Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki mysiej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Autoimmunologiczne zapalenie przysadki jest przewlekłym stanem zapalnym przysadki mózgowej wywołanym lub towarzyszącym autoimmunizacji1. Tradycyjnie uważano je za rzadką chorobę, jednak w ostatnich latach liczba zgłoszeń znacząco wzrosła. Zapalenie przysadki rozwija się w rzeczywistości dość często jako „skutek uboczny” u pacjentów onkologicznych leczonych przeciwciałami blokującymi receptory hamujące ekspresjonowane na limfocytach T, takimi jak CTLA-42 i receptory PD-1. Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać eksperymentalnie poprzez wstrzykiwanie myszom białek przysadki zmieszanych z adiuwantem3. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy sposób ekstrakcji białek z przysadek mózgowych myszy oraz sposób ich przygotowania w formie odpowiedniej do wywoływania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL.
Protokół
Protokół eksperymentalny
Pierwszym krokiem w tym protokole eksperymentalnym jest pobranie dużej liczby przysadki mózgowe myszy. Drugim krokiem jest homogenizacja gruczołów w celu przygotowania ekstraktu białkowego. Trzecim krokiem jest emulgacja tych białek z mieszaniną olejową.
Krok 1: Pobieranie i przechowywanie przysadki mózgowej myszy
Przysadka mózgowa myszy znajduje się u podstawy czaszki, w zagłębieniu kości klinowej zwanym siodłem tureckim, otoczona bocznie przez nerwy trójdzielne, a z przodu przez skrzyżowanie wzrokowe. Gruczoł składa się z większego płata przedniego oraz mniejszych płatów tylnego i pośredniego i waży średnio 1.9 mg. Przysadki mózgowe pobierane są od myszy różnych szczepów, płci i w różnym wieku, przeznaczonych do eutanazji w placówce opieki nad zwierzętami.
Aby wyizolować przysadkę mózgową, mysz poddawana jest eutanazji, nacięta zostaje skóra nad czaszką, a kości czaszki są przecinane nożyczkami. Mózg jest unoszony w celu odsłonięcia przysadki, która następnie zostaje oddzielona od otaczającej ją opony twardej, wyjęta z kości klinowej i umieszczona w plastikowej probówce na suchym lodzie.
Zazwyczaj do przygotowania jednej porcji białka wykorzystujemy 300 przysadek mysich, co jest liczbą, którą jedna osoba może zebrać w ciągu 9 godzin.
Po zakończeniu pobierania probówka zawierająca przysadki jest przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu przejścia do następnego etapu.
Krok 2. Ekstrakcja białek z przysadki mysiej
- Do probówki Falcon 15 ml (nr katalogowy 352059) umieszczonej w kąpieli lodowej dodać bufor do homogenizacji, stosując 250 μL buforu na każde 100 zebranych przysadki mózgowe. Należy użyć buforu o sile jonowej zbliżonej do tej, która występuje fizjologicznie w cytoplazmie komórki (0.2 M) i o fizjologicznym pH (7.4). Stosujemy roztwór fosforanowo-solny (0.161 M, pH 7.4), uzupełniony koktajlem inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich, nr katalogowy P8340-1ML).
- Tuż przed homogenizacją dodać przysadki mózgowe do buforu, a następnie umieścić generator (o średnicy 5 mm) homogenizatora Polytron na dnie probówki Falcon. Homogenizować przy maksymalnej liczbie obrotów przez 30 sekund, delikatnie poruszając probówką Falcon w górę i w dół, utrzymując ją w kąpieli lodowej. Następnie pozostawić homogenizat na lodzie przez 1 min. Powtórzyć etapy homogenizacji i chłodzenia jeszcze dwa razy. Ta delikatna homogenizacja powinna doprowadzić do rozbicia komórek i uwolnienia białek cytozolowych bez uszkodzenia jąder komórkowych.
- Aby usunąć jądra, nierozbite tkanki i materiały nierozpuszczalne (takie jak tkanka łączna i zdenaturowane kompleksy białkowe), homogenizat wirować z niską prędkością (1000g) przez 10 min w temperaturze 4 °C.
- Przenieść nadsącz (zwany teraz nadsącz ponuklearnym, PNS) do nowej probówki Falcon, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przechowywać PNS na lodzie.
