Technika hodowli całego zarodka pozwala na hodowlę zarodków myszy i szczura w warunkach ex vivo przez ograniczony czas, odpowiadający etapom środkowej okresu ciężywności. W niniejszym protokole wideo prezentujemy standardowe procedury hodowli całego zarodka szczura po E12.5 przy użyciu systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda hodowli całych embrionów gryzoni z wykorzystaniem systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technika hodowli całych zarodków (whole embryo culture, WEC) została opracowana w latach 50. XX wieku przez Newa i jego współpracowników i zastosowana w biologii rozwoju 1. Chociaż rozwój i wzrost zarodków ssaków są krytycznie zależne od funkcji łożyska, technika WEC pozwala na hodowlę zarodków myszy i szczura w warunkach ex vivo przez ograniczone okresy odpowiadające etapom połowy okresu ciężności, tj. od dnia embrionalnego (E) 6,5 do E12,5 u myszy lub od E8,5 do E14,5 u szczura 2, 3, 4. W metodzie WEC możemy bezpośrednio celować w pożądane obszary zarodków za pomocą cienkich kapilar szklanych, ponieważ zarodki można manipulować pod mikroskopem. W związku z tym WEC gryzoni jest bardzo użyteczną techniką w badaniach dynamicznych procesów rozwojowych poimplantowanych zarodków ssaków. Do tej pory opracowano kilka rodzajów systemów WEC 1. Wśród nich system hodowli w butelce z rotatorem jest najpopularniejszy i najlepiej nadaje się do długoterminowej hodowli zarodków w połowie okresu ciężności, tj. po E9,5 u myszy i E11,5 u szczura 1. W niniejszym protokole wideo prezentujemy nasze standardowe procedury WEC szczura po E12,5 z wykorzystaniem ulepszonego modelu oryginalnego systemu rotacyjnego, zaprojektowanego przez Newa i Cockrofta 5, 6, oraz przedstawiamy różne zastosowania techniki WEC w badaniach nad biologią rozwoju ssaków.
Protokół
1. Konfiguracja systemu WEC
- Podłączyć filtr membranowy 0.22 μm do silikonowej rurki doprowadzającej w systemie WEC a).
- Otworzyć zawór butli z gazem zawierającej O2 (95%) i CO2 (5%). Doprowadzić mieszaninę gazów do bębna poprzez butelkę do napowietrzania zawierającą wodę autoklawowaną.
- Ustawić przepływ mieszaniny gazowej na 50 cc.
- Włożyć silikonową rurkę odpływową do butelki z wodą i sprawdzić przepływ mieszaniny gazowej.
- Obracać bęben z prędkością 20 rpm/min.
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej
- Rozmrozić surowicę szczura poddaną natychmiastowemu wirowaniu (IC) w temperaturze 37.0°C b). Dodać D-glukozę (2 mg/ml) do rozmrożonej surowicy w autoklawowanym zlewce o pojemności 100 ml. Pożywka powinna być przygotowana na poziomie kultury pierwotnej (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
- Dodać do surowicy roztwór antybiotykowo-antymykotyczny (100X) w rozcieńczeniu 1: 400.
- Odparować pozostały izofluran (użyty do znieczulenia szczurów podczas pobierania krwi) z surowicy przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) c).
- Zsterylizować pożywkę za pomocą filtra membranowego o wielkości porów 0.45 μm.
- Nalać 3.0 ml pożywki do każdej butelki hodowlanej i zamknąć górną część każdej butelki korkiem silikonowym, przykrytym folią aluminiową (patrz odsyłacz 14) d).
- Przygotować trzy lub cztery jednorazowe płytki Petriego zawierające sól Tyrodea e).
3. Znieczulenie szczura i izolacja macicy
- Głęboko znieczul szczurkę w określonym dniu ciąży, stosując środki znieczulające wziewnie lub parenteralnie.
- Oczyść okolicę brzuszną znieczulonej ciężarnej szczurki 70% ethanolem.
- Chwyć skórę pęsetą i wyeksponuj ścianę brzuszną, rozcinając skórę dużymi nożyczkami f).
