Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Streszczenie

Większość form życia wykazuje rytmy dobowe w zjawiskach komórkowych, fizjologicznych i behawioralnych, które są sterowane przez endogenne rozruszniki lub zegary okołodobowe (≡24 hr). Zaburzenia w ludzkim systemie okołodobowym wiążą się z licznymi chorobami lub schorzeniami. Znaczny postęp w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw rytmów okołodobowych dokonano dzięki przesiewom genetycznym, w których łatwo mierzalny rytm behawioralny służy jako wskaźnik funkcji zegara. Badania z wykorzystaniem Drosophila wniosły fundamentalny wkład w nasze zrozumienie komórkowych i biochemicznych podstaw rytmów okołodobowych. Standardowym wskaźnikiem behawioralnym mierzonym u Drosophila jest aktywność lokomotoryczna. Generalnie system monitorujący obejmuje specjalnie zaprojektowane urządzenia, które mogą mierzyć ruchy lokomotoryczne Drosophila. Urządzenia te są umieszczone w inkubatorach z kontrolowanym środowiskiem, znajdujących się w ciemni, i opierają się na wykorzystaniu przerwania wiązki światła podczerwonego do rejestracji aktywności lokomotorycznej pojedynczych much zamkniętych w małych probówkach. W pomiarach prowadzonych przez wiele dni Drosophila wykazują dobowe cykle aktywności i nieaktywności, czyli rytm behawioralny sterowany przez endogenny system okołodobowy zwierzęcia. Cała procedura została uproszczona dzięki pojawieniu się komercyjnie dostępnych urządzeń do monitorowania aktywności lokomotorycznej oraz opracowaniu programów komputerowych do analizy danych. Stosujemy system firmy Trikinetics Inc., który jest opisany w niniejszej procedurze i obecnie stanowi najpopularniejszy system wykorzystywany na całym świecie. W ostatnim czasie te same urządzenia monitorujące zostały wykorzystane do badania zachowań związanych ze snem u Drosophila. Ponieważ dobowe cykle czuwania i snu wielu much można mierzyć jednocześnie, a zazwyczaj wystarczy od 1 do 2 tygodni ciągłych danych o aktywności lokomotorycznej, system ten jest idealny do wielkoskalowych przesiewów w celu zidentyfikowania osobników Drosophila wykazujących zmienione właściwości okołodobowe lub związane ze snem.

Protokół

Ogólny schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. W pierwszej kolejności należy przygotować układ do monitorowania aktywności lokomotorycznej z wykorzystaniem urządzeń umieszczonych w inkubatorach z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi, znajdujących się w ciemni. Po zakończeniu tego etapu system może być wykorzystywany we wszystkich kolejnych pomiarach rytmów aktywności lokomotorycznej. W każdym doświadczeniu należy (i) przygotować zwierzęta doświadczalne, co może obejmować generowanie zwierząt transgenicznych lub przeprowadzenie niezbędnych krzyżówek, (ii) przygotować szklane probówki do pomiaru aktywności zawierające źródło pokarmu, (iii) umieścić muchy w probówkach i podłączyć monitory aktywności do systemu zbierania danych oraz (iv) zarejestrować i przeanalizować dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, w zależności od tego, jakie parametry okołodobowe lub parametry snu mają zostać zbadane. W niniejszym protokole „początek” eksperymentu definiujemy jako moment, w którym muchy w urządzeniach monitorujących zostają po raz pierwszy wystawione na pożądane warunki oświetlenia/ciemności w inkubatorach środowiskowych.

