Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Podsumowanie

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Streszczenie

Aparaty szparkowe są naturalnymi otworami w epidermie rośliny, odpowiedzialnymi za wymianę gazową pomiędzy wnętrzem rośliny a środowiskiem. Tworzą je dwie komórki szparkowe, które potrafią zamknąć otwór szparkowy w odpowiedzi na szereg czynników zewnętrznych, w tym natężenie światła, stężenie dwutlenku węgla oraz wilgotność względną (RH). Otwór szparkowy jest również główną drogą wnikania patogenów do liści, co stanowi kluczowy etap rozwoju choroby. Niedawne badania wykazały, że zamknięcie otworu jest skuteczne w minimalizowaniu rozwoju chorób bakteryjnych u roślin Arabidopsis; jest to integralna część wrodzonej odporności roślin. Wcześniej wykorzystywaliśmy preparaty z naskórka do oceny reakcji szparek na żywe bakterie (Melotto et al. 2006); jednak utrzymanie korzystnych warunków środowiskowych zarówno dla naskórka roślinnego, jak i komórek bakteryjnych, było trudne. Epidermę liścia można utrzymać przy życiu i w zdrowym stanie w buforze MES (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) na potrzeby eksperymentów elektrofizjologicznych komórek szparkowych. Jednak bufor ten nie jest odpowiedni do przygotowania zawiesiny bakteryjnej. Z drugiej strony komórki bakteryjne mogą przetrwać w wodzie, która nie nadaje się do długotrwałego utrzymania naskórka. Gdy preparat z naskórka unosi się na wodzie, komórki naskórka wystawione na działanie powietrza wysychają w ciągu 4 godzin, co ogranicza czas prowadzenia eksperymentu. Idealna metoda oceny wpływu konkretnego bodźca na komórki szparkowe powinna w jak największym stopniu minimalizować ingerencję w fizjologię szparek oraz w naturalne środowisko rośliny. Opracowaliśmy zatem nową metodę oceny reakcji szparek na żywe bakterie, w której uszkadzanie i manipulacje przy liściu są znacznie ograniczone, co ma na celu zapewnienie łatwo powtarzalnego i wiarygodnego testu szparkowego. Protokół opiera się na barwieniu nienaruszonego liścia jodkiem propidium (PI), inkubacji zbarwionego liścia z zawiesiną bakteryjną oraz obserwacji liści pod konfokalnym mikroskopem skaningowym. Ostatecznie metoda ta umożliwia obserwację tej samej żywej próbki liścia przez dłuższy czas w warunkach, które ściśle naśladują naturalne warunki, w jakich rośliny są atakowane przez patogeny.

Protokół

1. Uprawa roślin i przygotowanie bakterii

1. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszankę podłoża do wzrostu (Redi-earth plug and seedling mix, Sun Gro), drobnego wermikulitu i perlitu w proporcji 1:1:1 v:v:v.
2. Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej (22°C, 12 godzin dziennego oświetlenia o natężeniu 100 μmol/mm²/sec i wilgotności 65±5%) i podlewaj w razie potrzeby. Rośliny są gotowe do użycia po 4-6 tygodniach, gdy wykształcą młode, w pełni rozwinięte liście przed stadium kwitnienia.
3. Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kulturę bakterii. Wyseij Pseudomonas syringae z zapasu glicerolowego na zmodyfikowane podłoże LB (10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu z drożdży, 5 g/L NaCl pH 7.0 oraz 1,5% agaru) i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 28°C. Do przygotowania inokulum używaj świeżej kultury i zawsze rozpoczynaj hodowlę na płytkach z zapasów glicerolowych, ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach.
4. Wykorzystaj bakterie wyrosłe na płytce do przygotowania 10 mL płynnej kultury P. syringae w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28°C przy intensywnym wstrząsaniu, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w zakresie od 0,8 do 1.
5. Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1360 xg przez 10 minut. Resuspenduj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowe OD wynosiło 0,2. Taka wartość OD odpowiada 10⁸ jednostkom tworzących kolonie (CFU)/mL. Po przygotowaniu bakterii przystąp do przygotowania liści i przeprowadzenia testu.

2. Barwienie liści i inkubacja z bakteriami

1. Aby przeprowadzić barwienie liści, należy najpierw przygotować 20 μM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarcza do jednoczesnego zabarwienia 3 małych liści.
2. Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odłączyć 3 młode, w pełni rozwinięte liście. Całe liście zanurzyć w roztworze PI na 5 minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.
3. Następnie umieścić liść na szkiełku mikroskopowym stroną dolną do dołu. Przeciąć liść ostrym ostrzem brzytwy na cztery części, omijając nerw środkowy, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka.
4. Aby inkubować bakterie z liśćmi, dodać 300 μL zawiesiny bakteryjnej pod fragmenty liści na szkiełku. Upewnić się, że dolna powierzchnia liścia ma kontakt z inokulum.
5. Inkubować próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W czasie obserwacji liści pod mikroskopem przenieść fragmenty liści na nowe szkiełko stroną dolną do góry. Należy pamiętać, że podczas przygotowywania preparatów nie stosuje się szkiełek zakrywkowych. Tą samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji i można zaplanować przebieg czasowy zgodnie z celami badawczymi.