- Chwyć ścianę brzuszną pęsetą i wykonaj dużymi nożyczkami duże nacięcia podłużne w kształcie litery U na ścianie brzusznej, aż do poziomu klatki piersiowej g).
- Odsuń jelita na lewą stronę pęsetą i odsłoń jeden koniec macicy połączony z jajnikiem.
- Chwyć koniec macicy pęsetą i przetnij miejsce między macicą a jajnikiem dużymi nożyczkami.
- Wyjmij macicę z ciężarnej szczurki, odcinając tkankę tłuszczową wokół niej, aż do drugiego końca macicy.
- Przenieś macicę do szalki Petriego zawierającej roztwór Tyrode'a.
- Po usunięciu macicy uśmierć szczurkę poprzez nadmierną dawkę środków znieczulających lub poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.
4. Usuwanie zarodków z macicy
- Krótko opłucz macicę w soli Tyrode'a i przenieś ją do drugiej szalki Petriego za pomocą precyzyjnej pęsety h).
- Pod mikroskopem binokularnym uchwyć ścianę macicy precyzyjną pęsetą i przetnij ją prostopadle do krezki macicy po stronie przeciwnej do naczyń krwionośnych, używając prostych nożyczek oftalmologicznych.
- Wprowadź końcówkę prostych nożyczek oftalmologicznych w przestrzeń między ścianą macicy a deciduą. Przetnij ścianę macicy wzdłużnie po stronie antymezometrialnej.
- Zgrupuj deciduę po stronie krezki macicy i oddziel koncepcje od macicy, używając dwóch par precyzyjnych pęset i).
- Przenieś koncepcje do trzeciej szalki Petriego za pomocą wysterylizowanej szklanej pipety o odpowiedniej średnicy.
5. Disekcja embrionów szczura
- Wprowadź jeden koniec mikro pincety do błony蜕decidua i wykonaj cięcie poprzeczne w błonie decidua wokół conceptusu, używając dwóch par pęset.
- Wprowadź końcówki pęset do błony decidua po stronie łożyska i wykonaj dwa cięcia podłużne w błonie decidua w kierunku góry.
- Usuń błonę decidua po stronie łożyska, wyrywając ją dwiema parami pęset. Usuń pozostałą błonę decidua dwiema parami pęset.
- Chwyć błonę Reicherta, wykonaj w niej cięcie poziome i oddziel błonę od conceptusu po stronie przeciwległej do łożyska.
- Za pomocą dwóch par pęset wykonaj mały otwór w pęcherzyku żółtkowym w pobliżu głowy zarodka, a następnie przetnij pęcherzyk żółtkowy zakrzywionymi nożyczkami okulistycznymi. Ważne jest, aby nie uszkodzić głównych naczyń krwionośnych.
- Chwyć błonę owodni w okolicy głowy zarodka dwiema parami cienkich pęset i delikatnie wyciągnij zarodek z pęcherzyka żółtkowego, rozrywając owodni h). Ciało zarodka powinno zostać wyciągnięte z pęcherzyka żółtkowego, aby zwiększyć podaż tlenu dla zarodka w stadium połowy okresu ciążowego.
6. Hodowla całego zarodka
- Sprawdzić uszkodzenia łożyska, pęcherzyka żółtkowego oraz stan pracy serca i krążenia krwi.
- Przenieść embrion do butelki hodowlanej za pomocą sterylnej szklanej pipety, uważając, aby nie rozciągać pępowiny. Ilość przeniesionego roztworu Tyrode'a do butelek hodowlanych powinna być jak najmniejsza.
- Wyjąć pełną zatyczkę silikonową z bębna rotacyjnego. Podłączyć butelkę hodowlaną z zatyczką z otworem prostopadle do bębna rotacyjnego systemu WEC. Należy uważać, aby nie wywierać nacisku na bęben w niewłaściwych kierunkach, ponieważ bęben rotacyjny jest bardzo precyzyjnym urządzeniem. Butelki zawierające wypreparowane embriony są przenoszone do hodowli jedna po drugiej; należy ograniczyć otwieranie przednich drzwi inkubatora, aby uniknąć spadku temperatury wewnątrz j).
