Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mysiego immunogenu przysadki do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej

DOI:

10.3791/2181

⸱

17 grudnia 2010

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki mózgowej można odtworzyć u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki mózgowej jest przewlekłym zapaleniem przysadki mózgowej spowodowanym lub z towarzyszeniem autoimmunizacji1. Tradycyjnie uważano ją za chorobę rzadką, ale w ostatnich latach liczba zgłoszeń znacznie wzrosła. Zapalenie przysadki mózgowej w rzeczywistości rozwija się nierzadko jako "efekt uboczny" u pacjentów z rakiem leczonych przeciwciałami, które blokują receptory hamujące ulegające ekspresji na limfocytach T, takich jak receptoryCTLA-4 2 i PD-1. Autoimmunologiczne zapalenie przysadki mózgowej można wywołać eksperymentalnie, wstrzykując myszom białka przysadki zmieszane z adiuwantem3. W tym artykule wideo pokazujemy, jak ekstrahować białka z przysadki mózgowej myszy i jak przygotować je w formie odpowiedniej do wywołania autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej u myszy SJL.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentalny

Pierwszym krokiem w tym eksperymentalnym protokole jest zebranie dużej liczby przysadki mózgowej myszy. Drugim krokiem jest homogenizacja gruczołów w celu przygotowania ekstraktu białkowego. Trzecim krokiem jest emulgowanie tych białek za pomocą oleistej mieszanki.

Krok 1: Zbieranie i przechowywanie przysadki mózgowej myszy

Przysadka mózgowa myszy znajduje się u podstawy czaszki w zagłębieniu kości klinowej zwanym siodło tureckie, otoczone bocznie nerwami trójdzielnymi, a z przodu skrzyżowaniem wzrokowym. Gruczoł składa się z większego płata przedniego oraz mniejszych płatów tylnych i pośrednich i waży średnio 1,9 mg. Przysadka mózgowa jest pobierana od myszy o mieszanych szczepach, płciach i wieku, przeznaczonych do eutanazji przez placówkę opieki nad zwierzętami.

Aby wyizolować przysadkę mózgową, mysz jest eutanazja, skóra nad czaszką jest preparowana, a kość czaszki rozcinana nożyczkami. Mózg jest podnoszony w celu odsłonięcia przysadki mózgowej, która jest następnie izolowana od otaczającej opony twardej, pobierana z kości klinowej i przechowywana w plastikowej rurce na suchym lodzie.

Ogólnie rzecz biorąc, używamy 300 przysadki mózgowej myszy do jednego preparatu białkowego, co jest liczbą, która może być zebrana przez jedną osobę w ciągu 9 godzin.

Po zakończeniu zbierania, rurka zawierająca przysadkę mózgową jest przechowywana w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do następnego kroku.

Krok 2. Ekstrakcja białek przysadki mózgowej myszy

  1. Dodać bufor homogenizacyjny do 15-mililitrowej probówki Falcon (nr katalogowy 352059) przechowywanej w łaźni lodowej, używając 250 μl buforu na każde 100 zebranych przysadek mózgowych. Należy użyć buforu o sile jonowej podobnej do tej, która jest fizjologicznie obecna w cytoplazmie komórki (0,2 M) i o fizjologicznym pH (7,4). Używamy soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (0,161 M, pH 7,4), uzupełnionej koktajlem inhibitorów proteazy (Sigma-Aldrich, nr katalogowy P8340-1ML).
  2. Dodaj przysadkę mózgową do buforu tuż przed homogenizacją, a następnie umieść generator (o średnicy 5 mm) homogenizatora Polytron na dnie probówki Falcona. Homogenizuj przy maksymalnych obrotach przez 30 sekund, delikatnie przesuwając rurkę Falcon w górę iw dół, jednocześnie utrzymując ją w łaźni lodowej. Następnie odłóż homogenat na lodzie na 1 minutę. Powtórz etapy homogenizacji i chłodzenia jeszcze dwa razy. Ta delikatna homogenizacja powinna rozbić komórki i uwolnić białka cytozolowe bez zakłócania jąder.
  3. W celu usunięcia jąder, nieuszkodzonych tkanek i materiałów nierozpuszczalnych (takich jak tkanka łączna i zdenaturowane kompleksy białkowe), należy odwirować homogenat z niską prędkością (1000 g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś supernatant (teraz nazywany Supernatantem Postjądrowym, PNS) do nowej probówki Falcona, uważając, aby pozostawić pastylkę w nienaruszonym stanie, i przechowuj PNS na lodzie.
  5. Zawiesić osad w pierwotnej objętości buforu homogenizacyjnego (250 μl buforu na każde 100 zebranych przysadek mózgowych), homogenizować jak wyżej, odwirować jak wyżej, a następnie połączyć drugi PNS z pierwszym.
  6. Dwie połączone próbki PNS należy podzielić na porcje do probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do następnego etapu. Ten preparat białkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C, ale stopniowo traci swoją moc, dlatego zalecamy zużycie go w ciągu 6 miesięcy od przygotowania. Użyj małej podwielokrotności, aby określić wydajność i stężenie białka za pomocą testu BCA (nr katalogowy Pierce'a 23225), a jakość białka za pomocą elektroforezy żelowej. Ogólnie rzecz biorąc, otrzymujemy około 60 mg białka z 300 przysadek mysich w 1,5 ml buforu homogenizacyjnego, w stężeniu około 40 mg / ml.