- Resuspender osad w pierwotnej objętości buforu do homogenizacji (250 μL buforu na każde 100 zebranych przysadki mózgowe), homogenizować i wirować w sposób opisany powyżej, a następnie połączyć drugi PNS z pierwszym.
- Rozdzielić dwie połączone próbki PNS do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania kolejnego kroku. Taki preparat białkowy można przechowywać w -80 °C, jednak stopniowo traci on swoją aktywność, dlatego zaleca się jego wykorzystanie w ciągu 6 miesięcy od przygotowania. Małą alikwot wykorzystać do oznaczenia wydajności i stężenia białka za pomocą testu BCA (Pierce nr katalogowy 23225) oraz jakości białka za pomocą elektroforezy żelowej. Zazwyczaj z 300 mysich przysadek w 1.5 mL buforu do homogenizacji otrzymuje się około 60 mg białka, przy stężeniu około 40 mg/ mL.
Krok 3. Przygotowanie emulsji do immunizacji
- Szybko rozmrozić mrożone alikwoty białka potrzebne do eksperymentu i dostosować stężenie białka do 20 mg/ mL. Ten ekstrakt białkowy zostanie zemulgowany w stosunku 1:1 z pełnym adiuwantem Freunda (CFA, Sigma F-5881) zawierającym 5 mg/ mL zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Każda mysz otrzyma 1 mg ekstraktu z przysadki w 100 μL emulsji.
- Przedstawiony tutaj przykład dotyczy immunizacji 10 myszy, z których każda otrzyma wstrzyknięcie 100 μL emulsji zawierającej 1 mg białek przysadki. Należy uwzględnić dwie dodatkowe myszy ze względu na straty materiału podczas przygotowania, zatem należy użyć 12 mg białek przysadki. Za pomocą szczelnej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 mL pobrać 600 μL opisanego powyżej ekstraktu białek przysadki o stężeniu 20 mg/ mL. Resuspendować CFA poprzez wstrząsanie i pobrać 600 μL CFA do drugiej strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 mL. Do strzykawki wypełnionej CFA przymocować i zabezpieczyć igłę mikroemulgacyjną o rozmiarze 22G. Powoli nacisnąć tłok strzykawki z CFA tak, aby igła wypełniła się CFA, a następnie przymocować i zabezpieczyć drugi koniec igły do strzykawki wypełnionej ekstraktem z przysadki.
- Powoli przesuwać tłok strzykawki z CFA, aby wtłoczyć komponent olejowy do wodnego ekstraktu z przysadki, tak aby zmieszała się tylko niewielka ilość materiału. Następnie cofnąć tłok strzykawki z ekstraktem z przysadki w stronę strzykawki z CFA. Powtarzać tę czynność, stopniowo zwiększając ilość mieszanego materiału. Kontynuować do momentu zmieszania całej zawartości obu strzykawek. Otrzymany zostanie białawy i jednorodny roztwór stanowiący emulsję woda w oleju.
- Po utworzeniu emulsji powtórzyć ruchy posuwisto-zwrotne co najmniej 500 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie emulsji. Po ostatnim cyklu mieszania emulsja woda w oleju w stosunku 1:1 jest gotowa do użycia i zawiera białka przysadki w stężeniu 10 mg/mL. Emulsję należy wstrzyknąć tego samego dnia podskórnie znieczulonym myszom SJL, zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym artykule JoVE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo że pierwszy przypadek pacjenta z autoimmunologicznym zapaleniem przysadki opisano w 1962 roku4, patogenne autoantygeny przysadki wciąż nie zostały zidentyfikowane5. Modele zwierzęce mogą być bardzo użyteczne w identyfikacji tych autoantygenów, pomagając w odkryciu biomarkerów, które można przełożyć na opiekę nad pacjentem. Niniejszy artykuł zaprezentował prostą procedurę przygotowania białek przysadki w formie odpowiedniej do indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u zwierząt doś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NIH DK080351 przyznany PC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówki Falcon 15 ml | |||
| bufor do homogenizacji | |||
| bufor fosforanowo-solny | |||
| koktajl inhibitorów proteaz | |||
| homogenizator Polytron | |||
| metoda BCA | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| pełne adjuwant Freunda’adiuwant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| strzykawka Hamilton gastight o pojemności 2,5 ml | |||
| igła mikroemulgująca G22 |
Bibliografia
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