1. Konfiguracja systemu monitorowania aktywności lokomocyjnej

1. System monitorowania obejmuje liczne elementy wyposażenia, takie jak specjalistyczne urządzenia monitorujące, inkubatory środowiskowe z możliwością dobowej kontroli oświetlenia, urządzenia do zbierania danych, komputery oraz materiały peryferyjne, np. okablowanie służące do połączenia urządzeń monitorujących z urządzeniami do zbierania danych (Rysunek 2). Instrukcje instalacji Muszka owocówka Systemy do zbierania danych z monitorowania aktywności (DAM) są dostarczane przez producenta (Trikinetics Inc.).
2. W celu pomieszczenia systemu monitorowania aktywności lokomotorycznej należy wybrać dobrze wentylowane pomieszczenie, najlepiej wyposażone w system regulacji temperatury, które zostanie przeznaczone na ciemnię. Ze względu na pracę wszystkich zaangażowanych systemów elektrycznych (np. komputerów i inkubatorów) przez dłuższy czas w małym, zamkniętym pomieszczeniu, może dojść do generowania nadmiernego ciepła, co prowadzi do gwałtownego wzrostu temperatury w pokoju. W konsekwencji inkubatory zostaną obciążone dodatkową pracą w celu utrzymania temperatury, co zwiększa ryzyko błędów w jej kontroli. Stwierdzono, że nawet w dobrze wentylowanych pomieszczeniach przejście z klimatyzacji latem na ogrzewanie jesienią i zimą może utrudniać utrzymanie stałej temperatury pokojowej. W takich przypadkach w ciemni może być konieczna instalacja dodatkowej wentylacji w celu zmniejszenia ryzyka przegrzania. Zaleca się również wyłączanie nieużywanych inkubatorów, aby zminimalizować generowanie zbędnego ciepła.
3. Należy odizolować pomieszczenie od zewnętrznych źródeł światła. Wejście można zabezpieczyć za pomocą drzwi obrotowych lub czarnej zasłony. Preferujemy drzwi obrotowe, ponieważ minimalizują one ryzyko przedostania się niepożądanego światła do ciemni. Wewnątrz ciemni nie jest konieczne prowadzenie prac w całkowitej ciemności, ponieważ system okołodobowy muszek owocówek nie jest wrażliwy na światło podczerwone (a znacznie mniej wrażliwy na światło czerwone w porównaniu do światła zielonego i niebieskiego). W przypadkach, gdy istnieje potrzeba widoczności w ciemni przy jednoczesnym zachowaniu ogólnego zaciemnienia (np. podczas szybkiego wyjmowania lub dodawania urządzenia monitorującego do inkubatora znajdującego się w fazie ciemnej), używamy zwykłej latarki pokrytej czerwonym filtrem. Alternatywnie lub dodatkowo, jeśli w ciemni znajdują się lampy fluorescencyjne, należy pokryć je czerwonym papierem filtrującym lub zastosować autonomiczną lampkę biurkową z żarówką żarnikową, również zabezpieczoną takim papierem. Jest bardzo mało prawdopodobne, aby wystawienie much w ciemności na bardzo krótkotrwałe (kilkusekundowe) działanie światła czerwonego wpłynęło na ich zegary okołodobowe. Ponadto, choć system okołodobowy... Muszka owocówka jest bardzo wrażliwa na światło widzialne, zatem uważamy, że niewielkie prześwity światła w ciemni nie będą miały znaczącego wpływu; w każdym przypadku dobrą praktyką jest otwieranie drzwi inkubatorów, w których znajdują się monitory, wyłącznie w razie potrzeby. Ponadto należy otwierać tylko jeden inkubator naraz, aby zminimalizować ryzyko naświetlenia inkubatora w fazie ciemnej światłem z inkubatora znajdującego się w fazie jasnej.
4. Należy zakupić zasilacz awaryjny UPS (Uninterrupted Power Supply) o mocy wystarczającej do zasilania komponentów systemu monitorowania aktywności w przypadku przepięć, skoków napięcia lub awarii zasilania w budynku. Zasilacz UPS należy podłączyć do obwodu zasilania awaryjnego budynku, jeśli taki jest dostępny. Należy pamiętać, że nawet jeśli sprzęt jest podłączony do gniazda awaryjnego, podczas przerwy w dostawie prądu może wystąpić krótki okres przejściowy w czasie przełączania systemu na zasilanie awaryjne. W tym czasie utrata zasilania nawet przez kilka sekund może doprowadzić do wyłączenia komputerów oraz zgaśnięcia oświetlenia w inkubatorze. Dlatego ważne jest, aby komputery służące do gromadzenia danych o aktywności oraz system sterujący oświetleniem w inkubatorze były podłączone nie tylko do zasilania awaryjnego, ale również do urządzenia UPS. Jeśli system sterujący oświetleniem w inkubatorze nie jest regulowany bezpośrednio przez inkubator (co ma miejsce w większości przypadków), wystarczy podłączyć inkubator do zasilania awaryjnego bez użycia UPS, ponieważ kilkusekundowa przerwa w dostawie prądu nie wpłynie na temperaturę w komorze. Należy zauważyć, że zazwyczaj urządzenie UPS podtrzymuje pracę sprzętu jedynie przez 5–30 min w przypadku braku zasilania; jego głównym zadaniem jest ochrona przed tymczasową utratą energii podczas przechodzenia z zasilania standardowego na awaryjne.
5. Przygotuj komputer (PC lub Macintosh) w pełni dedykowany do gromadzenia danych i/lub sterowania oświetleniem inkubatorów. Ponieważ system DAM będzie pracował w sposób ciągły i bez nadzoru, zaleca się, aby na komputerze zainstalowano minimalną liczbę programów, a najlepiej aby nie posiadał on połączenia z siecią, co zminimalizuje ryzyko awarii. Ponadto system wymaga przenośnego nośnika danych, np. dysku Zip, nagrywarki CD/DVD lub pamięci USB, aby umożliwić pobieranie zgromadzonych danych do późniejszej analizy.
6. Ręcznie i starannie ułóż sieć linii telefonicznych wokół półek inkubatorów z kontrolowanym środowiskiem, aby umożliwić łatwe podłączanie i odłączanie monitorów aktywności. Można wykorzystać standardowe linie telefoniczne, adaptery i rozdzielacze dostępne w komercyjnych sklepach z elektroniką. Skonfiguruj wiele linii telefonicznych w taki sposób, aby zbiegały się one w jedną główną linię, która zostanie wyprowadzona z inkubatora i podłączona do komputera.
7. Podłącz urządzenia monitorujące znajdujące się wewnątrz inkubatorów do komputera za pomocą jednostki interfejsu zasilania (znanej jako Blue box firmy Trikinetics Inc.), która służy do zasilania monitora aktywności (Trikinetics Inc.) za pomocą linii telefonicznej. Ta jednostka interfejsu zasilania pełni również funkcję interfejsu do przesyłania danych, umożliwiając przełączenie z linii telefonicznej na kabel USB. Opcjonalnie dostępny jest sterownik światła w tej samej jednostce, do którego można podłączyć przewód zasilający system oświetlenia inkubatora, co umożliwia sterowanie harmonogramem dobowego oświetlenia inkubatora za pomocą komputera.
8. Zamaskuj potencjalne źródła światła z diod LED urządzenia elektronicznego lub nieszczelności w drzwiach inkubatora za pomocą taśmy klejącej typu duct tape lub czarnej tkaniny, aby zapewnić pomiar rytmów swobodnych w całkowitej ciemności.

2. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych

1. Fenotypy behawioralne u muszek owocówek, takie jak rytm okołodobowy oraz aktywność związana ze snem/odpoczynkiem, są bardzo wrażliwe na różnice genotypowe i wiekowe badanych zwierząt (Koh et al. 2006). Dlatego kluczowe jest ocenianie tych fenotypów z wykorzystaniem odpowiednich zwierząt kontrolnych, które są hodowane w tych samych warunkach środowiskowych i są w tym samym wieku. Ponadto w rytmice okołodobowej występuje dymorfizm płciowy (Helfrich-Föster 2000). W badaniach aktywności lokomotorycznej powszechną praktyką jest stosowanie dorosłych samców muszek hodowanych w temperaturze 25°C w wieku od 1 do 5 dni. Tradycyjnie używa się samców zamiast samic, ponieważ aktywność związana ze składaniem jaj wpływa na rzetelność pomiaru aktywności lokomotorycznej. Ze względu na dymorfizm płciowy, analiza samic może być czasami informacyjna. Pożywka składająca się z 5% sacharozy i 2% agaru bacto zapobiegnie rozwojowi jaj samic niedziewiczych oraz przemieszczaniu się wyklutych larw, co mogłoby spowodować błędne zliczenia aktywności. Alternatywnie można zastosować dziewicze samice, choć między samicami zapłodnionymi a dziewiczymi mogą występniać różnice w profilach aktywności (Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000).
2. Podczas badania parametrów okołodobowych oraz snu/odpoczynku u konkretnych mutantów muszek, zasadne jest przeprowadzenie krzyżowania zwrotnego szczepu mutantów ze szczepem typu dzikiego o tym samym tle genetycznym, np. w1118 lub yw. Pozwoli to na usunięcie modyfikatorów genetycznych w drugim locus, które mogłyby potencjalnie maskować fenotyp okołodobowy lub fenotyp snu/odpoczynku. Ponieważ u samców Drosophila nie zachodzi crossing-over, lepiej jest przeprowadzić krzyżowanie zwrotne, krzyżując samice mutantów z samcami typu dzikiego. Szczep typu dzikiego będzie również służył jako odpowiednia kontrola w eksperymencie. Zarówno kontrolne muszki typu dzikiego, jak i mutanty należy zasiać w tym samym czasie na standardowej pożywce dla Drosophila około 10 do 14 dni przed eksperymentem dotyczącym rytmu aktywności lokomotorycznej (przepis na pożywkę znajduje się w Bloomington Drosophila Stock Center; http://flystocks.bio.indiana.edu/). Po wylożeniu potomstwa należy zebrać samce w wieku od 1 do 5 dni i odstawić je do wykorzystania w eksperymentach.
3. Dzięki licznym narzędziom i zasobom genetycznym, takim jak nadekspresja, RNAi oraz tkankowo specyficzne linie muszek z driverem GAL4 dostępne w różnych centrach zasobów na całym świecie, możliwe jest badanie efektów nadekspresji lub wyciszania specyficznych genów w sposób tkankowo i czasowo specyficzny (Brand and Perrimon 1993; McGuire et al. 2004; Osterwalder et al. 2001). Aby zbadać parametry okołodobowe oraz snu/odpoczynku przy użyciu tego podejścia, muszki niosące konstrukty transgeniczne z tkankowo specyficznym lub indukowalnym lekiem driverem GAL4 (np. samce) są krzyżowane z muszkami niosącymi konstrukty transgeniczne z genami docelowymi dołączonymi do respondera UAS (np. dziewicze samice) około 14 dni przed rozpoczęciem eksperymentów z aktywnością lokomotoryczną. Po wylożeniu potomstwa należy zebrać samce w wieku od 1 do 5 dni i odstawić je do wykorzystania w eksperymentach. Linie rodzicielskie wykorzystane do krzyżowania są rutynowo stosowane jako kontrole w eksperymentach. Odpowiednią kontrolą jest również potomstwo z krzyżowań linii respondera UAS i drivera GAL4 z muszkami typu dzikiego o tym samym tle genetycznym.
4. Jak wskazano w krokach (2) i (3), czas potrzebny na przygotowanie zwierząt doświadczalnych znacznie różni się w zależności od charakteru i projektu eksperymentu. W przypadku, gdy konieczne jest wygenerowanie zwierząt transgenicznych lub wykonanie schematów krzyżowania, oczywiście potrzeba będzie więcej czasu. Z przyczyn logistycznych rozwój Drosophila od stadium jaja do dorosłej muchy w temperaturze 25°C trwa około 14 dni.