- Po 10 h hodowli zwiększyć objętość przepływu mieszaniny gazów do 75 cc, a po 24 h do 100 cc (Tabela 1).
- Po około 24 h należy wymienić pożywkę hodowlaną, przenosząc hodowany embrion do nowej butelki hodowlanej ze świeżo przygotowaną pożywką. Zwiększyć objętość przepływu do 125 cc po 34 h i do 150 cc po 48 h (Tabela 1).
- Okazyjnie sprawdzać stan hodowanych embrionów poprzez pomiar częstotliwości uderzeń serca (optymalnie 120-150/min) oraz obserwację krążenia krwi. W razie potrzeby policzyć liczbę somytów, aby ocenić wzrost embrionów w roztworze Tyrode'a. W prawidłowym rozwoju jedna somyta pojawia się co dwie godziny.
- Po zakończeniu procedury WEC zatrzymać dopływ mieszaniny gazów i odłączyć rurkę wlotową oraz filtr membranowy, aby uniknąć cofania się cieczy z butelki do napowietrzania do rurki wlotowej.
7. Uwagi
- Temperatura wewnątrz systemu WEC jest stale utrzymywana w zakresie 37,0-37,5°C.
- W naszym systemie WEC do hodowli embrionów szczura i myszy rutynowo stosuje się 100% surowicy IC szczura, którą przed użyciem przechowuje się w temperaturze -20°C.
- Surowicę IC szczura pozyskujemy z osobników znieczulonych izofluranem.
- Jednorazowe butelki są dostępne również w firmie Ikemoto Rika. Butelki oraz silikonowe korki należy poddać autoklawowaniu.
- Disekcję embrionów należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT), ponieważ utrzymywanie embrionów w zbyt niskiej lub zbyt wysokiej temperaturze podczas zabiegu wpływa na ich późniejszy rozwój w systemie WEC.
- Narzędzia do disekcji są sterylizowane metodą suchego ciepła.
- Skórę i ścianę brzucha należy rozcinać oddzielnie, aby w maksymalnym stopniu uniknąć zanieczyszczenia naczynia włosami. Przy rozcinaniu skóry oraz podczas izolacji macicy stosujemy odpowiednio nową parę dużych nożyczek i nową pęsetę.
- Użycie pęset z cienkimi końcówkami jest kluczowe dla precyzyjnego przeprowadzenia disekcji tkanek. Końcówki pęset ostrzymy ręcznie przy użyciu kamienia i oleju maszynowego.
- Jedną z krawędzi pęsety używamy jak noża, aby uniknąć nadmiernego nacisku na embriony.
- Gdy temperatura wewnątrz systemu WEC spada na skutek wielokrotnego otwierania drzwiczek, pozostawiamy włączone światło, aby utrzymać temperaturę wewnątrz systemu.
8. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia procedury sekcji zarodka szczura oraz hodowanych zarodków szczura.
Rysunek 1. Hodowla całego embrionu szczura w stadium E12.5. (A) Conceptus wypreparowany z macicy ciężarnej szczurzycy. (B) Usunięcie decidua od strony łożyska. (C) Usunięcie błony Reicherta. (D) Otwarcie pęcherzyka żółtkowego. (E) Embrion szczura hodowany w butelce przez 6 h od rozpoczęcia WEC. (F) Embrion szczura hodowany przez 42 h. d, decidua; R, błona Reicherta; p, łożysko; ys, pęcherzyk żółtkowy; e, embrion.
