddając je wybranemu reżimowi światło/ciemność (LD) i temperaturze przez 2-5 pełnych dni. Najczęściej stosowanym warunkiem dostrajania jest cykl światło/ciemność 12 h światła / 12 h ciemności (12:12 LD) w temperaturze 25°C. Ten powszechnie przyjęty standard opiera się w zasadzie na założeniu, że Drosophila pochodzi z regionów afro-ekwatorialnych. Podczas badania rytmów okołodobowych należy zapoznać się z pewną terminologią. W odniesieniu do niniejszego protokołu, moment zapalenia świateł w inkubatorze definiuje się jako czas zeitgebera 0 (ZT0), a wszystkie pozostałe godziny są określane względem tej wartości (np. w cyklu 12:12 LD, ZT12 to czas wygaszenia świateł). W standardowych warunkach 12:12 LD dzikie osobniki Drosophila melanogaster zazwyczaj wykazują dwie serie aktywności: jedną skoncentrowaną wokół ZT0, zwaną pikiem „porannym”, oraz drugą wokół ZT12, zwaną pikiem „wieczornym” (Rysunek 3A). Serie poranne i wieczorne są kontrolowane przez zegar endogenny, ale występują również reakcje „przebudzenia” (startle responses), które są przejściowymi skokami aktywności w odpowiedzi na przejścia światło/ciemność. Dwa dni dostrajania to minimum i mogą one zostać zastosowane na przykład w dużych przesiewach, które są bardziej czasochłonne i ukierunkowane na pomiar okresów swobodnobiegłych w stałej ciemności (patrz poniżej, krok 2). Jeśli jednak celem jest badanie wzorców aktywności podczas dziennego cyklu światło-ciemność, zaleca się utrzymywanie much w warunkach LD przez 4-5 dni, aby uzyskać więcej danych. W zasadzie zwiększenie liczby much lub liczby dni LD w końcowej analizie danych (np. poprzez połączenie danych z ostatnich dwóch dni aktywności lokomotorycznej w LD) pozwoli na wygenerowanie bardziej wiarygodnych profili i pomiarów aktywności dobowej (np. czasu wystąpienia piku porannego lub wieczornego). Ponadto dzienna dystrybucja aktywności zmienia się w zależności od długości dnia (fotoperiodu) i temperatury. Głównym powodem zmiany fotoperiodu lub temperatury względem standardu jest chęć zbadania, w jaki sposób dzienne wzorce aktywności ulegają adaptacji sezonowej (np. Chen et al. 2007). Drosophila może być również dostrajana do dobowych cykli temperatury (np. Glaser and Stanewsky 2005; Sehadova et al. 2009). Cykle temperatury różniące się zaledwie o 2-3°C są wystarczające do dostrojenia rytmów aktywności.
2. Rytmy swobodnobiegłej aktywności lokomotorycznej mierzy się w warunkach stałej ciemności i temperatury po zakończeniu okresu dostrajania (patrz powyżej, krok 1). Ustawienia cyklu świetlnego można zmienić w dowolnym momencie fazy ciemnej w ostatnim dniu LD, tak aby kolejny dzień eksperymentu stanowił pierwszy dzień DD. Siedem dni gromadzenia danych w DD jest wystarczające do obliczenia okresu okołodobowego i amplitudy (np. mocy lub siły rytmu) much. Generalnie, aby uzyskać wiarygodne okresy swobodnobiegłe dla konkretnego genotypu, niezbędna jest próba składająca się z co najmniej 16 much. Nawet jeśli interesuje nas jedynie pomiar aktywności dobowej, najlepiej jest mierzyć okresy swobodnobiegłe much w DD, ponieważ zmiany w okresie endogennym mogą wpływać na dzienną dystrybucję aktywności w LD. Na przykład muchy z długimi okresami endogennymi zazwyczaj wykazują opóźnione piki wieczorne w LD (np. patrz Rysunek 4).
3. Po zakończeniu eksperymentu surowe dane binarne zebrane za pomocą oprogramowania DAM System są pobierane na przenośny nośnik danych, np. pendrive USB.
4. Surowe dane binarne są przetwarzane za pomocą programu DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) i sumowane w przedziałach 15 i 30-minutowych przy analizie parametrów okołodobowych lub w przedziałach od 1 do 5 minut przy analizie parametrów snu/odpoczynku. Obecnie standardową definicją snu/odpoczynku u Drosophila jest pięć ciągłych minut braku aktywności (Hendricks et al. 2000; Ho and Sehgal 2005).
5. Istnieje wiele różnych sposobów analizy danych zebranych w systemie DAM, jednak przedstawimy jedynie metody rutynowo stosowane w naszym laboratorium. Program Microsoft Excel służy do przypisywania genotypów do różnych grup próbek. Oprogramowanie FaasX (M. Boudinot i F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francja) lub Insomniac (program oparty na Matlabie; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) są odpowiednio wykorzystywane do badania parametrów okołodobowych (np. okresu i mocy) lub snu/odpoczynku (np. procentu snu, średniej długości serii odpoczynku).

6. Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu niniejszego protokołu można wykorzystać ten sam zestaw danych do zbadania zarówno parametrów okołodobowych, jak i parametrów snu zwierząt doświadczalnych w odniesieniu do zwierząt kontrolnych.

Analiza parametrów okołodobowych: Wykresy edukcyjne ilustrujące codzienną aktywność lokomotoryczną lub średnią aktywność much w ciągu kilku dni w warunkach LD lub DD można generować za pomocą oprogramowania FaasX (Rysunek 3). Drosophila melanogaster zazwyczaj wykazuje dwa okresy aktywności; jeden skupiony wokół ZT0 (lub CT), nazywany szczytem „porannym”, oraz drugi wokół ZT12 (CT 12), nazywany szczytem „wieczornym”. Te dwa okresy aktywności są kontrolowane przez zegar endogenny i mogą być obserwowane nawet w warunkach wolnobieżnych DD (Rysunek 3B). Zmiany w czasie występowania tych szczytów aktywności można łatwo zaobserwować na wykresach edukcyjnych, co może wskazywać na zmianę właściwości zegara endogennego. Inną cechą świadczącą o prawidłowym funkcjonowaniu zegara jest antycypacyjny wzrost aktywności lokomotorycznej obserwowany w cyklach LD, który występuje przed faktycznym przejściem z ciemności do światła lub ze światła do ciemności (Rysunek 3A, strzałki). Zachowanie to jest wyraźnie widoczne u much typu dzikiego (Rysunek 3A), ale nie występuje u mutantów arytmicznych, takich jak per⁰ (Rysunek 3C) (Konopka i Benzer, PNAS, 1971). W przypadku mutantów per⁰ obserwowane w LD szczyty „poranne” i „wieczorne” są wyłącznie reakcjami przestrachu spowodowanymi nagłymi zmianami warunków oświetlenia (tj. muchy „bezzegarowe” nie antycypują zmian środowiskowych, lecz jedynie na nie reagują). Utrata rytmiczności behawioralnej jest znacznie bardziej wyraźna w DD i zazwyczaj przejawia się całkowitym zanikiem porannych lub wieczornych szczytów aktywności lokomotorycznej (tj. występują losowe okresy aktywności i nieaktywności), co widać u much per⁰ (Rysunek 3D). Oprócz wykresów edukcyjnych, dane dotyczące aktywności lokomotorycznej mogą być przedstawione w formie podwójnego aktogramu (FaasX), w którym dane z dwóch dni są nanoszone sekwencyjnie w każdej linii, przy czym profil ostatniego dnia rozpoczyna kolejną linię obejmującą dwa dni aktywności (Rysunek 4). Na przykład LD1 i 2 są nanoszone w pierwszej linii aktogramu. Kolejna linia zaczyna się od powtórzenia LD2, a następnie następuje LD3 i tak dalej. Zgodnie z tym formatem, w aktogramie zilustrowane są dane aktywności lokomotorycznej z całego eksperymentu. Aktogramy można wykreślić dla każdej pojedynczej muchy lub dla każdego genotypu much. Jedną z zalet aktogramów nad wykresami edukcyjnymi jest to, że zmiana długości okresu rytmów aktywności dobowej jest łatwo zauważalna (Rysunek 4). Poza generowaniem wykresów edukcyjnych i aktogramów, dane aktywności lokomotorycznej z warunków DD można wprowadzić do FaasX, aby obliczyć długość okresu za pomocą szeregu różnych programów, w tym Cycle-P.