3. Przygotowanie probówek do pomiaru aktywności

1. Probówki do testów aktywności reprezentują siedlisko much w trakcie eksperymentu. Są to cienkie (około 5 mm średnicy; należy zauważyć, że firma Trikinetics oferuje różne rozmiary w zależności od badanego gatunku Drosophila) szklane probówki o długości 5 mm, które zawierają pożywkę na jednym końcu i są zamknięte wełną lub plastikowym korkiem na drugim końcu. Ponieważ szklane probówki do testów aktywności mogą być wielokrotnie używane, opiszemy procedury przygotowawcze, przyjmując jako punkt wyjścia używane/nieoczyszczone probówki z poprzednich eksperymentów. W przypadku korzystania z nowych probówek należy przejść bezpośrednio do kroku (11).
2. Zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych probówek, ponieważ pożywka wewnątrz ma tendencję do wysychania i z czasem ulega zanieczyszczeniu grzybami, nawet przy przechowywaniu w 4°C. Są one zazwyczaj przygotowywane od kilku dni do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu. Dlatego ważne jest oszacowanie liczby probówek potrzebnych do każdego doświadczenia przed ich przygotowaniem.
3. Należy usunąć korki (wełniane lub plastikowe) z używanych probówek i umieścić je w dużym szklanym zlewce. Probówki powinny wypełniać zlewkę tylko do połowy. Należy napełnić zlewkę wodą z kranu, upewniając się, że probówki są całkowicie zanurzone.
4. Zlewkę z probówkami należy podgrzać w kuchence mikrofalowej, aż woda zacznie gwałtownie wrzeć, aby rozpuścić wosk i pożywkę agarową.
5. Należy zachować ostrożność, ponieważ woda jest gorąca. Należy wyjąć zlewkę z kuchenki mikrofalowej i zamieszać probówki szpatułką lub plastikową pipetą 10 mL, aby uwięziony wosk wypłynął na powierzchnię. Następnie należy powtórzyć krok (4).
6. Należy wyjąć zlewkę z kuchenki mikrofalowej i odczekać do jej ostygnięcia. Umieszczenie zlewki w chłodni (jeśli jest dostępna) przyspieszy ten proces.
7. W miarę stygnięcia wody wosk zbiera się na jej powierzchni i stopniowo twardnieje. Zastygły wosk należy po prostu usunąć ręcznie. Powinno to usunąć większość wosku z probówek.
8. Probówki należy przenieść do nowej zlewki ze świeżą wodą z kranu i powtórzyć kroki (4) i (5).
9. Ponieważ większość wosku została usunięta w kroku (7), nie ma potrzeby czekania na jego zastygnięcie. Należy po prostu wylać wodę ze zlewki i przenieść probówki do kolejnej nowej zlewki. Należy zachować ostrożność, ponieważ woda jest wciąż gorąca.
10. Kroki (4) i (5) należy powtórzyć po raz ostatni. Należy wylać wodę ze zlewki i odczekać, aż probówki ostygną.
11. Należy ułożyć je pionowo w szklanych zlewkach o pojemności 250 mL lub 500 mL. Należy upewnić się, że nie są one zbyt ciasno upakowane. Należy je wysterylizować w autoklawie w cyklu suchym lub po prostu wysuszyć w suszarce laboratoryjnej.
12. Aby oddzielnie przygotować pożywkę do napełnienia probówek, należy sporządzić roztwór 5% sacharozy (Sigma) i 2% Bacto agar (BD) w wodzie destylowanej lub wodzie z kranu. Roztwór należy wysterylizować w autoklawie. Wysterylizowana pożywka może być użyta natychmiast lub przechowywana w 4°C przez dłuższy czas. Po zastygnięciu pożywki będzie konieczne jej ponowne roztopienie w kuchence mikrofalowej w celu napełnienia probówek. Niewykorzystaną część pożywki można przechowywać i użyć w późniejszym terminie.
13. Pożywka podczas napełniania probówek powinna mieć idealnie około 65°C. Jeśli będzie zbyt gorąca, wewnątrz probówek zgromadzi się zbyt dużo kondensatu. Jeśli nie będzie wystarczająco gorąca, pożywka zastygnie, zanim probówki zostaną równomiernie wypełnione. Aby napełnić probówki pożywką, należy użyć pipety 10 mL i nalać płynną pożywkę wzdłuż wewnętrznej ścianki szklanej zlewki, pozwalając roztworowi wypełniać probówkę od dołu, aż zostaną one wypełnione w jednej trzeciej. Należy delikatnie zakręcić zlewką, aby upewnić się, że wszystkie probówki, zwłaszcza te w środku, są równomiernie wypełnione pożywką. Należy odczekać do całkowitego zastygnięcia pożywki w temperaturze pokojowej lub w 4°C. Można przejść do następnego kroku po ustąpieniu kondensacji wewnątrz szklanych probówek.
14. Aby wyjąć probówki ze zlewki, należy pchnąć je w stronę dna zlewki i jednocześnie nimi zakręcić, tak aby zastygła pożywka wewnątrz probówek oddzieliła się od dna zlewki. Probówki należy wyjąć ze zlewki, najlepiej jako jeden pęk.
15. Należy oczyścić probówki jedna po drugiej ręcznikami papierowymi, aby usunąć nadmiar pożywki z ich powierzchni zewnętrznej. Probówki należy odłożyć do czystego pojemnika.
16. Należy użyć ogólnego laboratoryjnego grzałki blokowej bez uchwytu na probówki i ostrożnie zakryć otwór grzejny kilkoma warstwami mocnej folii aluminiowej. Do wyłożonego folią otworu grzejnego należy dodać granulki parafiny (wosku), aby je roztopić.
17. Trzymając probówki za koniec bez pożywki, należy zanurzyć koniec z pożywką w roztopionym wosku. Następnie zanurzyć woskową część w szklanej zlewce z zimną wodą, aby przyspieszyć twardnienie wosku. Operację należy powtórzyć raz. Zanurzenie woskowanych probówek w wodzie zapobiegnie ich sklejaniu się.
18. Probówki można użyć natychmiast lub przechowywać w szczelnym pojemniku w 4°C do tygodnia. Dłuższe przechowywanie doprowadzi do nadmiernego wysuszenia pożywki. Jeśli probówki są przechowywane w 4°C, należy je ogrzać do temperatury otoczenia, pozostawiając je na blacie przed użyciem.

