Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w celu przygotowania ścięgien z ogonów szczurów do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Przedstawiono kluczowe etapy przygotowania, zaczynając od ekstrakcji, pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego, płukania, aż po umieszczenie próbek w komorze bioreaktora.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ścięgna z ogona szczura (RTTs) są powszechnie stosowanym modelem biologicznym w eksperymentalnych badaniach in vitro w dziedzinach fizjologii ścięgien i tendinopatii. Praca z tymi tkankami jest trudna ze względu na ich dużą kruchość, a do tej pory brakowało rygorystycznie szczegółowego protokołu ich izolacji.
W obliczu tych wyzwań opracowaliśmy metody i instrumenty ułatwiające manipulację RTT oraz kontrolę żywotności, sterylności i integralności tkanek. Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w przygotowaniu RTT do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Nasza praca została podzielona na cztery główne etapy: ekstrakcję, pomiar pola przekroju poprzecznego, płukanie oraz umieszczenie w komorze bioreaktora.
Na każdym etapie wszystkie procedury, materiały i manipulacje są przedstawione szczegółowo, aby umożliwić ich łatwą reprodukcję. Ponadto zaprezentowano opracowane specjalistyczne instrumenty: płytkę manipulacyjną służącą do segregacji RTT, mikrometr optyczny do pozycjonowania tkanki podczas pomiaru pola powierzchni przekroju poprzecznego oraz system kotwiczący do mocowania RTT w bioreaktorze.
Na koniec opisujemy wyniki uzyskane po wielokrotnych testach mających na celu walidację naszych metod. Oceny żywotności, sterylności i integralności wykazują, że nasze procedury są wystarczająco rygorystyczne dla manipulacji w kruchych tkankach, takich jak ścięgna ogona szczura.
Protokół
Przed przystąpieniem do jakichkolwiek manipulacji należy zidentyfikować grupę ścięgien do wykorzystania, w zależności od prowadzonego eksperymentu oraz dostępnej aparatury. Na potrzeby naszych badań wybrano ścięgna brzuszne, ponieważ są one mniejsze, a tym samym łatwiejsze do manipulacji podczas pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego i umieszczania ich w komorze bioreaktora.
Należy pamiętać, że wszystkie instrumenty są autoklawowane lub sterylizowane 70% etanolem. Ponadto obok każdego stanowiska pracy znajduje się butelka z atomizerem zawierająca 70% etanol, służąca do sterylizacji rękawiczek eksperymentatora przed każdą operacją.
Część 1: Ekstrakcja
Po resekcji ogon jest ostrożnie manipulowany za jego końce, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Ponadto, w celu zachowania żywotności komórek, wszystkie czynności wykonywane są w zimnym roztworze soli fizjologicznej.
1A) Materiały:
- Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)
- Kruszony lód
- Protektor powierzchni
- Deska do krojenia
- Indywidualne płytki manipulacyjne
- 2 szalki 50 ml
- 2 szklane naczynia o pojemności 2 L
- Taśma klejąca
- 1 Pinceta
- 1 Pinceta
- 1 Statyw na pęsety
- 1 para nożyc chirurgicznych
- 1 skalpel
- 1 para nożyczek chirurgicznych
Rysunek 1. Manipulacja indywidualna z identyfikacją orientacji („P” dla „proksymalny”)
1B) Stanowisko pracy:
- Rozłóż ochronę powierzchni i połóż na niej deskę do krojenia.
- Napełnij dwie większe szklane naczynia w połowie kruszonym lodem i ustaw je na papierze.
- Przyklej kawałek taśmy do rogu płytki manipulacyjnej i oznacz ją literą, aby wskazać koniec proksymalny.
- Napełnij w połowie dwie małe szklane naczynia oraz wszystkie rowki płytek manipulacyjnych zimnym roztworem soli fizjologicznej. Umieść je w dużych szklanych naczyniach z lodem.
- Uporządkuj wszystkie sterylne instrumenty na ochronie powierzchni.
- Przenieś ogon do jednego ze szklanych naczyń zawierających roztwór soli fizjologicznej.
