$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Konfiguracja systemu WEC
- Podłącz filtr membranowy o porach 0,22 μm do silikonowej rurki wlotowej w systemie WEC a).
- Otwórz zawór butli z gazem zawierającej O2 (95%) i CO2 (5%). Przeprowadź mieszaninę gazów do bębna poprzez butelkę z bąbelkowaniem zawierającą autoklawowaną wodę.
- Ustaw przepływ mieszaniny gazów na 50 cc.
- Włóż silikonową rurkę wylotową do butelki z wodą i sprawdź przepływ mieszaniny gazów.
- Obracaj bęben z prędkością 20 rpm/min.
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej
- Rozmrozić surowicę szczurzą odwirowaną natychmiastowo (IC) w temperaturze 37.0°C b). Do rozmrożonej surowicy w autoklawowanym zlewku o pojemności 100 ml dodać D-glukozę (2 mg/ml). Pożywkę należy przygotować na poziomie kultury pierwotnej (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
- Do surowicy dodać płynny antybiotyk-antymykotyk (100X) w rozcieńczeniu 1:400.
- Pozostawić surowicę na 20 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby odparować pozostały izofluran (stosowany podczas znieczulania szczurów w trakcie pobierania krwi) c).
- Zsterylizować pożywkę za pomocą filtra membranowego o wielkości oczek 0.45 μm.
- Wlać 3.0 ml pożywki do każdej butelki hodowlanej i zamknąć wlew każdej butelki korkiem silikonowym, przykrytym folią aluminiową (patrz odniesienie 14) d).
- Przygotować trzy lub cztery jednorazowe szalki Petriego zawierające sól Tyrode'a e).
3. Znieczulenie szczura i izolacja macicy
- Głęboko znieczul szczurkę w określonym dniu ciąży przy użyciu środków znieczulających podawanych wziewnie lub treściwie.
- Oczyść okolicę brzucha znieczulonej ciężarnej szczurki 70% etanolem.
- Chwyć skórę pęsetą i odsłoń ścianę brzucha, rozcinając skórę dużymi nożyczkami f).
- Chwyć ścianę brzucha pęsetą i wykonaj dużymi nożyczkami duże podłużne nacięcia w kształcie litery U na ścianie brzucha, aż do poziomu klatki piersiowej g).
- Odsuń jelita na lewą stronę pęsetą i odsłoń jeden koniec macicy połączony z jajnikiem.
- Chwyć koniec macicy pęsetą i przetnij miejsce między macicą a jajnikiem dużymi nożyczkami.
- Wyjmij macicę z ciężarnej szczurki, odcinając tkankę tłuszczową wokół macicy aż do jej drugiego końca.
- Przenieś macicę do szalki Petriego zawierającej roztwór Tyrode'a.
- Uśmierć szczurkę poprzez nadmierną dawkę środków znieczulających lub poprzez zwichnięcie szyi po wyjęciu macicy.
4. Usuwanie zarodków z macicy
- Krótko opłucz macicę w soli Tyrode'a i przenieś ją do drugiej szalki Petriego za pomocą pęsety precyzyjnej h).
- Pod mikroskopem binokularnym chwyć ścianę macicy pęsetą precyzyjną i przetnij ją po stronie przeciwległej do mesometrium, w miejscu połączenia z naczyniami krwionośnymi, używając prostych nożyczek okulistycznych.
- Wprowadź końcówkę prostych nożyczek okulistycznych w przestrzeń między ścianą macicy a deciduą. Przetnij ścianę macicy wzdłużnie po stronie antymesometrialnej.
- Zgrupuj deciduę po stronie mesometrialnej i oddziel conceptuses z macicy, używając dwóch pęset precyzyjnych i).
- Przenieś conceptuses do trzeciej szalki Petriego za pomocą sterylizowanej szklanej pipety o odpowiedniej średnicy.
5. Disekcja zarodków szczura
- Wprowadź jeden koniec mikropincety do błony decidua i wykonaj cięcie poprzeczne w błonie decidua wokół konceptusu, używając dwóch par pęset.
- Wprowadź końce pęset do błony decidua od strony łożyska i wykonaj dwa cięcia podłużne w błonie decidua aż do góry.
- Usuń błonę decidua od strony łożyska, wyrywając ją za pomocą dwóch par pęset. Usuń pozostałą część błony decidua dwiema parami pęset.
- Chwyć błonę Reicherta, wykonaj w niej cięcie poziome i oddziel błonę od konceptusu od strony przeciwległej do łożyska.
- Za pomocą dwóch par pęset wykonaj mały otwór w pęcherzyku żółtkowym w pobliżu głowy zarodka, a następnie przetnij pęcherzyk żółtkowy za pomocą zakrzywionych nożyczek oftalmicznych. Ważne jest, aby nie uszkodzić głównych naczyń krwionośnych.
- Chwyć błonę owodni w okolicy głowy zarodka za pomocą dwóch par cienkich pęset i delikatnie wyciągnij zarodek z pęcherzyka żółtkowego, rozrywając błonę owodni h). Ciało zarodka powinno zostać wyciągnięte z pęcherzyka żółtkowego, aby zwiększyć dopływ tlenu do zarodka w etapie średnim ciąży.
