Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Podsumowanie

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Streszczenie

Niniejszy model eksperymentalny został opracowany w celu oceny pialnego mikrokrążenia u myszy podczas ostrych i przewlekłych, fizjologicznych i patofizjologicznych stanów hemodynamicznych, zapalnych i metabolicznych, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej in vivo. Nad lewą korą ciemieniowo-potyliczną myszy umieszcza się zamknięte okno czaszkowe. Lokalny mikrokrążenie jest rejestrowane w czasie rzeczywistym przez okno przy użyciu oświetlenia epi i fluorescencyjnego, a następnie wykonuje się pomiary średnic naczyń oraz prędkości erytrocytów (RBC). Prędkość RBC jest mierzona za pomocą korelacji wzajemnej w czasie rzeczywistym i/lub z użyciem erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie. Adhezję leukocytów i płytek krwi do naczyń pialnych oraz ocenę perfuzji i przecieku naczyniowego przeprowadza się przy pomocy markerów znakowanych fluorescencyjnie, takich jak Albumin-FITC i przeciwciała anty-CD45-TxR. Mikrokrążenie może być wielokrotnie rejestrowane w formie wideo przez kilka dni. Po raz pierwszy zastosowaliśmy intravitalną mikroskopię mózgu z zamkniętym oknem do badania mikrokrążenia pialnego w celu śledzenia dynamicznych zmian w przebiegu zakażenia myszy szczepem Plasmodium berghei ANKA, wykazując, że ekspresja CM wiąże się z dysfunkcjami mikrokrążenia charakteryzującymi się skurczem naczyń, głębokim spadkiem przepływu krwi, a ostatecznie zapadnięciem się naczyń.

Protokół

1. Kraniotomia

Kraniektomię u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni należy przeprowadzić wcześniej zgodnie z opisem¹, z wyjątkiem tego, że w głowie zwierzęcia nie umieszcza się tytanowego pręta. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilną preparacją umożliwiającą badanie mikrokrążenia opon miękkich nawet kilka miesięcy po implantacji. Zazwyczaj badania przeprowadzamy 2-3 tygodnie po implantacji okna czaszkowego.