1C) Manipulacje:
- Obserwuj anatomię w części proksymalnej ogona, aby odróżnić stronę brzuszna od grzbietowej. Strona brzuszna charakteryzuje się większą liczbą ścięgien oraz obecnością naczynia krwionośnego, co można potwierdzić poprzez delikatne uciśnięcie ogona w celu wywołania wydzielenia niewielkich kropel krwi.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych nacinamy skórę wzdłuż strony grzbietowej ogona, jeśli chcemy wyekstrahować ścięgna brzuszne (lub wzdłuż strony brzusznej, jeśli potrzebne są ścięgna grzbietowe).
- Otwórz nacięcie na końcu proksymalnym i usuń skórę za pomocą pęsety lub palców, ostrożnie manipulując końcami ogona.
- Opłucz krew i włosy w roztworze soli fizjologicznej, a następnie przenieś preparat do pozostałej szalki szklanej zawierającej świeży roztwór. Zmień rękawiczki.
Przekrój poprzeczny oglądany pod mikroskopem świetlnym ukazuje sześć grup ścięgien. Jedno ścięgno z każdej grupy jest przyczepione do końca guzowego każdego kręgu, dlatego cięcie wykonujemy na wysokości krążka międzykręgowego, aby odsłonić nowe ścięgna wzdłuż linii cięcia.
Rycina 2. Przekrój poprzeczny ogona szczura widziany w mikroskopii świetlnej. - Odetnij dystalny koniec poprzez chrząstkę, dwa do trzech kręgów krócej, używając nożyczek chirurgicznych. Umieść ogon na desce do cięcia, aby przeciąć tkanki miękkie za pomocą skalpela, a następnie natychmiast przenieś go z powrotem do roztworu.
- Za pomocą pęsety wyciągnąć jedno ścięgno z dystalnego końca ogona.
- Delikatnie trzymając ścięgno za oba końce, umieść je w płytce do manipulacji pojedynczych próbek.
Powtarzaj dwa ostatnie kroki do momentu, aż nie będzie można wyodrębnić więcej ścięgien, odcinając kolejny kręg, gdy zajdzie potrzeba odsłonięcia nowych tkanek.
Część 2: Pomiar pola przekroju poprzecznego7
Podczas charakteryzacji mechanicznej lub stymulacji tkanki jej właściwości mechaniczne opisuje się poprzez normalizację siły wewnątrz ścięgna do naprężenia. Z tego powodu oceniamy pole przekroju poprzecznego.
2A) Materiały:
- Mikrometr optyczny
- Stereomikroskop
- Aparat cyfrowy
- Algorytmy rozpoznawania krawędzi i rekonstrukcji profilu 5,6
- Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)
- 1 20-200μL Pipeta mikropojemnościowa
- 1 klucz imbusowy do regulacji mikrometru optycznego
- 2 pincety
Rycina 3. Mikrometr optyczny
2B) Stanowisko pracy:
- Uruchom oprogramowanie (Aparat cyfrowy i algorytmy).
- Umieść mikrometr optyczny w taki sposób, aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na zamocowanie ścięgna w aparacie.
- Przygotuj instrumenty oraz szalkę z wyizolowanymi ścięgnami w zasięgu ręki.
2C) Manipulacje:
- Napełnić komorę pomiarową zimnym roztworem soli fizjologicznej, aż oba systemy kotwiczące zostaną zanurzone.
- Przenieś ścięgno do przedziału, trzymając jego końce pęsetą.
- Za pomocą ssania pipetą mikroobjętościową wciągnij po jednym końcu do rurki silikonowej. Aspiruj do momentu, aż koniec wysunie się poza kołnierze trzpienia.
- Dokręć obejmy wałów, aby ścisnąć probówki, a następnie zamocuj aparat pod stereomikroskopem.
- Przy powiększeniu 105X rozciągaj ścięgna, obserwując tkankę, aż do momentu, gdy zmarszczki przestaną być widoczne. Rozciągnij dodatkowo o 0,40%.
Rysunek 4. Projekcja ścięgna przy powiększeniu 105x przed i po rozciąganiu. - Dostosuj położenie i ostrość, aby zachować wyraźny obraz ścięgna nad 180° rotacja
- Wykonaj zdjęcie przy każdym 10° obrót bez zmiany napięcia, ostrości lub pozycji. Do wykonania obrotu należy używać wyłącznie wału obrotowego. Ze względu na stożkowaty kształt, etapy te można powtórzyć w różnych punktach wzdłuż ścięgna.