3. Mikroskopia, pomiary i analiza danych

1. Do badania liści wykorzystuje się konfokalny mikroskop skaningowy (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.). Obserwuje się dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI (pobudzenie 453 nm, emisja 543 i 620 nm).
2. Z tych samych próbek liści rejestruje się obrazy aparatów szparkowych w określonych odstępach czasu. Obrazy należy zapisać w celu pomiaru szerokości otworu szparki.
3. Za pomocą przeglądarki obrazów LSM mierzy się szerokość otworu co najmniej 60 szparek dla każdej grupy badawczej w każdym punkcie czasowym.
4. Oblicza się średnią oraz błąd standardowy dla szerokości otworu szparki. Istotność statystyczną wyników można obliczyć, stosując dwustronny, parowy test t Studenta.

4. Reprezentatywne obrazy odpowiedzi aparatów szparkowych na inkubację z bakteriami

1. Oto typowy obraz mikroskopowy (przy użyciu obiektywu 20x) powierzchni liścia Arabidopsis wykonany za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego w trybie jasnego pola (Rycina 1).
2. Jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych oraz umożliwia identyfikację nieuszkodzonych komórek do celów gromadzenia danych (Rycina 2). Na tych mikroografiach można zobaczyć różny stopień otwarcia ujść szparek, od całkowicie zamkniętych po szeroko otwarte.
3. Całkowicie zamknięte szparki są identyfikowane po kształcie komórek szparkowych (Rycina 3). Szerokość otworu przyjmuje się w takim przypadku za 0 μm.
4. W przypadku otwartych szparek (Rycina 4) pokazana szerokość otworu jest mierzona za pomocą linii prostej poprowadzonej przez najszerszy obszar ujścia szparki.
5. Są to typowe wyniki eksperymentalne tego testu szparkowego. Liście Arabidopis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami Pseudomonas syringae. Tylko bakteria Pst DC3000 była w stanie otworzyć szparki zamknięte w ciemności, co zmierzono na podstawie szerokości otworu 60 losowo wybranych szparek na każdy szczep bakteryjny (Rycina 5).

Rysunek 1. Mikrograf powierzchni liścia Arabidopsis. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Należy zauważyć, że szczelina szparkowa nie jest tak wyraźna w porównaniu z widokiem fluorescencyjnym wspomaganym barwieniem jodkiem propidynyum (Rysunek 2).

Rycina 2. Mikrografia powierzchni liścia Arabidopsis barwionego jodkiem propidyny. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Zwróć uwagę na zakres otwarcia porów szparkowych. Żółte strzałki wskazują całkowicie zamknięte szparki, a zielone strzałki wskazują szeroko otwarte szparki.

Rysunek 3. Całkowicie zamknięte szparki zidentyfikowane na podstawie kształtu oraz szczeliny między komórkami szparkowymi. Szerokość otworu uznaje się za 0 μm.

Rysunek 4. Otwarte szparki wykazujące szerokość otworu w μm. Pomiary wykonano za pomocą przeglądarki LSCM na podstawie linii prostej przeprowadzonej przez najszerszy obszar otworu szparkowego.

Rycina 5. Apertura szparek liści Arabidopsis inkubowanych z trzema szczepami Pseudomonas syringae pv. tomato: DC3118, DB29 oraz DC3000. Rośliny były utrzymywane w ciemności podczas czasu trwania eksperymentu. Wyniki przedstawiono jako średnią (n=50-70) ± błąd standardowy. Istotność statystyczną określono za pomocą obustronnego testu t Studenta. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki.

Dyskusja

Przedstawiliśmy prostą procedurę pomiaru szerokości otworu szparkowego w nienaruszonym tkance liścia, co pozwala na łatwą ocenę reakcji szparek na różne zabiegi.

Choć przedstawiliśmy wyniki uzyskane w systemie modelowym Arabidopsis/Pseudomonas syringae, test aparatów szparkowych na nienaruszonym liściu można potencjalnie przeprowadzić z dowolną kombinacją rośliny i bakterii. Protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do wymagań wzrostowych innych roślin i patogenów bakteryjnych. Ogólna zasada i procedura pozostają takie same. Ponadto metoda ta może być przydatna badaczom pragnącym badać funkcjonalną odpowiedź komórek szparkowych nie tylko na żywe mikroorganizmy, ale także na inne bodźce i czynniki chemiczne w warunkach zachowujących naturalne środowisko liścia.

Obrazowanie całego liścia może być trudne ze względu na jego grubość i nierówną topografię. Problem ten można rozwiązać poprzez usunięcie żyłki środkowej liścia, aby leżał on płasko na szkiełku, oraz stosując mikroskopię konfokalną. Można jednak wykorzystać inne rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych w celu uzyskania obrazów powierzchni liścia o wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
Tryptona	Fisher Scientific	BP1421-1
Ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories	0127-01-7
Chlorek sodu	VWR international	7647-14-5
Agar	Bio Express	J637-2500G
Komora wzrostu roślin
Inkubator z wytrząsarką
Konfokalny mikroskop skaningowy