4. Umieszczanie much w probówkach do aktywności i system monitorowania aktywności lokomotorycznej

1. Przed umieszczeniem much w probówkach do monitorowania aktywności, włącz inkubatory, w których będą znajdować się monitory aktywności. Dostosuj temperaturę za pomocą sterowników inkubatora i ustaw cykl światła/ciemności za pomocą kontrolera oświetlenia systemu DAM LUB własnego systemu sterowania oświetleniem inkubatora, zgodnie z planem eksperymentalnym. Czas potrzebny na umieszczenie much w probówkach powinien być wystarczający, aby temperatura się ustabilizowała.
2. Uśpij muchy dwutlenkiem węgla.
3. Używając cienkiego pędzla, ostrożnie przenieś pojedynczą muchę do probówki do monitorowania aktywności.
4. Chwyć pęsetą za środek pojedynczego kawałka włóczki o długości około pół cala i wprowadź go do końca probówki, w którym nie ma pożywki, aby zatkać otwór i zapobiec ucieczce muchy podczas eksperymentu, zapewniając jednocześnie przepływ powietrza do probówki. Alternatywnie, do zamknięcia otworu można użyć plastikowych zakrętek z małymi otworami (Trikinetics, Inc.).
5. Upewnij się, że probówki leżą na boku do czasu przebudzenia się muchy, w przeciwnym razie istnieje ryzyko, że mucha przyklei się do pożywki.
6. Wsuń probówki do monitorów aktywności. W przypadku nowszego, bardziej kompaktowego modelu monitorów Trikinetics (Trikinetics DAM2 i DAM2-7) konieczne jest przymocowanie probówek gumkami recepturkami, aby upewnić się, że wiązka podczerwieni przechodzi przez środek probówki.
7. Umieść monitory aktywności w inkubatorach i podłącz je do systemu zbierania danych za pomocą przewodów telefonicznych. Używając oprogramowania do zbierania danych systemu DAM, sprawdź, czy wszystkie monitory są prawidłowo podłączone i czy dane są zbierane z każdego z nich. Monitor emituje wiązkę światła podczerwonego przez środek każdej szklanej probówki. Aktywność lokomocyjna much jest rejestrowana jako surowe dane binarne, gdzie „jeden” jest zapisywany za każdym razem, gdy wiązka podczerwieni zostanie przerwana, a „zero” jest zapisywane, gdy wiązka podczerwieni nie zostaje przerwana.

5. Projekt eksperymentalny w celu rejestracji danych do wyznaczenia okresowości i amplitudy okołodobowej

1. Muchy są synchronizowane i poddawane entrainmentowi poprzez wystawienie ich na wybrany reżim światła/ciemności (LD) i temperatury przez 2-5 pełnych dni. Najczęściej stosowanym warunkiem entrainmentu jest cykl światła/ciemności 12 h światła / 12 h ciemności (12:12 LD) w temperaturze 25°C. Ten powszechnie akceptowany standard opiera się w zasadzie na założeniu, że Drosophila pochodzi z obszarów afro-ekwatorialnych. Podczas badania rytmów okołodobowych należy zapoznać się z pewną terminologią. W odniesieniu do niniejszego protokołu, moment włączenia światła w inkubatorze definiuje się jako czas zeitgeber 0 (ZT0), a wszystkie pozostałe czasy są określane względem tej wartości (np. w cyklu 12:12 LD, ZT12 to moment wyłączenia światła). W standardowych warunkach 12:12 LD muchy Drosophila melanogaster typu dzikiego wykazują zazwyczaj dwa okresy aktywności: jeden skupiony wokół ZT0, nazywany pikiem „porannym”, i drugi wokół ZT12, nazywany pikiem „wieczornym” (Rycina 3A). Okresy poranne i wieczorne są kontrolowane przez zegar endogenny, ale występują również reakcje „przestrachu”, które są przejściowymi skokami aktywności w odpowiedzi na przejścia światło/ciemność. Dwa dni entrainmentu to minimum i mogą one zostać zastosowane np. w dużych badaniach przesiewowych, które są bardziej czasochłonne i ukierunkowane na pomiar okresów wolnobieżnych w stałej ciemności (patrz poniżej, krok 2). Jeśli jednak celem jest badanie wzorców aktywności podczas codziennego cyklu światła i ciemności, preferowane jest utrzymywanie much w LD przez 4-5 dni w celu uzyskania większej ilości danych. W zasadzie zwiększenie liczby much lub liczby dni LD w końcowej analizie danych (np. poprzez połączenie danych z ostatnich dwóch dni aktywności lokomotorycznej w LD) pozwoli na wygenerowanie bardziej wiarygodnych profili i pomiarów aktywności dobowej (np. czasu wystąpienia piku porannego lub wieczornego). Co więcej, dobowa dystrybucja aktywności zmienia się w zależności od długości dnia (fotoperiodu) i temperatury. Głównym powodem zmiany fotoperiodu lub temperatury względem standardu jest chęć zbadania, w jaki sposób dobowe wzorce aktywności ulegają adaptacji sezonowej (np. Chen et al. 2007). Muchy Drosophila mogą być również poddawane entrainmentowi za pomocą dobowych cykli temperatury (np. Glaser i Stanewsky 2005; Sehadova et al. 2009). Cykle temperatury różniące się jedynie o 2-3°C są wystarczające do synchronizacji rytmów aktywności.
2. Rytmy wolnobieżnej aktywności lokomotorycznej są mierzone w warunkach stałej ciemności i stałej temperatury po zakończeniu okresu entrainmentu (patrz powyżej, krok 1). Ustawienia cyklu świetlnego można zmienić w dowolnym momencie fazy ciemnej ostatniego dnia LD, tak aby kolejny dzień eksperymentu stanowił pierwszy dzień DD. Siedmiodniowy okres zbierania danych w DD jest wystarczający do obliczenia okresu okołodobowego oraz amplitudy (np. mocy lub siły rytmu) much. Zazwyczaj wielkość próby wynosząca co najmniej 16 much jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych okresów wolnobieżnych dla danego genotypu. Nawet jeśli interesuje nas wyłącznie pomiar aktywności dobowej, najlepiej jest mierzyć okresy wolnobieżne much w DD, ponieważ zmiany w okresie endogennym mogą zmieniać dobową dystrybucję aktywności w LD. Na przykład muchy z długimi okresami endogennymi zazwyczaj wykazują opóźnione piki wieczorne w LD (np. patrz Rycina 4).
3. Po zakończeniu eksperymentu surowe dane binarne zebrane przy użyciu oprogramowania DAM System są pobierane na przenośny nośnik danych, np. pendrive USB.
4. Surowe dane binarne są przetwarzane za pomocą programu DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) i sumowane do przedziałów 15 i 30-minutowych podczas analizy parametrów okołodobowych lub przedziałów od 1 do 5 minut podczas analizy parametrów snu/odpoczynku. Obecnie pięć ciągłych minut nieaktywności jest standardową definicją snu/odpoczynku u Drosophila (Hendricks et al. 2000; Ho i Sehgal 2005).
5. Istnieje wiele różnych sposobów analizy danych zebranych w systemie DAM, jednak przedstawimy jedynie metody rutynowo stosowane w naszym laboratorium. Program Microsoft Excel jest używany do przypisywania genotypów do różnych grup próbek. Oprogramowanie FaasX (M. Boudinot i F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francja) lub Insomniac (program oparty na Matlab; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) są używane odpowiednio do badania parametrów okołodobowych (np. okresu i mocy) lub parametrów snu/odpoczynku (np. procentu snu, średniej długości okresu odpoczynku).