- Uruchom algorytmy rozpoznawania krawędzi i rekonstrukcji profilu, aby przeanalizować zarejestrowaną bazę danych.
- Uwolnić ścięgno poprzez poluzowanie obejm wału i wtłoczenie powietrza do rurek silikonowych za pomocą pipety mikroobjętościowej.
- Ponownie wprowadź ścięgno na płytkę manipulacyjną, trzymając je ponownie za końce.
- Zweryfikuj kształt uzyskanej rekonstrukcji profilu oraz wartość pola przekroju poprzecznego.
Część 3: Płukanie
Aby usunąć zanieczyszczenia, które mogły powstać podczas poprzednich manipulacji, tkanki płucze się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3A) Materiały:
- Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)
- Wielorowkowa płytka manipulacyjna
- Indywidualne płytki manipulacyjne
- Taśma klejąca
- 2 pęsety
- 1 stojak na pęsety
3B) Stanowisko pracy:
- Włączyć wentylator w komorze bezpieczeństwa biologicznego z 15-minutowym wyprzedzeniem i oczyścić powierzchnie wewnętrzne 70% etanolem.
- Wprowadzić wszystkie instrumenty do wnętrza komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Nakleić kawałki taśmy w rogu każdej płytki, aby oznaczyć koniec proksymalny.
- Wypełnić wszystkie rowki sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
3C) Manipulacje:
- Wprowadzić do komory płytę manipulacyjną zawierającą wyekstrahowane ścięgno.
- Za pomocą pęsety wyjąć ścięgno z płyty, delikatnie chwytając je za oba końce.
- Zanurzyć i delikatnie wymieszać ścięgno w roztworze soli fizjologicznej w każdym przegrodzie wielorowej płyty manipulacyjnej, zaczynając od najbliższego i przechodząc do najdalejszego rowka.
- Na koniec zanurzyć ścięgno w pojedynczej płycie manipulacyjnej.
Część 4: Załadunek do komory bioreaktora
Aby uniknąć dalszej kontaminacji, następujące czynności są również przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4A) Materiały:
- Komora bioreaktora 4
- Sterylne kotwice
- 1 sterylna szalka Petriego
- Schłodzona pożywka do hodowli komórkowych (DMEM)
- Cyjanoakrylan
- 2 pęsety
- Stojak na pęsety
- 0.5-10μl Pipeta mikroobjętościowa
- 1 Linijka
Rysunek 5. Komora bioreaktora
4B) Stanowisko pracy:
- Ponieważ poprzedni krok również był wykonywany w komorze z laminarnym przepływem powietrza, usunięcie niepotrzebnych narzędzi zapewni więcej miejsca do pracy.
- Wprowadź wszystkie pozostałe instrumenty do wnętrza komory.
4C) Manipulacje:
- Umieść kotwicę na płycie manipulacyjnej tak, aby jej szpula znajdowała się centralnie nad końcem ścięgna, a następnie nawiń tkankę wokół szpuli.
- Przetoczyć kotwicę i przytrzymać wolny koniec, upewniając się, że tkanka pozostaje przymocowana do kotwicy. Przerwać po wykonaniu ¾ obrotu.
- Powtórz te same czynności z drugim końcem.
- Przesuń oba kotwice równomiernie, aż odległość między ich środkami wyniesie 6 cm.1.
- Poluźnić ścięgno, aby zanurzyć je w roztworze, i pozwolić zakotwiczonym fragmentom na krótkie wyschnięcie w celu poprawy jego właściwości mechanicznych2-3.
- Wlej cyjanoakrylan do szalki Petriego i narysuj 2.5μL do pipety mikropojemnościowej.
- Nanieś kroplę cyjanoakrylanu na zwiniętą tkankę, uważając, aby klej nie dostał się do roztworu soli fizjologicznej. Powtarzaj czynność, aż do każdego punktu zakotwiczenia zostanie naniesione 2 krople.
- Pozostawiając ścięgno całkowicie zanurzone, odczekać 5 minut do całkowitego wyschnięcia kleju.
- W tym czasie należy napełnić komorę roztworem soli fizjologicznej.
- Nawodnić wszystkie tkanki roztworem soli fizjologicznej, aby zapobiec ich uszkodzeniu.