Analiza parametrów snu/odpoczynku: Stosując aktualną definicję snu/odpoczynku u Drosophila (Hendricks et al. 2000), którą jest pięć ciągłych minut braku aktywności, można analizować dane zarejestrowane podczas testów aktywności lokomotorycznej i badać wiele parametrów snu za pomocą programu Insomniac (L. Ashmore) opartego na środowisku Matlab. Procent czasu, jaki muchy spędzają na śnie, można obliczyć w różnych odstępach czasu, np. procent snu w każdej godzinie (Rycina 5A) lub w ciągu 12 godzin (Rycina 5B). Inne powszechniej badane parametry snu obejmują średnią długość epizodu odpoczynku (Rycina 5C) oraz liczbę aktywności w fazie czuwania (Rycina 5D). Średnia długość epizodu snu/odpoczynku jest miarą konsolidacji snu i może obrazować jego jakość. Aktywność w fazie czuwania, zgodnie z nazwą, jest miarą tempa aktywności, gdy muchy nie śpią. Parametr ten pomaga odróżnić muchy, u których faktycznie zaburzone są zachowania związane ze snem/odpoczynkiem, od tych, które są chore lub nadaktywne. Na przykład muchy, które są po prostu chore, mogą sprawiać wrażenie, że śpią więcej, ponieważ są mniej mobilne. W przypadku takich much aktywność w fazie czuwania będzie niższa w stosunku do zwierząt kontrolnych.

Rycina 1: Schemat przedstawiający główne etapy badania rytmów aktywności lokomotorycznej u Drosophila. Procedury przedstawiono po lewej stronie, a pomocnicze uwagi po prawej. Ilość czasu potrzebna na przeprowadzenie niezbędnych krzyżówek i manipulacji genetycznych w celu uzyskania much o genotypie odpowiednim dla konkretnych eksperymentów jest zmienna w zależności od charakteru i projektu badania. Dwa kroki oznaczone gwiazdkami (*) określają ramy czasowe, w których dorosłe muchy muszą zostać zasiane/skrzyżowane, aby uzyskać potomstwo w odpowiednim wieku (od 1 do 5 dni) do eksperymentu.

Rycina 2: Schemat połączeń ilustrujący powiązania między poszczególnymi komponentami systemu zbierania danych o aktywności lokomotorycznej Drosophila przy użyciu systemu DAM. Do rejestrowania liczby aktywności lokomotorycznej Drosophila wykorzystywany jest dedykowany komputer. Monitory aktywności znajdują się wewnątrz inkubatorów wyposażonych w systemy kontroli temperatury i oświetlenia (Włącz/Wyłącz). Komputer może służyć również do sterowania czasem włączania i wyłączania światła w inkubatorach, pod warunkiem, że źródło zasilania systemu oświetlenia zostanie podłączone do jednostki zasilacza (opcjonalnie). Komunikacja między komputerem a monitorami aktywności i inkubatorami jest zarządzana przez interfejs jednostki zasilania. Komputer, jednostka zasilacza i inkubatory (jeśli sterowanie oświetleniem jest niezależne od komputera) są podłączone do gniazda zasilania AC poprzez UPS, aby zapewnić nieprzerwany monitoring aktywności oraz ciągłe oświetlenie podczas fazy jasnej. Zaleca się podłączenie wszystkich urządzeń elektrycznych do awaryjnych obwodów zasilania w obiekcie, jeśli są one dostępne.

