Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Podsumowanie

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Streszczenie

Aparaty szparkowe są naturalnymi otworami w epidermie rośliny, odpowiedzialnymi za wymianę gazową pomiędzy wnętrzem rośliny a środowiskiem. Tworzą je dwie komórki szparkowe, które potrafią zamknąć otwór szparkowy w odpowiedzi na szereg czynników zewnętrznych, w tym natężenie światła, stężenie dwutlenku węgla oraz wilgotność względną (RH). Otwór szparkowy jest również główną drogą wnikania patogenów do liści, co stanowi kluczowy etap rozwoju choroby. Niedawne badania wykazały, że zamknięcie otworu jest skuteczne w minimalizowaniu rozwoju chorób bakteryjnych u roślin Arabidopsis; jest to integralna część wrodzonej odporności roślin. Wcześniej wykorzystywaliśmy preparaty z naskórka do oceny reakcji szparek na żywe bakterie (Melotto et al. 2006); jednak utrzymanie korzystnych warunków środowiskowych zarówno dla naskórka roślinnego, jak i komórek bakteryjnych, było trudne. Epidermę liścia można utrzymać przy życiu i w zdrowym stanie w buforze MES (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) na potrzeby eksperymentów elektrofizjologicznych komórek szparkowych. Jednak bufor ten nie jest odpowiedni do przygotowania zawiesiny bakteryjnej. Z drugiej strony komórki bakteryjne mogą przetrwać w wodzie, która nie nadaje się do długotrwałego utrzymania naskórka. Gdy preparat z naskórka unosi się na wodzie, komórki naskórka wystawione na działanie powietrza wysychają w ciągu 4 godzin, co ogranicza czas prowadzenia eksperymentu. Idealna metoda oceny wpływu konkretnego bodźca na komórki szparkowe powinna w jak największym stopniu minimalizować ingerencję w fizjologię szparek oraz w naturalne środowisko rośliny. Opracowaliśmy zatem nową metodę oceny reakcji szparek na żywe bakterie, w której uszkadzanie i manipulacje przy liściu są znacznie ograniczone, co ma na celu zapewnienie łatwo powtarzalnego i wiarygodnego testu szparkowego. Protokół opiera się na barwieniu nienaruszonego liścia jodkiem propidium (PI), inkubacji zbarwionego liścia z zawiesiną bakteryjną oraz obserwacji liści pod konfokalnym mikroskopem skaningowym. Ostatecznie metoda ta umożliwia obserwację tej samej żywej próbki liścia przez dłuższy czas w warunkach, które ściśle naśladują naturalne warunki, w jakich rośliny są atakowane przez patogeny.

Protokół

1. Hodowla roślin i przygotowanie bakterii

1. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszaninę podłoża do wzrostu (Redi-earth plug and seedling mix, Sun Gro), drobnego wermikulitu i perlitu w stosunku 1:1:1 v:v:v.
2. Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej (22°C, 12 godzin dziennego oświetlenia o natężeniu 100 μmol/mm²/sec i wilgotność 65±5%) i podlewaj w razie potrzeby. Rośliny są gotowe do użycia po 4-6 tygodniach, gdy posiadają młode, w pełni rozwinięte liście przed stadium kwitnienia.
3. Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kulturę bakterii. Wyseij Pseudomonas syringae z banku w glicerolu na zmodyfikowane podłoże LB (10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 5 g/L NaCl pH 7.0 oraz 1,5% agaru) i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 28°C. Do przygotowania inokulum używaj świeżej kultury i zawsze rozpoczynaj hodowlę na płytkach z zapasów w glicerolu, ponieważ bakterie stają się mniej zjadliwe po pasażowaniu.
4. Użyj bakterii wyhodowanych na płytce, aby rozpocząć 10 mL hodowlę płynnej P. syringae w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28°C przy intensywnym wytrząsaniu, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w zakresie od 0,8 do 1.
5. Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1360 xg przez 10 minut. Resuspenduj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowa OD wynosiła 0,2. Ta wartość OD odpowiada 10⁸ jednostkom tworzących kolonie (CFU)/mL. Po przygotowaniu bakterii przystąp do przygotowania liści i przeprowadzenia analizy.

2. Barwienie liści i inkubacja z bakteriami

1. Aby zabarwić liście, należy najpierw przygotować 20 μM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarczy do jednoczesnego zabarwienia 3 małych liści.
2. Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odciąć 3 młode, w pełni rozwinięte liście. Całe liście zanurzyć w roztworze PI na 5 minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.
3. Następnie położyć liść stroną dolną do dołu na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą ostrego ostrza żyletki pociąć liść na cztery części, pomijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka.
4. Aby inkubować bakterie z liśćmi, pod kawałki liści na szkiełku dodać 300 μL zawiesiny bakteryjnej. Należy upewnić się, że dolna powierzchnia liścia ma kontakt z inokulum.
5. Inkubować próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie obserwacji liści pod mikroskopem, przenieść kawałki liści na nowe szkiełko stroną dolną do góry. Należy pamiętać, że podczas montowania preparatów nie stosuje się szkiełek przykrywek. Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można dostosować do celów badawczych.