6. Hodowla całego zarodka
- Należy sprawdzić, czy nie wystąpiły uszkodzenia łożyska i pęcherzyka żółtkowego oraz ocenić pracę serca i krążenie krwi.
- Przenosi się embrion do butelki hodowlanej za pomocą sterylnej szklanej pipety, pamiętając o tym, aby nie rozciągać pępowiny. Ilość przenoszonego roztworu Tyrode'a do butelek hodowlanych powinna być jak najmniejsza.
- Należy wyjąć pełny korek silikonowy z bębna rotacyjnego. Butelkę hodowlaną z korkiem z otworem należy podłączyć prostopadle do bębna rotacyjnego systemu WEC. Należy uważać, aby nie wywierać nacisku na bęben w niewłaściwych kierunkach, ponieważ bęben rotacyjny jest urządzeniem bardzo precyzyjnym. Butelki zawierające wypreparowane embriony przenosi się do hodowli jedna po drugiej; należy zminimalizować częstotliwość otwierania przednich drzwi inkubatora, aby uniknąć spadku temperatury wewnątrz urządzenia j).
- Po 10 h hodowli należy zwiększyć objętość przepływu mieszaniny gazowej do 75 cc, a po 24 h do 100 cc (Tabela 1).
- Po około 24 h należy wymienić medium hodowlane, przenosząc hodowany embrion do nowej butelki z nowo przygotowanym medium. Należy zwiększyć objętość przepływu do 125 cc po 34 h oraz do 150 cc po 48 h (Tabela 1).
- Okazjonalnie należy kontrolować stan hodowanych embrionów poprzez pomiar częstotliwości uderzeń serca (optymalnie 120-150/min) oraz obserwację krążenia krwi. W razie potrzeby należy policzyć liczbę somytów, aby ocenić wzrost embrionów w roztworze Tyrode'a. Przy prawidłowym rozwoju jeden somyt pojawia się co dwie godziny.
- Po zakończeniu procedury WEC należy zatrzymać dopływ mieszaniny gazowej i odłączyć rurkę doprowadzającą oraz filtr membranowy, aby zapobiec cofaniu się cieczy z butelki bąbelkowej do rurki doprowadzającej.
7. Uwagi
- Temperatura wewnątrz systemu WEC jest stale utrzymywana na poziomie 37,0-37,5°C.
- W naszym systemie WEC dla zarodków szczura i myszy rutynowo stosuje się 100% surowicy IC szczura, którą przed użyciem przechowuje się w temperaturze -20°C.
- Zakupujemy surowicę IC szczura, pobieraną od szczurów znieczulonych izofluranem.
- Jednorazowe butelki są dostępne również w firmie Ikemoto Rika. Butelki i korki silikonowe należy poddać autoklawowaniu.
- Disekcję zarodków należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT), ponieważ utrzymywanie zarodków w niskiej lub wysokiej temperaturze podczas dysekcji wpływa na ich późniejszy rozwój w systemie WEC.
- Narzędzia do dysekcji są sterylizowane za pomocą suchego ciepła.
- Skórę i ścianę brzucha należy rozciąć osobno, aby w maksymalnym stopniu uniknąć zanieczyszczenia naczynia włosami. Podczas rozcinania skóry oraz izolowania macicy używamy kolejno nowej pary dużych nożyczek i pęsety.
- Stosowanie pęset z cienkimi końcówkami jest bardzo ważne dla precyzyjnej dysekcji tkanek. Końcówki pęset ostrzymy ręcznie przy użyciu kamienia i oleju maszynowego.
- Używamy jednej strony pęsety jak noża, aby uniknąć wywierania nadmiernego nacisku na zarodki.
- Gdy temperatura wewnątrz systemu WEC spada w wyniku wielokrotnego otwierania drzwi, pozostawiamy włączone światło, aby utrzymać temperaturę wewnątrz systemu.
8. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia procedury sekcji zarodka szczura oraz hodowlanych zarodków szczura.
Rycina 1. Hodowla całego zarodka szczura w stadium E12.5. (A) Conceptus wypreparowany z macicy ciężarnej szczurzycy. (B) Usunięcie błony przerostowej (decidua) od strony łożyska. (C) Usunięcie błony Reicherta. (D) Otwarcie pęcherzyka żółtkowego. (E) Zarodek szczura hodowany w butelce przez 6 h od rozpoczęcia WEC. (F) Zarodek szczura hodowany przez 42 h. d, błona przerostowa (decidua); R, błona Reicherta; p, łożysko; ys, pęcherzyk żółtkowy; e, zarodek.
| | 0 h | 12 godz. | 24 godz. | 36 godz. | 48 h |
| zarodek szczura w 12,5 dniu rozwoju (E12.5) | 95% 50 cm³ | 95% 75 cm³
(10 h) | 95% 100 ml | 95% 125 ml (34 h) | 95% 150 ml |
Tabela 1. Optymalne warunki natlenienia.