Rycina 3: Wykresy edukcyjne wygenerowane za pomocą programu FaasX obrazujące dobowe rytmy aktywności lokomotorycznej rytmicznych much typu dzikiego (muchy w per⁰ niosące transgen per+) (A i B) w porównaniu do arytmicznych mutantów w per⁰ (C i D). Samce much utrzymywano w temperaturze 25°C i synchronizowano przez 4 dni w cyklach 12:12 LD (światło: ciemność), a następnie przez siedem dni w DD (stała ciemność). Dla każdej linii much mierzono poziomy aktywności lokomotorycznej poszczególnych osobników (n>32) w 15-minutowych przedziałach czasowych, a następnie wyciągano średnią, aby uzyskać profil grupowy reprezentatywny dla danej linii. Panele A i C przedstawiają dane dotyczące aktywności wygenerowane poprzez uśrednienie drugiego i trzeciego dnia w cyklu światło/ciemność (LD 2-3), natomiast panele B i D przedstawiają dane dotyczące aktywności wygenerowane poprzez uśrednienie drugiego i trzeciego dnia w stałej ciemności (DD 2-3). Pionowe słupki reprezentują aktywność (w jednostkach umownych) zarejestrowaną w 15-minutowych przedziałach czasowych podczas okresu jasnego (jasnoszary) lub ciemnego (ciemnoszary). Poziome paski na dole wykresów edukcyjnych LD: biały – światło włączone; czarny – światło wyłączone. ZT0 i ZT12 reprezentują odpowiednio początek i koniec fotoperiodu. Dla wykresów edukcyjnych DD: CT0 i CT12 reprezentują początek i koniec subiektywnego dnia w warunkach stałej ciemności, oznaczonych szarym paskiem. W panelu A: M = szczyt poranny; E = szczyt wieczorny. Strzałki w panelu A reprezentują zachowania antycypacyjne szczytów porannych i wieczornych obserwowane u much typu dzikiego, które nie występują u arytmicznych much w per⁰.

Rycina 4: Podwójny aktogram wygenerowany za pomocą oprogramowania FaasX, ilustrujący dane dotyczące aktywności lokomocyjnej much o okresie dzikim, krótkim lub długim. Samce much utrzymywano w temperaturze 25°C i poddawano entrainowaniu przez 4 dni w cyklach LD 12:12, po czym przez osiem dni przebywały w stałej ciemności (DD) w celu obliczenia okresu swobodnobieżnego (t) przy użyciu modułu Cycle-P w programie FaasX. Przedstawiono tutaj trzy linie much o okresie dzikim [w per⁰; per+; mutant per⁰ niosący transgen per+], okresie długim [w per⁰; per(S47A); mutant per⁰ niosący transgen per(S47A)] oraz okresie krótkim [w per⁰; per(S47D); mutant per⁰ niosący transgen per(S47D)] (Chiu et al. 2008). Oś X reprezentuje czas ZT lub CT odpowiednio w LD lub DD, a oś Y reprezentuje liczbę aktywności (jednostki arbitralne) zsumowaną w 15-minutowych przedziałach. Czerwone linie przerywane łączą wieczorne piki dla każdego dnia eksperymentów. Należy zauważyć, że podczas LD wieczorny pik jest „wymuszony”, aby utrzymać synchronizację z 24-godzinnym cyklem LD, podczas gdy w DD okres swobodnobieżny może odbiegać od 24 h. Na przykład w przypadku much o krótkich okresach czas wieczornej aktywności będzie występował wcześniej każdego kolejnego dnia w DD (przy przedstawieniu na 24-godzinnej skali czasu, jak pokazano tutaj), natomiast w przypadku much o długich okresach obserwuje się przesunięcie w prawo.

Rysunek 5: Ilościowe określanie parametrów snu u Drosophila. Muchy (Canton-S; CS) poddano standardnemu cyklowi LD 12:12 w temperaturze 25°C. Do przetwarzania danych wykorzystano program Insomniac (L. Ashmore), a do wygenerowania przedstawionych wykresów program Microsoft Excel. W celu uzyskania średnich grupowych oraz słupków błędu (standardowy błąd średniej) zgrupowano co najmniej 70 much. (A) Sen bazowy obliczany co godzinę; przedstawiono reprezentatywny cykl dobowy. (B) Sen bazowy reprezentatywnego cyklu dobowego obliczany co 12 godzin. (C) Średnia długość każdego epizodu spoczynku obliczana w odstępach 12-godzinnych. (D) Częstotliwość aktywności po przebudzeniu obliczana co 12 godzin.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisaliśmy procedury pomiaru rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila, które stanowią wiarygodny behawioralny wskaźnik działania zegarów okołodobowych much i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara. Metoda ta była stosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w poszukiwaniu nowych mutantów zegara (np. Konopka i Benzer 1971; Dubruille et al. 2009) i jest stale wykorzystywana do analizy i zrozumienia funkcji zegara in vivo. Służyła ona również do badania cyklu sen-czuwanie u much, choć ostatnie doniesienia sugerują, że cyfrowa analiza wideo jest znacznie bardziej niezawodna w kwantyfikacji snu niż pomiary rytmów aktywności lokomocyjnej (Zimmerman et al. 2008). Przy wykorzystaniu rytmów aktywności lokomocyjnej do analizy snu, procent snu w ciągu dnia ma tendencję do bycia zawyżonym.