3. Mikroskopia, pomiary i analiza danych

1. Do badania liści wykorzystuje się konfokalny mikroskop skaningowy (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.). Należy obserwować dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI (pobudzenie 453 nm, emisja 543 i 620 nm).
2. Przy użyciu tych samych próbek liści należy rejestrować obrazy aparatów szparkowych w czasie. Obrazy należy zapisać w celu późniejszego pomiaru szerokości szczeliny szparkowej.
3. Za pomocą przeglądarki obrazów LSM należy zmierzyć szerokość szczeliny szparkowej dla co najmniej 60 aparatów szparkowych dla każdej serii badawczej w każdym punkcie czasowym.
4. Należy obliczyć średnią oraz błąd standardowy dla szerokości szczeliny szparkowej. Istotność statystyczną wyników można obliczyć, stosując dwustronny, parzysty test t-Studenta.

4. Reprezentatywne obrazy reakcji aparatów szparkowych na inkubację z bakteriami

1. Oto typowy obraz mikroskopowy (przy użyciu obiektywu 20x) powierzchni liścia Arabidopsis wykonany za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego w trybie jasnego pola (Rysunek 1).
2. Jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych, a ponadto pozwala na identyfikację nieuszkodzonych komórek do celów zbierania danych (Rysunek 2). Na tych mikrografiach widoczny jest zakres szerokości otwarć porów szparkowych, od całkowicie zamkniętych po szeroko otwarte szparki.
3. Całkowicie zamknięte szparki rozpoznaje się po kształcie komórek szparkowych (Rysunek 3). Szerokość apertury uznaje się w takim przypadku za 0 μm.
4. W przypadku otwartych szparek (Rysunek 4) wskazaną szerokość apertury mierzy się za pomocą linii prostej poprowadzonej przez najszerszy obszar poru szparkowego.
5. Są to typowe wyniki eksperymentalne tego testu szparkowego. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami Pseudomonas syringae. Tylko bakteria Pst DC3000 była w stanie otworzyć szparki zamknięte w ciemności, co zmierzono określając szerokość apertury 60 losowo wybranych szparek na każdy szczep bakteryjny (Rysunek 5).

Rysunek 1. Mikrograf powierzchni liścia Arabidopsis. Jeden obszar widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Należy zauważyć, że otwarcie szparek aparatów grzęzowych nie jest tak wyraźne w porównaniu z widokiem fluorescencyjnym wspomaganym barwieniem jodkiem propidynyum (Rysunek 2).

Rycina 2. Mikrografia powierzchni liścia Arabidopsis barwionego jodkiem propidyny. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Zauważalny jest zakres otwarcia ujść szparek. Żółte strzałki wskazują całkowicie zamknięte szparki, a zielone strzałki wskazują szparki szeroko otwarte.

Rycina 3. Całkowicie zamknięte szparki zidentyfikowane na podstawie kształtu oraz szczeliny między komórkami szparkowymi. Szerokość otworu przyjmuje się za 0 μm.

Rycina 4. Otwarte szparki pokazujące szerokość otworu w μm. Pomiary wykonano przy użyciu przeglądarki LSCM na podstawie linii prostej wyrysowanej w najszerszym obszarze otworu szparkowego.

Rycina 5. Apertura szparek stomatycznych liści Arabidopsis inkubowanych z trzema szczepami Pseudomonas syringae pv. tomato: DC3118, DB29 oraz DC3000. Rośliny przetrzymywano w ciemności podczas czasu trwania eksperymentu. Wyniki przedstawiono jako średnią (n=50-70) ± błąd standardowy. Istotność statystyczną określono za pomocą obustronnego testu t Studentowi. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki.

Dyskusja

Przedstawiliśmy prostą procedurę pomiaru szerokości otworu szparkowego w nienaruszonym tkance liścia, co pozwala na łatwą ocenę reakcji szparek na różne zabiegi.

Choć przedstawiliśmy wyniki uzyskane w systemie modelowym Arabidopsis/Pseudomonas syringae, test aparatów szparkowych na nienaruszonym liściu można potencjalnie przeprowadzić z dowolną kombinacją rośliny i bakterii. Protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do wymagań wzrostowych innych roślin i patogenów bakteryjnych. Ogólna zasada i procedura pozostają takie same. Ponadto metoda ta może być przydatna badaczom pragnącym badać funkcjonalną odpowiedź komórek szparkowych nie tylko na żywe mikroorganizmy, ale także na inne bodźce i czynniki chemiczne w warunkach zachowujących naturalne środowisko liścia.

Obrazowanie całego liścia może być trudne ze względu na jego grubość i nierówną topografię. Problem ten można rozwiązać poprzez usunięcie żyłki środkowej liścia, aby leżał on płasko na szkiełku, oraz stosując mikroskopię konfokalną. Można jednak wykorzystać inne rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych w celu uzyskania obrazów powierzchni liścia o wysokiej rozdzielczości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
Tryptona	Fisher Scientific	BP1421-1
Ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories	0127-01-7
Chlorek sodu	VWR international	7647-14-5
Agar	Bio Express	J637-2500G
Komora wzrostu roślin
Inkubator z wytrząsarką
Konfokalny mikroskop skaningowy