- Manipulując wyłącznie kotwicami, przenieś ścięgno do komory bioreaktora i zamknij ją, aby zapobiec wyciekom i kontaminacji podczas przenoszenia.
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Wynik protokołu wykazuje, że przy prawidłowym wykonaniu, nasza rygorystyczna procedura izolacji i przygotowania tkanki pozwala na zachowanie sterylności, żywotności i integralności tkanki.
W pierwszej kolejności, stosując prostą i powtarzalną metodę ekstrakcji, jesteśmy w stanie wyizolować ścięgna ogonowe bez uszkadzania sieci kolagenowej, co potwierdza analiza mikroskopowa przekrojów barwionych H&E przeprowadzona po ekstrakcji.
Rysunek 6. sieć kolagenowa ścięgna po ekstrakcji (5μm przekrój podłużny barwiony H&E&E).
Następnie hodowaliśmy ścięgna przez maksymalnie dziesięć dni i przeprowadzaliśmy testy sterylności. Każdego dnia wysiewaliśmy zużyty roztwór hodowlany na agar i inkubowaliśmy go przez 24 godziny. Ponieważ nie zaobserwowano wzrostu bakterii, wyciągnęliśmy wniosek, że nasze manipulacje nie prowadzą do kontaminacji.
Dzięki zastosowaniu algorytmu rekonstrukcji profilu i mikrometru optycznego jesteśmy w stanie oszacować powierzchnię przekroju poprzecznego z marginesem błędu wynoszącym 2%7.
Rysunek 7. Rekonstrukcja profilu RTT.
Na koniec oceniliśmy żywotność komórek za pomocą zestawu LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit dla komórek ssaków po etapie płukania oraz po dwunastodniowym okresie hodowli. Ponieważ widoczna była znaczna większość żywych komórek wykazujących zieloną fluorescencję, możemy potwierdzić, że nasze procedury izolacji skutecznie zachowują żywą tkankę. Ten sam test przeprowadzono dwie godziny po przymocowaniu ścięgna w komorze bioreaktora. Zweryfikowaliśmy, że odwodnienie i klej w miejscu kotwiczenia nie rozprzestrzeniły się w tkance pomiędzy obiema kotwicami.
Rycina 8. Żywotność tkanki w miejscu zakotwiczenia (zielony = żywe komórki, czerwony = martwe komórki)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stosując powyższe procedury eksperymentalne, możemy przeprowadzić szeroki zakres badań in vitro na tego typu tkankach. Przykładowo, badanie nad degeneracją tkanki przeprowadzono poprzez poddawanie RTTs niedostymulacji przez okres dziesięciu dni. Każdego dnia ocenialiśmy właściwości mechaniczne tkanki w nieniszczących testach relaksacji naprężeń. Ostatecznie mogliśmy zaobserwować zmienność naprężeń RTT, a tym samym przeanalizować progresję właściwości mechanicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejszy artykuł został sfinansowany z grantu NSERC nr 299280, przez IRSST w ramach stypendium dla G. Parent oraz przez FRSQ w ramach nagrody za badania prowadzone przez studenta studiów licencjackich M. Cyr. Dziękujemy Yoanowi Lemieux-Laneville za przeprowadzenie manipulacji zarejestrowanych na wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| D-PBS | Odczynnik | Wisent Inc. | 311-410-CL | Roztwór soli fizjologicznej |
| Glukoza | Odczynnik | Wisent Inc. | 609-037-EL | Roztwór soli fizjologicznej 1g/L |
| Antybiotyki-antymykotyki | Odczynnik | Invitrogen | 15240-062 | Roztwór soli fizjologicznej 1% |
| DMEM | Odczynnik | Invitrogen | 12800-017 | Pożywka hodowlana |
| Wodorowęglan sodu | Odczynnik | Wisent Inc. | 600-105-CG | Pożywka hodowlana 3.7g/L |
| FBS | Odczynnik | Wisent Inc. | 090150 | Pożywka hodowlana 10% |
| Antybiotyki-antymykotyki | Odczynnik | Invitrogen | 15240-062 | Pożywka hodowlana 1% |
| Mikrometr optyczny | Narzędzie | Wykonanie własne | ||
| Płytka manipulacyjna | Narzędzie | Wykonanie własne | ||
| Komora bioreaktora | Narzędzie | Wykonanie własne |
Bibliografia
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