2. Mikroskopia intravitalna

1. Dwa lub trzy tygodnie po kraniotomii sprawdza się temperaturę ciała, a następnie mysz poddaje się lekkiej anestezji izofluranem (4% do indukcji, 1-2% do podtrzymania). Lekką anestezję stosuje się, aby zapobiec stresowi i dyskomfortowi zwierzęcia podczas procedury eksperymentalnej.
2. Zwierzęta są następnie umieszczane w pozycji brzusznej w ramie stereotaktycznej, a głowę starannie mocuje się za pomocą prętów usznych. Poziom reguluje się za pomocą dźwigni prawej i lewej. Temperaturę głęboką ciała utrzymuje się za pomocą maty grzewczej. Ponieważ u myszy z malarią mózgową rozwija się hipotermia, ustawienia temperatury muszą być dostosowane do każdego zwierzęcia.
3. Kryształy okładkowe w oknie czaszkowym są delikatnie czyszczone patyczkiem nasączonym olejem mineralnym, a następnie za pomocą stereomikroskopu i kamery cyfrowej (Nikon Coolpix 995, Japonia) wykonuje się panoramiczne zdjęcie naczyń pod oknem. Zdjęcie jest drukowane, opisane i datowane; służy ono jako mapa do pomiarów średnicy naczyń i prędkości erytrocytów (RBC).
4. Mysz jest następnie przenoszona na stoлик mikroskopu intravitalnego (zmodyfikowany Leica-McBain, San Diego, CA). Wykorzystując zagłębienie utworzone przez akryl dentystyczny, na okno czaszkowe nakłada się kroplę wody i reguluje ostrość. Pomiary wykonuje się przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 20X (LUMPFL-WIR, apertura numeryczna 0,6, Olympus). Śledzi się te same naczynia, aby umożliwić bezpośrednie porównania z ich poziomami bazowymi, co pozwala na uzyskanie bardziej wiarygodnych statystyk dla małych populacji próbek. Obrazy są rejestrowane za pomocą cyfrowej, szybkiej kamery do niskiego oświetlenia (Hamamatsu C9300-221, Japonia) lub analogowej kamery do niskiego oświetlenia (COHU 4815, San Diego, CA) podłączonej do magnetowidu (JVC, Japonia), urządzenia do znakowania czasu (MicroImage Video Systems, Boyertown, PA) i monitora kolorowego (PELCO, Clovis, CA). Taśma jest odpowiednio opisana przed rozpoczęciem nagrywania, a znacznik czasu pozwala na identyfikację zdarzeń poprzez dokumentację ram czasowych, w których zostały one zarejestrowane.
5. W pierwszej kolejności sprawdzane są naczynia w celu oceny jakości preparatu oraz weryfikacji, czy krew przepływa we wszystkich naczyniach. Następnie wybiera się naczynia do pomiaru, które powinny obejmować venule i arteriole o różnych średnicach (w naszych preparatach pialnych myszy większość naczyń ma średnicę od 20 do 80 µm) i obejmować różne obszary w strefie odsłoniętej przez okno. Arteriole i venule można łatwo rozróżnić, sprawdzając kierunek przepływu krwi w rozgałęzieniach naczynia (czy rozdziela, czy zbiera krew). W naszych badaniach pomiary wykonuje się w 12 naczyniach. Dokładna lokalizacja każdego miejsca do pomiaru jest zaznaczona na zdjęciu naczyń pialnych.
6. Dla każdego punktu średnicę naczynia mierzy się za pomocą urządzenia do przesunięcia obrazu (Image Shear, Vista Electronics, San Diego, CA)². Po wybraniu punktu obraz naczynia jest ustawiany w pozycji pionowej, a następnie przesuwany, aż przeciwległe krawędzie zostaną wyrównane, po czym odczyt jest dokumentowany. Wartość tę można przeliczyć na mikrometry dzięki wcześniejszej kalibracji dla każdego konkretnego powiększenia przy użyciu mikrometru kalibracyjnego siatki (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ).
7. Każdy punkt jest rejestrowany przez co najmniej 30 sekund w celu śledzenia erytrocytów. Do śledzenia pobiera się próbkę krwi, erytrocyty znakuje się fluorescencyjnie barwnikiem karbocyjaninowym Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) i wprowadza przez żyłę ogonową, aby uzyskać stężenie in vivo wynoszące ok. 0,4-0,5%³. U zwierząt zainfekowanych szczepem Plasmodium berghei ANKA (PbA) wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (PbA-GFP, dar z Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MR4, Manassas, VA; przekazany przez CJ Janse i AP Waters), infuzja znakowanych komórek nie jest konieczna. Obrazy wideo są rejestrowane w częstotliwości 150 klatek na sekundę. Szybkość ta została dobrana tak, aby uzyskać od jednej do sześciu obrazów komórki na jednej klatce wideo dla wyznaczenia prędkości do 8 mm/s. Obrazy wideo są digitalizowane za pomocą komputera osobistego przy użyciu oprogramowania Adobe Premier 4.0, a dane współrzędnych x-y dla każdego obrazu komórki są uzyskiwane za pomocą oprogramowania SigmaScan Pro 4.0 (SPSS Chicago, IL)⁴. Pozycje komórek są wyznaczane ręcznie, a nie poprzez analizę obrazu, ponieważ wykazano, że oko przeszkolonego obserwatora zapewnia dobrą estymację położenia środka komórki, co zazwyczaj odpowiada miejscu maksymalnej fluorescencji obserwowanej dla większości orientacji komórek. Dla każdej komórki wykonuje się wielokrotne oznaczenia pozycji i prędkości, a następnie wyciąga się średnią, aby uzyskać średnią prędkość RBC.
8. Gdy pomiary prędkości RBC są wykonywane offline, całkowity czas obserwacji dla każdej myszy nie przekracza 10-15 minut, co minimalizuje kardiodepresyjne efekty anestezji.
9. Po uzyskaniu pomiarów średnicy naczyń i prędkości RBC można obliczyć przepływ krwi w każdym naczyniu, korzystając ze wzoru: Q = V x π(D/2)², gdzie Q = przepływ krwi, V = prędkość RBC a D = średnica naczynia.
10. Procedury te można powtarzać w czasie. Na przykład w mysim modelu malarii mózgowej wykonujemy codzienne pomiary zaczynając od 4. dnia infekcji. Wartości uzyskiwane każdego dnia dla każdej myszy są normalizowane w stosunku do dnia 0 (przed infekcją), który przyjmuje się za 100%.
11. Oprócz pomiarów średnicy naczyń i przepływu krwi można przeprowadzić dodatkowe oceny, np. ulepszoną ocenę perfuzji oraz analizę toczenia i adhezji leukocytów i/lub płytek krwi w naczyniach pialnych. Pomiary te wykonuje się przy użyciu markerów znakowanych fluorescencyjnie. W przypadku malarii możemy również wykryć krążące lub przylegające pasożyty, stosując szczep PbA wykazujący ekspresję GFP.
12. Do oceny perfuzji stosujemy roztwór albuminy znakowanej FITC (Sigma, St Louis, MO, 50 µg/mysz), a do ilościowego oznaczenia adhezji leukocytów do naczyń pialnych stosujemy przeciwciała przeciwko pan-leukocytowemu markerowi CD45 znakowane Texas Red (TxR) (Invitrogen, Carlsbad, CA, 4 µg/mysz). W tym celu 25 µL albuminy-FITC (2 mg/mL) i 20 µL przeciwciał anti-CD45-PE (200 µg/mL) miesza się i wstrzykuje do uprzednio ogrzanej żyły ogonowej. Obrazowanie myszy może nastąpić natychmiast, jednak jeśli planowane są pomiary przecieku, pozwala się albuminie-FITC krążyć przez 15 minut. Zieloną fluorescencję (518 nm) emitowaną przez albuminę-FITC i GFP (PbA-GFP pRBC) rejestruje się za pomocą ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), a fluorescencję anti-CD45-TxR (615 nm) wzbudza się i rejestruje za pomocą Vivid Standard: XF42.
13. Albuminy znakowane fluorescencyjnie pozwalają na lepszą wizualizację sieci naczyniowej, w tym naczyń penetrujących, i są szczególnie przydatne w stanach chorobowych, takich jak malaria mózgowa, do sprawdzania naczyń nieperfundowanych lub niedoperfundowanych. Mogą być również użyte do pomiaru przecieku naczyniowego⁵.
14. Przeciwciała anti-CD45 znakowane fluorescencyjnie ułatwiają identyfikację i ilościowe określenie toczenia i adhezji leukocytów do naczyń pialnych. Aby uniknąć błędów w ilościowym określaniu, analizujemy toczenie i adhezję w tych samych punktach, które wcześniej zdefiniowano do pomiaru przepływu krwi. Ilościowe określenie adhezji leukocytów odbywa się poprzez zliczanie liczby leukocytów na 100 µm długości naczynia. Toczenie określa się poprzez zliczanie liczby leukocytów poruszających się z prędkością znacznie mniejszą niż prędkość krwi na tej samej długości 100 µm, w czasie 30 sekund.

3. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. (Krok 2.6) Zdjęcia sieci naczyniowej oponopławnej myszy dostępnej przez okno czaszkowe.

Rysunek 2. (Kroki 3.1-3.5) Schematyczne przedstawienie układu do mikroskopii wewnątrzorganizmowej mikrokrążenia opon miękkich myszy. 1: mikroskop wewnątrzorganizmowy; 2: obiektyw imersyjny wodny 20X; 3: źródło światła; 4a: cyfrowa szybka kamera do pomiarów w niskim świetle; 4b: kamera analogowa; 5: mysz w ramie stereotaktycznej; 6: monitor komputera; 7: analogowy monitor przesunięcia obrazu pokazujący, w jaki sposób wykonuje się przesunięcie (strzałka) w celu pomiaru średnicy naczynia.

Rycina 3. (Krok 3.6-3.8) Pomiary prędkości erytrocytów w naczyniach mikrokąskowych poprzez śledzenie komórek na podstawie szybkich nagrań wideo w fluorescencji. Zdjęcia od A do F stanowią sekwencję obrazów jednego naczynia oplątawego, ukazującą pojedynczy poruszający się erytrocyt przecinający pole mikroskopowe ograniczone przez kamerę. Ręczne wyznaczanie pozycji klatka po klatce dla 15 lub więcej komórek przecinających pole, przy zastosowaniu uprzednio skalibrowanego dystansu, umożliwia obliczenie średniej prędkości erytrocytów w każdym naczyniu za pomocą arkusza kalkulacyjnego Excel.

Rysunek 4. (Krok 3.9) Dane z reprezentatywnego eksperymentu pokazujące zmiany w przepływie krwi oponopławnej w czasie u myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA (PbA) (n = 5) oraz u niezakażonych myszy kontrolnych (n = 5). Podczas gdy u myszy kontrolnych przepływ krwi oponopławnej pozostaje stosunkowo stabilny w czasie, u myszy zakażonych PbA widoczny jest wyraźny spadek przepływu krwi w momencie rozwoju malarii mózgowej (dzień 6). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.

Rycina 5. (Krok 4.3) Duża liczba leukocytów przylegających do naczyń oponowych myszy zainfekowanej Plasmodium berghei ANKA, uwidoczniona poprzez barwienie fluorescencyjnymi przeciwciałami anty-CD45-Texas Red.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda mikroskopii intravitalnej stanowi wyjątkowe i potężne narzędzie do szczegółowej obserwacji mikrokrążenia opon miękkich u myszy. Pozwala ona na wyodrębnienie poszczególnych tętniczek i żyłek oraz pomiar zmian szeregu parametrów, takich jak średnice naczyń, prędkości RBC, przepływ krwi, przyleganie i toczenie się leukocytów, płytek krwi i innych elementów krwi, przeciekanie naczyniowe, pH tkanki i pO2, a potencjalnie wiele innych zastosowań. Odpowiedź naczyniową in vivo można bezzwłocznie ocen...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izofluran	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Barwnik karbocyjaninowy Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Przeciwciało Anti-CD45-TxR	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865