6. Reprezentatywne wyniki

Po zakończeniu niniejszego protokołu ten sam zestaw danych można wykorzystać do zbadania parametrów okołodobowych oraz parametrów snu zwierząt doświadczalnych w odniesieniu do zwierząt kontrolnych.

Analiza parametrów okołodobowych: Wykresy edukcyjne ilustrujące dzienną aktywność lokomotoryczną lub średnią aktywność much w ciągu kilku dni w warunkach LD lub DD można wygenerować za pomocą programu FaasX (Rycina 3). Drosophila melanogaster wykazuje zazwyczaj dwa okresy aktywności: jeden skupiony wokół ZT0 (lub CT), nazywany szczytem „porannym”, oraz drugi wokół ZT12 (CT 12), nazywany szczytem „wieczornym”. Te dwa okresy aktywności są kontrolowane przez endogenny zegar i mogą być obserwowane nawet w warunkach swobodnego biegu w DD (Rycina 3B). Zmiany w czasie występowania tych szczytów aktywności można łatwo zaobserwować na wykresach edukcyjnych, co może wskazywać na zmianę właściwości zegara endogennego. Inną właściwością świadczącą o prawidłowym funkcjonowaniu zegara jest antycypacyjny wzrost aktywności lokomotorycznej obserwowany w cyklach LD, który występuje przed rzeczywistym przejściem z ciemności do światła lub ze światła do ciemności (Rycina 3A, strzałki). Zachowanie to jest wyraźnie widoczne u much typu dzikiego (Rycina 3A), ale nie występuje u mutantów arytmicznych, takich jak per⁰ (Rycina 3C) (Konopka i Benzer, PNAS, 1971). W przypadku mutantów per⁰ obserwowane w LD szczyty „poranne” i „wieczorne” są wyłącznie reakcjami zaskoczenia wynikającymi z nagłych zmian warunków oświetlenia (tzn. muchy „bezzegarowe” nie antycypują zmian środowiskowych, lecz jedynie na nie reagują). Utrata rytmiczności behawioralnej jest znacznie bardziej wyraźna w DD i zazwyczaj objawia się całkowitym zanikiem porannych lub wieczornych szczytów aktywności lokomotorycznej (tzn. występują losowe okresy aktywności i nieaktywności), co widać u much per⁰ (Rycina 3D). Oprócz wykresów edukcyjnych dane o aktywności lokomotorycznej można przedstawić w formie podwójnego aktogramu (FaasX), w którym dane z dwóch dni są naniesione sekwencyjnie na każdej linii, przy czym profil ostatniego dnia rozpoczyna kolejną linię obejmującą aktywność z dwóch dni (Rycina 4). Na przykład LD1 i 2 są naniesione na pierwszej linii aktogramu. Następna linia zaczyna się od powtórzenia LD2, po którym następuje LD3 i tak dalej. Zgodnie z tym formatem, dane o aktywności lokomotorycznej z całego eksperymentu są zilustrowane na aktogramie. Aktogramy można sporządzić dla każdej poszczególnej muchy lub dla każdego genotypu much. Jedną z zalet aktogramów nad wykresami edukcyjnymi jest łatwa obserwowalność zmiany długości okresu dziennych rytmów aktywności (Rycina 4). Poza generowaniem wykresów edukcyjnych i aktogramów, dane o aktywności lokomotorycznej z warunków DD mogą zostać wprowadzone do programu FaasX w celu obliczenia długości okresu przy użyciu szeregu różnych programów, w tym Cycle-P.

Analiza parametrów snu/odpoczynku: Stosując aktualną definicję snu/odpoczynku u Drosophila (Hendricks et al. 2000), która zakłada pięć ciągłych minut braku aktywności, można analizować dane zarejestrowane podczas testów aktywności lokomotorycznej i badać wiele parametrów snu za pomocą Insomniac (L. Ashmore), programu opartego na środowisku Matlab. Procent czasu, który muchy spędzają na śnie, można obliczyć dla różnych przedziałów czasowych, np. procent snu w każdej godzinie (Rycina 5A) lub w ciągu 12 godzin (Rycina 5B). Inne częściej badane parametry snu obejmują średnią długość epizodu odpoczynku (Rycina 5C) oraz liczbę aktywności podczas czuwania (Rycina 5D). Średnia długość epizodu snu/odpoczynku jest miarą konsolidacji snu i może obrazować jego jakość. Aktywność podczas czuwania, zgodnie z nazwą, jest miarą tempa aktywności w czasie, gdy muchy nie śpią. Parametr ten pomaga odróżnić muchy, u których zachowania snu/odpoczynku są rzeczywistym przedmiotem zmian, od osobników chorych lub nadaktywnych. Na przykład muchy, które są po prostu chore, mogą sprawiać wrażenie, że śpią więcej, ponieważ są mniej mobilne. W przypadku takich much ich aktywność podczas czuwania będzie niższa w stosunku do zwierząt kontrolnych.

