W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można odtworzyć eksperymentalnie poprzez wstrzyknięcie białek przysadki wymieszanych z adiuwantem podatnym myszom1. Modele mysie pozwalają nam badać przebieg chorób, często stanowiąc dobrą replikę procesów zachodzących u ludzi. W przypadku niektórych chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca typu 1A, istnieją modele (myszy NOD), u których samoistnie rozwija się choroba podobna do ludzkiego odpowiednika. Jednak w przypadku wielu innych chorób autoimmunologicznych model musi zostać wywołany eksperymentalnie. Powszechnym podejściem w tym zakresie jest wstrzyknięcie myszy dominującego antygenu pochodzącego z badanego organu. Na przykład badacze zainteresowani autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy wstrzykują myszom tyreoglobulinę2, a osoby zainteresowane miastenią gravis wstrzykują receptor acetylocholiny3. Jeśli autoantygen dla konkretnej choroby autoimmunologicznej nie jest znany, badacze wstrzykują surowy ekstrakt białkowy z organu będącego celem reakcji autoimmunologicznej. W przypadku autoimmunologicznego zapalenia przysadki patogenne autoantygeny nie zostały jeszcze zidentyfikowane4, dlatego stosuje się surowy preparat białek przysadki. W tym artykule wideo demonstrujemy, jak wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie przysadki u myszy SJL.
Protokół
Protokół eksperymentalny
Po przygotowaniu immunogenu przysadkowego (patrz artykuł towarzyszący), wstrzykuje się go podskórnie myszom SJL (The Jackson Laboratories, stock 000686). Drugie, identyczne wstrzyknięcie powtarza się po 7 dniach. Następnie myszy są wykorzystywane do zbierania wyników in vivo oraz pośmiertnych.
Krok 1. Podskórne wstrzykiwanie immunogenu przysadkowego myszom linii SJL
Myszy są najpierw znieczulane poprzez dostrytonalne wstrzyknięcie 0,5 ml 2,2,2-tribromoetanolu (Avertin, TCI America, T-1420) w stężeniu 20 mg/ml. Następnie myszom wstrzykuje się podskórnie 100 μl emulsji przysadkowej, która – zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule JoVE 2181 – zawiera 1 mg ekstraktu z przysadki oraz 0,25 mg pełnego adiuwanta Freunda. Emulsję wstrzykuje się w okolicy grzbietowej lewej tylnej kończyny (50 μL) oraz w prawym pachwinie (50 μL). Emulsję przysadkową wstrzykuje się ponownie w 7. dniu w przeciwległe miejsca (50 μl w okolicy grzbietowej prawej tylnej kończyny i 50 μl w lewym pachwinie). Stan myszy jest monitorowany codziennie przez pierwsze 3 dni, a następnie co tydzień aż do dnia uboju, który przypada zazwyczaj 28 dni po pierwszej immunizacji.
Krok 2. Zbieranie wyników in vivo: analizy krwi
Tkanką najczęściej wykorzystywaną do oceny wyników eksperymentalnych podczas gdy myszy są jeszcze żywe jest krew. Krew pobiera się rutynowo 14 dni po pierwszej immunizacji, aby zmierzyć poziomy przeciwciał przeciwko przysadce w surowicy lub inne markery, takie jak cytokiny i chemokiny.
Krew z żywych myszy pobiera się w następujący sposób. Myszy unieruchamia się, chwytając za kark, a następnie lokalizuje tylną część żuchwy. Po zlokalizowaniu tylnej części żuchwy, za pomocą lancetów 4 mm nakłuwa się podżuchwowy pęczek naczyniowy. Po pobraniu krwi należy ucisnąć to miejsce gazikiem nasączonym alkoholem, aby zapobiec powstaniu krwiaka. Pobraną krew wiruje się przy 2,000g przez 20 minut i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu użycia.
Krok 3. Zbieranie wyników pośmiertnych: Histopatologia przysadki
Myszy są zazwyczaj uśmiercane 28 dni po pierwszej immunizacji. Kluczową cechą niezbędną do postawienia diagnozy EAH jest naciek komórek jednojądrzastych układu krwiotwórczego do przysadki mózgowej.
Myszy są uśmiercane poprzez umieszczenie ich w szczelnej plastikowej komorze, do której doprowadzany jest CO2. Myszy pozostają w komorze przez łącznie 8 minut. Po uśmierceniu przysadka mózgowa jest pobierana zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule. Chorobowo zmieniona przysadka wydaje się obrzęknięta i silniej przylega do otaczającej ją opony twardej. Do poluzowania opon otaczających przysadkę używa się ostrych pęsety. Gdy przysadka przesuwa się swobodnie po kości klinowej, jeden jej koniec chwyta się pęsetą i ostrożnie unosi. Następnie gruczoł umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi zawierającej utrwalacz Becksteada5. Przysadka jest utrwalana przez noc, owijana w papier soczewkowy i umieszczana w kasecie. Następnie gruczoły są przetwarzane zgodnie z następującym protokołem:
| Numer stanowiska | Odczynnik | Czas w minutach | Temperatura (stopnie Celsjusza) |
| 1 | 70% alkohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% alkohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% alkohol | 15 | 25 |
| 4 | alkohol 95% | 15 | 25 |
| 5 | 100% alkohol | 15 | 25 |
| 6 | alkohol 100% | 7.5 | 25 |
| 7 | alkohol 100% | 7.5 | 25 |
| 8 | ksylen | 20 | 25 |
| 9 | ksylen | 20 | 25 |
| 10 | ksylen | 20 | 25 |
| 11 | parafina | 30 | 58 |
| 12 | parafina | 5 | 58 |
| 13 | parafina | 5 | 58 |
Po obróbce przysadki są zatapiane w parafinie, a z każdej z nich wykonuje się co najmniej 5 nieprzylegających do siebie skrawków (o grubości 5-μm). Po pocięciu skrawki barwi się hematoksyliną i eozyną, a następnie analizuje w celu ilościowego określenia nacieku jedynojądrowego. Do oceny wybierany jest skrawek z najsilniejszym naciekiem. Stopień nasilenia ocenia się na podstawie subiektywnego szacunku zakresu zastąpienia lub zniszczenia przedniego płata przysadki przez komórki odpornościowe: stopień 0 – brak zmian chorobowych; stopień 1 – zajęcie 2%-20%; stopień 2 – 20%-30%; stopień 3 – 30%-50%; stopień 4 – 50%-90%; stopień 5 – powyżej 90%. Wszystkie skrawki są oceniane przez dwie osoby, które nie znają pochodzenia analizowanych materiałów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano cztery techniki indukcji zapalenia przysadki u zwierząt doświadczalnych. Technika przedstawiona w niniejszym artykule, polegająca na wstrzykiwaniu białek przysadki zmieszanych z adjuwantem Freunda, jest najstarszą z nich, datowaną na 1967 rok6, i została ulepszona w ostatnim czasie1. Inne techniki to wstrzykiwanie rozpuszczalnych glikoprotein wirusa różyczki w 1992 roku7, stereotaktyczne wstrzyknięcie adenowirusa bezpośrednio do przysadki w 2002 roku8 oraz transplantacj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH DK080351 przyznanego PC oraz z hojnej darowizny rodziny Terry’ego i Kristine Gore.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| myszy SJL (The Jackson Laboratories) | zapas 000686 | ||
| 2,2,2-tribromo–trietanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’utrwalacz s |
Bibliografia
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
