Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Podsumowanie

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Streszczenie

Zdolność do genetycznego usuwania konkretnych komponentów różnych kaskad sygnałowych komórek stała się nieodzownym narzędziem w nowoczesnej analizie transdukcji sygnałów. Jedną z konkretnych metod umożliwiających taką warunkową delecję jest zastosowanie systemu Cre-loxP. Metoda ta polega na flankowaniu interesującego genu miejscami loxP, które stanowią specyficzne sekwencje rozpoznawane przez białko rekombinazę Cre. Poddanie tak zwanego DNA floxed (flankowanego miejscami loxP) działaniu tego enzymu prowadzi do procesu rekombinacji zależnej od Cre w miejscach loxP, a w konsekwencji do wycięcia znajdującego się pomiędzy nimi genu³. Istnieje kilka różnych metod dostarczania rekombinazy Cre do interesowanego miejsca. W tym filmie prezentujemy zastosowanie adenowirusa zawierającego gen rekombinazy Cre do infekcji pierwotnych zarodkowych fibroblastów mysich (MEFs) uzyskanych z embrionów posiadających allel Rac1 w wersji floxed¹. Podstawą wyboru MEFs z genem Rac1 do naszych eksperymentów jest fakt, że po delecji Rac1 można zaobserwować wyraźne zmiany morfologiczne wynikające z modyfikacji cytoszkieletu aktynowego^2,5. 72 godziny po transdukcji wirusowej i ekspresji Cre komórki wybarwiono przy użyciu barwnika do aktyny – falooidyny – i obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej. Zaobserwowano, że MEFs poddane działaniu wirusa adeno-Cre wykazywały morfologię kurczliwą i wydłużoną w porównaniu z komórkami nieinfekowanymi, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami^2,5. Metoda dostarczania rekombinazy Cre za pomocą adenowirusa jest korzystna, ponieważ wirus adeno-Cre jest łatwo dostępny, a zoptymalizowana infekcja adenowirusowa pozwala na osiągnięcie delecji genu za pomocą Cre w niemal 100% komórek.

Protokół

Rozmrażanie komórek

1. Wyjąć zamrożone embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) (wygenerowane wcześniej z pierwotnych kultur pojedynczych embrionów) z ciekłego azotu.
2. Rozmrozić komórki, zanurzając fiolkę w wodzie o temperaturze 37°C i delikatnie nią obracając, aż zawartość zostanie całkowicie rozmrożona.
3. Do płytki hodowli komórkowej o średnicy 10 cm dodać 9 mL DMEM uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
4. Rozmrożoną zawiesinę komórkową dodawać kroplami do płytki, delikatnie nią kołysząc w celu rozproszenia komórek, a następnie umieścić płytkę na noc w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂. Należy pamiętać, że jeśli komórki są wrażliwe na DMSO (stosowany w procesie mrożenia), początkową pożywkę można zastąpić świeżą po tym, jak komórki przywrą do płytki (około czterech godzin po wysiewaniu). Należy również zwrócić uwagę, że stopień zrastania się komórek po rozmrożeniu zależy od liczby zamrożonych komórek, szybkości ich regeneracji po zamrażaniu oraz tempa ich wzrostu.

Pasażowanie komórek

5. Gdy komórki osiągną niemal 10% konfluencji (tj. następnego dnia), odessać pożywkę i przemyć komórki 5mL sterylnego PBS.
6. Usunąć PBS i dodać 1mL trypsyny zawierającej 10mM EDTA, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze na około 5 minut, aby umożliwić odłączenie się komórek od płytki.
7. Po odłączeniu się komórek, dodać 9mL pożywki do komórek poddanych trypsynizacji, pipetować 2-3 razy w celu rozbicia skupisk, a następnie dodać 1mL tej zawiesiny kroplami na nową płytkę zawierającą 9mL pożywki i inkubować w 37°C przez noc. Obecność FBS w pożywce zneutralizuje trypsynę – alternatywnie komórki można najpierw przemyć, aby rozcieńczyć trypsynę.

Liczenie i wysiewanie komórek na szkiełka nakrywki

8. Wyjąć komórki z inkubatora, przemyć i poddać trypsynizacji zgodnie z wcześniejszą procedurą, z wyjątkiem tego, że tym razem do komórek po trypsynizacji należy dodać 5–6 ml pożywki zamiast 9 ml.
9. Dokładnie pipetować komórki, aby zapewnić całkowitą dysocjację do zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie usunąć 15μL połączyć z 15μL trypan blue w oddzielnej probówce do mikrowirówki.
10. Wymieszać tę zawiesinę komórek w błękicie trypanu, pipetując ją kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie dodać 15μL do hemocytometru.
11. Pod mikroskopem martwe komórki będą widoczne jako niebieskie. Należy policzyć liczbę przejrzystych/bezzbarwnych (żywych) komórek w jednym z czterech pól 4x4 komory licznikowej (hemocytometru). Powtórzyć to liczenie w trzech pozostałych polach 4x4 (oznaczonych jako A, B, C i D), a następnie zastosować poniższe równanie, aby obliczyć liczbę komórek na μL zawiesiny:
    
12. Dzięki optymalizacji protokołu ustalono, że wysianie 30 0 komórek pozwala na uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek do wizualizacji po zakończeniu eksperymentu.
13. Aby obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do uzyskania 30 00 komórek, należy zastosować następujące równanie:
    
14. Następnie do każdego dołka płytki sześcio-dołkowej należy włożyć sterylną szklaną lamellkę i dodać 2 ml pożywki do każdego dołka, a następnie kroplowo dodać z zawiesiny komórkowej objętość odpowiadającą 30 0 komórek na każdy dołek. Należy pamiętać, że w tym doświadczeniu zastosowano szklane lamellki, ponieważ w późniejszym czasie będziemy wizualizować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; nie wszystkie zastosowania wymagają mikroskopii, zatem lamellki mogą nie być konieczne.