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający główne etapy badania rytmów aktywności lokomotorycznej u Drosophila. Po lewej stronie przedstawiono procedury, a po prawej pomocnicze uwagi. Czas wymagany do przeprowadzenia niezbędnych krzyżówek i manipulacji genetycznych w celu uzyskania much o odpowiednim genotypie do konkretnych eksperymentów jest zmienny w zależności od charakteru i projektu badania. Dwa kroki oznaczone gwiazdkami (*) określają ramy czasowe, w których dorosłe muchy muszą zostać zaszczepione/skrzyżowane, aby uzyskać potomstwo w odpowiednim wieku (od 1 do 5 dni) do eksperymentu.

Rysunek 2: Schemat połączeń ilustrujący powiązania między różnymi komponentami służącymi do zbierania danych o aktywności lokomotorycznej Drosophila przy użyciu systemu DAM. Do rejestrowania liczby aktywności lokomotorycznej Drosophila wykorzystuje się dedykowany komputer. Monitory aktywności znajdują się wewnątrz inkubatorów wyposażonych w system kontroli temperatury i oświetlenia (włącz/wyłącz). Komputer może być również użyty do sterowania czasem włączania i wyłączania światła w inkubatorach, jeśli źródło zasilania systemu oświetlenia może zostać podłączone do jednostki zasilającej (opcjonalnie). Komunikacja między komputerem a monitorami aktywności/inkubatorami jest zarządzana przez interfejs jednostki zasilającej. Komputer, jednostka zasilająca i inkubatory (jeśli sterowanie oświetleniem jest niezależne od komputera) są podłączone do gniazda zasilania AC poprzez zasilacz UPS, aby zapewnić nieprzerwane monitorowanie aktywności i ciągłe oświetlenie podczas fazy jasnej. Zaleca się podłączenie wszystkich urządzeń elektrycznych do obwodów zasilania awaryjnego w obiekcie, jeśli są one dostępne.

Rycina 3: Wykresy aktogramów wygenerowane za pomocą FaasX, przedstawiające dobowe rytmy aktywności lokomotorycznej rytmicznych much typu dzikiego (muchy w per⁰ niosące transgen per+) (A i B) w porównaniu z arytmicznymi mutantami w per⁰ (C i D). Samce much utrzymywano w temperaturze 25°C i poddawano synchronizacji przez 4 dni w cyklach 12:12 LD (światło: ciemność), a następnie przez siedem dni w DD (stała ciemność). Dla każdej linii much mierzono poziom aktywności lokomotorycznej poszczególnych osobników (n>32) w 15-minutowych odstępach czasu, a następnie wyliczano średnią, aby uzyskać profil grupowy reprezentatywny dla danej linii. Panele A i C przedstawiają dane aktywności uzyskane z uśrednienia drugiego i trzeciego dnia w cyklu światło/ciemność (LD 2-3), natomiast panele B i D przedstawiają dane aktywności uzyskane z uśrednienia drugiego i trzeciego dnia w stałej ciemności (DD 2-3). Pionowe słupki reprezentują aktywność (w jednostkach umownych) zarejestrowaną w 15-minutowych odstępach czasu podczas okresu światła (jasnoszary) lub okresu ciemności (ciemnoszary). Poziome paski na dole aktogramów LD: biały – światło włączone; czarny – światło wyłączone. ZT0 i ZT12 reprezentują odpowiednio początek i koniec fotoperiodu. W przypadku aktogramów DD: CT0 i CT12 reprezentują początek i koniec subiektywnego dnia w warunkach stałej ciemności, oznaczonych szarym paskiem. W panelu A: M = szczyt poranny; E = szczyt wieczorny. Strzałki w panelu A reprezentują zachowania antycypacyjne szczytów porannych i wieczornych obserwowane u much typu dzikiego, których brak jest u arytmicznych much w per⁰.

Rysunek 4: Podwójny aktogram wygenerowany za pomocą oprogramowania FaasX, ilustrujący dane dotyczące aktywności lokomotorycznej much o okresie dzikim, krótkim lub długim. Samce much utrzymywano w temperaturze 25°C i synchronizowano przez 4 dni w cyklach LD 12:12, po czym następowało osiem dni w stałej ciemności (DD) w celu obliczenia okresu swobodnego (t) przy użyciu Cycle-P w programie FaasX. Przedstawiono tutaj trzy linie much o okresie dzikim [w per⁰; per+; mutant per⁰ niosący transgen per+], okresie długim [w per⁰; per(S47A); mutant per⁰ niosący transgen per(S47A)] oraz okresie krótkim [w per⁰; per(S47D); mutant per⁰ niosący transgen per(S47D)] (Chiu et al. 2008). Oś X reprezentuje czas ZT lub CT odpowiednio w LD lub DD, a oś Y reprezentuje liczbę aktywności (jednostki umowne) zsumowane w 15-minutowych przedziałach. Czerwone linie przerywane łączą wieczorne piki dla każdego dnia eksperymentu. Należy zauważyć, że podczas LD wieczorny pik jest „wymuszony”, aby zachować synchronizację z 24-godzinnym cyklem LD, natomiast w DD okres swobodny może odbiegać od 24 h. Na przykład w przypadku much o krótkich okresach czas wieczornej aktywności będzie występował wcześniej każdego kolejnego dnia w DD (przy nanoszeniu na 24-godzinną skalę czasu, jak pokazano tutaj), natomiast w przypadku much o długich okresach obserwuje się przesunięcie w prawo.

