Mikroskopia przyżyciowa mikrokrążenia mózgu myszy przy użyciu zamkniętego okienka czaszkowego

Summary

Mikroskopia przyżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu mięśniowym.

Abstract

Ten eksperymentalny model został zaprojektowany do oceny mikrokrążenia myszy podczas ostrych i przewlekłych, fizjologicznych i patofizjologicznych stanów hemodynamicznych, zapalnych i metabolicznych, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej in vivo. Zamknięte okno czaszki umieszcza się nad lewą korą ciemieniowo-potyliczną myszy. Miejscowe mikrokrążenie jest rejestrowane w czasie rzeczywistym przez okno za pomocą epi i oświetlenia fluorescencyjnego, a także wykonywane są pomiary średnic naczyń i prędkości czerwonych krwinek (RBC). Prędkość RBC jest mierzona za pomocą korelacji krzyżowej w czasie rzeczywistym i/lub erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie. Przyleganie leukocytów i płytek krwi do naczyń krwionośnych oraz ocena perfuzji i nieszczelności naczyniowej odbywa się za pomocą markerów znakowanych fluorescencyjnie, takich jak albumina-FITC i przeciwciała anty-CD45-TxR. Mikrokrążenie może być wielokrotnie nagrywane na wideo przez kilka dni. Po raz pierwszy użyliśmy mikroskopii przyżyciowej mózgu z zamkniętym oknem do zbadania mikrokrążenia pial, aby śledzić dynamiczne zmiany w przebiegu infekcji Plasmodium berghei ANKA u myszy i wykazać, że ekspresja CM jest związana z dysfunkcjami mikrokrążenia charakteryzującymi się zwężeniem naczyń krwionośnych, głębokim spadkiem przepływu krwi i ostatecznie zapaścią naczyniową.

Protocol

1. Kraniotomia

Kraniotomia u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni musi być wykonana wcześniej, jak opisano^{wcześniej 1}, z wyjątkiem tego, że tytanowy pręt nie jest umieszczany w głowie zwierzęcia. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilnym preparatem pozwalającym na badanie mikrokrążenia lipidowego nawet po kilku miesiącach od implantacji. Zazwyczaj nasze badania wykonujemy 2-3 tygodnie po implantacji okna czaszkowego.

2. Mikroskopia przyżyciowa

1. Dwie-trzy tygodnie po kraniotomii mierzy się temperaturę ciała, a następnie mysz jest lekko znieczulana izofluranem (4% w przypadku indukcji, 1-2% w pr....

Discussion

Opisana tutaj metoda mikroskopii przyżyciowej stanowi unikalne i potężne narzędzie do szczegółowej obserwacji mikrokrążenia tętniczego u myszy. Pozwala na wyodrębnienie poszczególnych tętniczek i żyłek oraz pomiar zmian szeregu parametrów, takich jak średnice naczyń, prędkości RBC, przepływ krwi, przyleganie i zwijanie leukocytów, płytek krwi i innych elementów krwi, nieszczelność naczyniowa, pH tkanek i pO2 oraz potencjalnie wiele innych zastosowań. Odpowiedź naczyniową in vivo można szybko ocenić po interwencj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.
Sondy molekularne	barwnika karbocyjaninowego	D306
Albumina-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865