Transdukcja wirusowa

15. Po kilku godzinach lub przez noc (przez czas wystarczający do zapewnienia adhezji komórek do szkiełek podstawkowych) należy usunąć pożywkę i przemyć komórki 1 ml bezsurowiczego DMEM.
16. Do każdej studzienki należy dodać 1 ml pożywki bezsurowiczej w celu wprowadzenia wirusa. W tym doświadczeniu wirus adeno-Cre został zakupiony komercyjnie w firmie Vector Biolabs.
17. Poprzednia optymalizacja protokołu wykazała, że wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 50 zapewnia bardzo wydajną transdukcję genów do pierwotnych MEF, wywierając niewielki lub żaden wpływ na żywotność komórek. MOI można obliczyć w następujący sposób:
    
    
    
18. Dodaj obliczoną objętość wirusa bezpośrednio do każdej studni przeznaczonej do infekcji, delikatnie kołysz płytką, aby rozprowadzić wirusa, a następnie umieść komórki w 37°C inkubator przez noc.
19. Następnego dnia rano usunąć pożywkę zawierającą wirusa z komórek, przemyć komórki 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodać 2 ml zwykłej pożywki do każdej studni.
20. W przypadku komórek Rac1 przedstawionych w tym eksperymencie, zmiany morfologiczne wystąpiły w komórkach około 72 godzin po transdukcji.

Reprezentatywne wyniki

Komórki zwizualizowano poprzez barwienie faloidyną na aktynę (wyłącznie w celach obrazowania), a następnie wykonano zdjęcia przy użyciu wielofotonowego konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS-SP5 w Advanced Analysis Centre na Uniwersytecie w Guelph. Rycina 1 przedstawia skurczoną i wydłużoną morfologię komórek Rac1^flox/flox poddanych działaniu wirusa adeno-Cre w porównaniu do tych samych komórek nieeksponowanych na wirusa.

Rysunek 1. Porównanie Rac1^flox/flox komórki zainfekowane wirusem adeno-Cre (po lewej) w porównaniu z niezinfekowanymi komórkami z tego samego źródła (po prawej).

Dyskusja

Towarzyszące wideo demonstruje, w jaki sposób wirus rekombinowany może zostać wykorzystany do wycięcia specyficznego genu in vitro przy użyciu rekombinazy Cre. Opracowanie tego protokołu ujawniło jednak kilka szczególnych kwestii, które warto omówić.

• Podczas pracy z adenowirusami należy zawsze stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa. Podczas pracy z wirusem należy przez cały czas nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Pożywki oraz sprzęt plastikowy należy poddać działaniu 10% roztworu wybielacza przez co najmniej 30 minut, a następnie sprzęt plastikowy należy autoklawować.
• Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania zapasów wirusa, ponieważ może to wpłynąć na miano wirusa, a tym samym obniżyć wydajność transdukcji. Małe objętości zapasów wirusa należy początkowo podzielić na osobne alikwoty w oddzielnych probówkach.
• Podczas opracowywania metody testowano wartości MOI w zakresie od 50 do 500; w większości przypadków zaobserwowano wysoką wydajność transdukcji bez negatywnego wpływu na żywotność komórek.
• Podczas opracowywania metody wykorzystano również Adeno-GFP w celu szybkiego przesiewu wydajności transdukcji. Kontrolę tę (lub pusty wektor) należy przeprowadzić podczas eksperymentu, aby upewnić się, że sama infekcja wirusowa nie powoduje zmian komórkowych. Podobnie, jeśli wycięcie genu z locus floxed w badanych komórkach nie powoduje żadnych zmian komórkowych (np. zmian w morfologii lub żywotności), zainfekowanie tego samego typu komórek za pomocą adeno-GFP jest ważną kontrolą służącą do wykazania, że transdukcja wirusowa zachodzi.

Poza badaniem kaskad sygnalizacyjnych w hodowlach komórkowych, podejście adeno-Cre stosowano również in vivo do warunkowego usuwania genów z organizmów zwierząt doświadczalnych^3,4 oraz do znakowania specyficznych populacji komórek wewnątrz organizmu⁶. System adenowirusowy można również zaadaptować do wprowadzania do komórek gospodarza genów innych niż rekombinaza Cre. Dwie główne zalety stosowania tego wektora dostarczającego to wysoka wydajność transdukcji i dostarczania genów oraz brak integracji z DNA gospodarza. Jednak generowanie nowych rekombinowanych adenowirusów może być pracochłonne. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zatem możliwości systemu adenowirusowego poprzez zastosowanie wcześniej opracowanego wirusa adeno-Cre i powiązanie go z naszym floksowanym allelem docelowym, Rac1. W ramach tego eksperymentu z warunkowym wyłączeniem genu potwierdziliśmy, że transdukcja wirusem adeno-Cre komórek MEF posiadających floksowany allel Rac1 rzeczywiście powoduje wycięcie Rac1, co prowadzi do zmian w morfologii komórkowej charakterystycznych dla komórek z niedoborem Rac1^2,5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirus Ad-CMV-Cre	Vector Biolabs	1045
Pożywka DME z wysoką zawartością glukozy 500mL	Fisher Scientific	SH3002201
FBS pochodzenia kanadyjskiego 500mL	VWR international	CAA15-701
Roztwór PEN-STREP 1X 100mL	Fisher Scientific	SV30010
Faloidyna Texas Red-X	Invitrogen	T7471
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T4549