Rycina 5: Ilościowe określanie parametrów snu u Drosophila. Muchy (Canton-S; CS) poddano standardowemu cyklowi LD 12:12 w temperaturze 25°C. Do przetwarzania danych wykorzystano program Insomniac (L. Ashmore), a do wygenerowania przedstawionych wykresów program Microsoft Excel. W celu uzyskania średnich grupowych i słupków błędów (standardowy błąd średniej) połączono dane z co najmniej 70 much. (A) Sen bazowy obliczony w odstępach godzinnych; przedstawiono reprezentatywny cykl dobowy. (B) Sen bazowy reprezentatywnego cyklu dobowego obliczony w odstępach 12-godzinnych. (C) Średnia długość każdego epizodu spoczynku obliczona w interwałach 12-godzinnych. (D) Tempo aktywności po przebudzeniu obliczone w odstępach 12-godzinnych.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisaliśmy procedury pomiaru rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila, które stanowią wiarygodny behawioralny wskaźnik działania zegarów okołodobowych much i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara. Metoda ta była stosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w poszukiwaniu nowych mutantów zegara (np. Konopka i Benzer 1971; Dubruille et al. 2009) i jest stale wykorzystywana do analizy i zrozumienia funkcji zegara in vivo. Służyła ona również do badania cyklu sen-czuwanie u much, choć ostatnie doniesienia sugerują, że cyfrowa analiza wideo jest znacznie bardziej niezawodna w kwantyfikacji snu niż pomiary rytmów aktywności lokomocyjnej (Zimmerman et al. 2008). Przy wykorzystaniu rytmów aktywności lokomocyjnej do analizy snu, procent snu w ciągu dnia ma tendencję do bycia zawyżonym.

Aby zapewnić sukces i powtarzalność tego protokołu, kluczowe jest badanie much o zbliżonym wieku, tle genetycznym i hodowanych w tych samych warunkach, ponieważ fenotypy behawioralne u muszek owocówek, takie jak rytm dobowy oraz aktywność sen/odpoczynek, są bardzo wrażliwe na wszystkie te czynniki. Przy użyciu wielu inkubatorów w jednym eksperymencie ważne jest upewnienie się, że wszystkie inkubatory mają przewidywaną temperaturę, ponieważ niektóre parametry okołodobowe mogą zmieniać się w funkcji temperatury. Jedna uwaga przy rozważaniu zakupu inkubatorów do pracy z muchami: nie wszystkie są takie same. Choć unikamy rekomendowania konkretnych urządzeń, istnieje wiele opcji. Dobre źródło informacji o firmach sprzedających inkubatory do prac z Drosophila znajduje się na stronie . Niektóre firmy sprzedają nawet inkubatory „do rytmów dobowych Drosophila”, w których dostępne są dodatkowe funkcje, takie jak okablowanie pod system Trikinetics i regulacja rampingowa temperatury (np. Tritech). Ważne funkcje obejmują możliwość dobowej kontroli światła oraz dobrą stabilizację temperatury w zakresie fizjologicznym dla Drosophila (~15-30°C). Ceny i rozmiary inkubatorów bardzo się różnią, ale dzięki nowszym monitorom aktywności od Trikinetics nawet małe inkubatory mogą pomieścić sporą liczbę tych urządzeń. Ponadto, choć można używać inkubatorów z kontrolą wilgotności, ta dodatkowa funkcja nie jest konieczna, o ile umieści się małą miseczkę z wodą w celu zapewnienia wilgotności (wystarczy 50-70%). Na koniec, mimo że w tym protokole rutynowo używamy programów FaasX i Insomniac do analizy danych, dostępne są alternatywne programy i oprogramowanie (Rosato i Kyriacou 2006), np. ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Rhythm Package (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston) oraz MAZ (Zordan et al. 2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monitor aktywności Drosophila (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 lub DAM5	Monitory DAM2 są bardziej kompaktowe, co pozwala na umieszczenie większej liczby urządzeń w jednej inkubatorze
Interfejs jednostki zasilania (dla systemu DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Zawiera zasilacz AC PS9-1
Sterownik oświetlenia	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Szklane rurki Pyrex	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7 oraz PGT10
Plastikowe nakrętki do rurek do badania aktywności	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Zamiast plastikowych nakrętek można użyć nici.
Oprogramowanie do zbierania danych systemu DAM	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Dostępne wersje dla Mac i PC
Oprogramowanie FaasX	Centre National de la Recherche Scientifique		Tylko dla Mac
Oprogramowanie Insomniac 2.0	University of Pittsburgh School of Medicine		Działa w środowisku Matlab. Może być używane zarówno na PC, jak i Macintosh.
Inkubator środowiskowy z kontrolą temperatury i cyklu dobowego, np. inkubator Percival	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Wymiary przestrzeni wewnętrznej: Szerokość: 65cm; Wysokość: 86cm; Głębokość: 55cm
Inkubator środowiskowy z kontrolą temperatury i cyklu dobowego, np. inkubator grzewczo-chłodzący DigiTherm z oświetleniem i temperaturą sterowanymi rytmem okołodobowym	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Wymiary przestrzeni wewnętrznej: Szerokość: 36m; Wysokość: 56m; Głębokość: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Awaryjna jednostka zasilania zapasowego)	APC	SU2200NET	Moc wyjściowa 1600 Watów
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S7903
Agar Bacto	BD Biosciences	214010
Granulki parafiny TissuePrep	Fisher Scientific	T565	Temperatura topnienia 56°C-57°C
Grzejnik blokowy	VWR international	12621-014