Krok 3. Przygotowanie emulsji do immunizacji

  1. Szybko rozmrozić zamrożone porcje białka potrzebne do eksperymentu i dostosować stężenie białka do 20 mg / ml. Ten ekstrakt białkowy zostanie emulgowany w stosunku 1:1 za pomocą Complete Freund's Adjuwantt (CFA, Sigma F-5881) zawierającego 5 mg / ml zabitego termicznie Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Każda mysz otrzyma 1 mg ekstraktu z przysadki mózgowej w 100 μl emulsji.
  2. Podany tutaj przykład dotyczy immunizacji 10 myszy, gdzie każdej myszy zostanie wstrzyknięte 100 μl emulsji zawierającej 1 mg białek przysadki mózgowej. Pozwól dwóm dodatkowym myszom na utratę materiału podczas przygotowania, więc użyj 12 mg białek przysadki mózgowej. Aspiruj 600 μl opisanego powyżej ekstraktu białkowego przysadki o stężeniu 20 mg/ml za pomocą gazoszczelnej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 ml. Zawiesić CFA przez potrząsanie i wsypać 600 μl CFA do kolejnej strzykawki Hamilton o pojemności 2,5 ml. Przymocować i przymocować igłę do mikroemulgowania w rozmiarze 22 do strzykawki wypełnionej CFA. Powoli wcisnąć tłok strzykawki CFA tak, aby igła została wypełniona CFA, a następnie przymocować i przymocować drugi koniec igły do strzykawki wypełnionej ekstraktem z przysadki mózgowej.
  3. Powoli przesuwać tłok strzykawki CFA, aby wepchnąć składnik olejowy do wodnego ekstraktu przysadki mózgowej, tak aby wymieszać tylko niewielką ilość. Następnie wepchnij tłok strzykawki z ekstraktem przysadki mózgowej do strzykawki CFA. Czynność tę powtarzać stopniowo, zwiększając ilość mieszanego materiału. Kontynuować, aż cała zawartość obu strzykawek zostanie wymieszana. Otrzymasz białawy i równomiernie rozprowadzony roztwór, który reprezentuje emulsję typu woda w oleju.
  4. Po uformowaniu emulsji powtórz ruch w przód iw tył co najmniej 500 razy, aby upewnić się, że emulsja jest dokładnie wymieszana. Po ostatnim cyklu mieszania emulsja 1:1 typu woda w oleju jest gotowa do użycia i zawiera stężenie białka przysadki mózgowej 10 mg/ml. Emulsja zostanie wstrzyknięta tego samego dnia podskórnie znieczulonym myszom SJL, jak opisano w towarzyszącym artykule JoVE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo faktu, że pierwszy pacjent z autoimmunologicznym zapaleniem przysadki mózgowej został zgłoszony w 1962 r.4 , patogenne autoantygeny przysadki pozostają do zidentyfikowania5. Modele zwierzęce mogą być bardzo przydatne do identyfikacji tych autoantygenów, pomagając w odkrywaniu biomarkerów, które można przełożyć na opiekę nad pacjentem. W artykule tym przedstawiono prostą procedurę przygotowania białek przysadki mózgowej w formie, która jest odpowiednia do wywołania autoimmunologicznego zapal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez DK080351 grantu NIH na PC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15-ml probówki Falcon bufor
homogenizacyjny buforowany
fosforanem sól fizjologiczna
inhibitor
Homogenizator
Test BCAPierce, Thermo Scientific23225
Kompletny Freund& rsquo; s Adiuwant (CFA)Sigma-AldrichF-5881
Mycobacterium tuberculosisBD Biosciences231141
2,5 ml gazoszczelna strzykawka
igła mikroemulgująca o rozmiarze
proteazy koktajl PolytronHamilton 22 mm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
  2. Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
  3. Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
  4. Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
  5. Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przysadka myszyekstrakcja bia ekwirowanie z nisk pr dko citest BCAelektroforeza w elu poliakrylamidowymprzygotowanie emulsjikompletny adiuwant Freundamyszy SJLhomogenizat bia kowy przysadki

Powiązane artykuły