Aby zapewnić sukces i powtarzalność tego protokołu, kluczowe jest badanie much o zbliżonym wieku, tle genetycznym i hodowanych w tych samych warunkach, ponieważ fenotypy behawioralne u muszek owocówek, takie jak rytm dobowy oraz aktywność sen/odpoczynek, są bardzo wrażliwe na wszystkie te czynniki. Przy użyciu wielu inkubatorów w jednym eksperymencie ważne jest upewnienie się, że wszystkie inkubatory mają przewidywaną temperaturę, ponieważ niektóre parametry okołodobowe mogą zmieniać się w funkcji temperatury. Jedna uwaga przy rozważaniu zakupu inkubatorów do pracy z muchami: nie wszystkie są takie same. Choć unikamy rekomendowania konkretnych urządzeń, istnieje wiele opcji. Dobre źródło informacji o firmach sprzedających inkubatory do prac z Drosophila znajduje się na stronie . Niektóre firmy sprzedają nawet inkubatory „do rytmów dobowych Drosophila”, w których dostępne są dodatkowe funkcje, takie jak okablowanie pod system Trikinetics i regulacja rampingowa temperatury (np. Tritech). Ważne funkcje obejmują możliwość dobowej kontroli światła oraz dobrą stabilizację temperatury w zakresie fizjologicznym dla Drosophila (~15-30°C). Ceny i rozmiary inkubatorów bardzo się różnią, ale dzięki nowszym monitorom aktywności od Trikinetics nawet małe inkubatory mogą pomieścić sporą liczbę tych urządzeń. Ponadto, choć można używać inkubatorów z kontrolą wilgotności, ta dodatkowa funkcja nie jest konieczna, o ile umieści się małą miseczkę z wodą w celu zapewnienia wilgotności (wystarczy 50-70%). Na koniec, mimo że w tym protokole rutynowo używamy programów FaasX i Insomniac do analizy danych, dostępne są alternatywne programy i oprogramowanie (Rosato i Kyriacou 2006), np. ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Rhythm Package (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston) oraz MAZ (Zordan et al. 2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monitor aktywności Drosophila (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 lub DAM5	Monitory DAM2 są bardziej kompaktowe, co pozwala na umieszczenie większej liczby urządzeń w jednej inkubatorze
Interfejs jednostki zasilania (dla systemu DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Zawiera zasilacz AC PS9-1
Sterownik oświetlenia	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Szklane rurki Pyrex	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7 oraz PGT10
Plastikowe nakrętki do rurek do badania aktywności	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Zamiast plastikowych nakrętek można użyć nici.
Oprogramowanie do zbierania danych systemu DAM	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Dostępne wersje dla Mac i PC
Oprogramowanie FaasX	Centre National de la Recherche Scientifique		Tylko dla Mac
Oprogramowanie Insomniac 2.0	University of Pittsburgh School of Medicine		Działa w środowisku Matlab. Może być używane zarówno na PC, jak i Macintosh.
Inkubator środowiskowy z kontrolą temperatury i cyklu dobowego, np. inkubator Percival	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Wymiary przestrzeni wewnętrznej: Szerokość: 65cm; Wysokość: 86cm; Głębokość: 55cm
Inkubator środowiskowy z kontrolą temperatury i cyklu dobowego, np. inkubator grzewczo-chłodzący DigiTherm z oświetleniem i temperaturą sterowanymi rytmem okołodobowym	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Wymiary przestrzeni wewnętrznej: Szerokość: 36m; Wysokość: 56m; Głębokość: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Awaryjna jednostka zasilania zapasowego)	APC	SU2200NET	Moc wyjściowa 1600 Watów
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S7903
Agar Bacto	BD Biosciences	214010
Granulki parafiny TissuePrep	Fisher Scientific	T565	Temperatura topnienia 56°C-57°C
Grzejnik blokowy	VWR international	12621-014