| 0 h | 12 godz. | 24 h | 36 godz. | 48 godz. | |
| embrion szczura E12.5 | 95% 50 ml | 95% 75 cm³ (10 godz.) | 95% 100 cm³ | 95% 125 ml (34 godz.) | 95% 150 ml |
Tabela 1. Optymalne warunki natlenienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przypadku hodowli embrionów gryzoni poza organizmem (WEC), kluczowe dla sukcesu są dwa etapy. Po pierwsze, procedura wycięcia musi być precyzyjna, aby nie uszkodzić embrionów, a w szczególności naczyń krwionośnych. Po drugie, procedura powinna przebiegać tak szybko, jak to możliwe, ponieważ po wyjęciu z macicy tlen i składniki odżywcze nie są już dostarczane przez łożysko. Jest to krytyczne w przypadku starszych embrionów. W przypadku WEC szczura po E12.5, wycięte embriony należy przenieść do butelek hodowlanych w ciąg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy panu Hajime Ichijo za nagranie wideo oraz pomocne uwagi dotyczące montażu filmu. Dziękujemy również dr. Yuji Tsunekawie i dr. Kaichi Yoshizakie za uprzejmą pomoc przy nagrywaniu wideo. Praca ta jest wspierana przez KAKENHI w ramach Young Scientist B oraz Priority Areas- Molecular Brain Science z MEXT w Japonii. Przyznajemy, że wsparcie zapewnił Global COE Program „Basic and Translational Research Center for Global Brain Science” z MEXT w Japonii oraz The Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST) z Japanese Science and Technology Corporation z Japanese Science and Technology Agency (JST).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| System WEC (10-0310) | Narzędzie | Ikemoto Rika | 010-0310 | Dostępny jest również inny mały model. |
| Silikonowy korek bez otworu | Narzędzie | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Butla z mieszaniną gazową | Narzędzie | Nikko Sanso | - | Zawierająca 95% tlenu & 5% dwutlenku węgla. Zamówienie indywidualne. |
| Regulator gazu | Narzędzie | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| Filtr 0,22 μm Millex GS | Narzędzie | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Duże nożyczki | Narzędzie | Napox | B-7H | |
| Pęseta | Narzędzie | Napox | A-3-2 | |
| Jednorazowa szalka Petriego (90 mm x 15 mm) | Narzędzie | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Szalka typu głębokiego jest najlepsza do sekcji. |
| Izofluran | Odczynnik | Abbott Laboratories | B506 | Do znieczulenia |
| Pentobarbital sodowy | Odczynnik | Merck & Co. | - | Do znieczulenia |
| Sól fizjologiczna Tyrode’a | Odczynnik | Zgodnie z protokołem w Ref. 2. Przechowywać w 4°C. | ||
| Szczur Sprague-Dawley w określonym dniu ciąży | Zwierzę | Charles River Laboratories | - | |
| Szklana butelka hodowlana | Narzędzie | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Jednorazowa butelka hodowlana | Narzędzie | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silikonowy korek z otworem | Narzędzie | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Folia aluminiowa | Narzędzie | Dowolny dostawca | - | |
| Worek do autoklawowania | Narzędzie | Hogy | HM-26 | Do butelek hodowlanych |
| Worek do autoklawowania | Narzędzie | Hogy | HM-14A | Do silikonowych korków |
| Filtr 0,45 μm Millex HA | Narzędzie | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| Probówka stożkowa 50 ml | Narzędzie | BD Biosciences | 352070 | |
| Zlewka 100 ml | Narzędzie | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Surowica IC szczura | Odczynnik | Charles River Laboratories | - | Kontakt: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-glukoza | Odczynnik | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Roztwór antybiotyk-antymykotyk | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Proste nożyczki okulistyczne | Narzędzie | Napox | MB50-7 | Do przecinania ściany macicy |
| Zakrzywione nożyczki okulistyczne | Narzędzie | Napox | MB54-2 | Do przecinania pęcherzyka żółtkowego |
| Pęseta #5 | Narzędzie | Vigor | T6715 | |
| Pęseta #5F | Narzędzie | Regine | T6819 | |
| Pipeta szklana | Narzędzie | Wykonana ręcznie z pipety Pasteura. | ||
| Worek do autoklawowania | Narzędzie | Hogy | HM-4 | Do pipet szklanych |
| Mikroskop binokularny | Narzędzie | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Lampy | Narzędzie | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Kamień olejowy | Narzędzie | Uchida Yoko | 833-2000 | Do ostrzenia pęset |
| Olej maszynowy | Narzędzie | Uchida Yoko | 835-0000 | Do ostrzenia pęset |
Bibliografia
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
