Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.
Artykuł metodologiczny
Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aparaty szparkowe są naturalnymi otworami w epidermie rośliny, odpowiedzialnymi za wymianę gazową pomiędzy wnętrzem rośliny a środowiskiem. Tworzą je dwie komórki szparkowe, które potrafią zamknąć otwór szparkowy w odpowiedzi na szereg czynników zewnętrznych, w tym natężenie światła, stężenie dwutlenku węgla oraz wilgotność względną (RH). Otwór szparkowy jest również główną drogą wnikania patogenów do liści, co stanowi kluczowy etap rozwoju choroby. Niedawne badania wykazały, że zamknięcie otworu jest skuteczne w minimalizowaniu rozwoju chorób bakteryjnych u roślin Arabidopsis; jest to integralna część wrodzonej odporności roślin. Wcześniej wykorzystywaliśmy preparaty z naskórka do oceny reakcji szparek na żywe bakterie (Melotto et al. 2006); jednak utrzymanie korzystnych warunków środowiskowych zarówno dla naskórka roślinnego, jak i komórek bakteryjnych, było trudne. Epidermę liścia można utrzymać przy życiu i w zdrowym stanie w buforze MES (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) na potrzeby eksperymentów elektrofizjologicznych komórek szparkowych. Jednak bufor ten nie jest odpowiedni do przygotowania zawiesiny bakteryjnej. Z drugiej strony komórki bakteryjne mogą przetrwać w wodzie, która nie nadaje się do długotrwałego utrzymania naskórka. Gdy preparat z naskórka unosi się na wodzie, komórki naskórka wystawione na działanie powietrza wysychają w ciągu 4 godzin, co ogranicza czas prowadzenia eksperymentu. Idealna metoda oceny wpływu konkretnego bodźca na komórki szparkowe powinna w jak największym stopniu minimalizować ingerencję w fizjologię szparek oraz w naturalne środowisko rośliny. Opracowaliśmy zatem nową metodę oceny reakcji szparek na żywe bakterie, w której uszkadzanie i manipulacje przy liściu są znacznie ograniczone, co ma na celu zapewnienie łatwo powtarzalnego i wiarygodnego testu szparkowego. Protokół opiera się na barwieniu nienaruszonego liścia jodkiem propidium (PI), inkubacji zbarwionego liścia z zawiesiną bakteryjną oraz obserwacji liści pod konfokalnym mikroskopem skaningowym. Ostatecznie metoda ta umożliwia obserwację tej samej żywej próbki liścia przez dłuższy czas w warunkach, które ściśle naśladują naturalne warunki, w jakich rośliny są atakowane przez patogeny.
Protokół
1. Uprawa roślin i przygotowanie bakterii
- Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszankę podłoża do wzrostu (Redi-earth plug and seedling mix, Sun Gro), drobnego wermikulitu i perlitu w proporcji 1:1:1 v:v:v.
- Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej (22°C, 12 godzin dziennie przy natężeniu światła 100 μmol/mm2/sec i wilgotności 65±5%) i podlewaj w razie potrzeby. Rośliny są gotowe do użycia w ciągu 4-6 tygodni, gdy wykształcą młode, w pełni rozwinięte liście przed stadium kwitnienia.
- Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kulturę bakterii. Wyseciuj Pseudomonas syringae z banku w glicerolu na modyfikowane podłoże LB (10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu z drożdży, 5 g/L NaCl pH 7.0 oraz 1,5% agaru) i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 28°C. Do przygotowania inokulum używaj świeżej kultury i zawsze rozpoczynaj hodowlę na płytkach z banków w glicerolu, ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach.
- Wykorzystaj bakterie wyhodowane na płytce do zaszczepienia 10 mL płynnej kultury P. syringae w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28°C przy intensywnym wytrząsaniu, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w zakresie od 0,8 do 1.
- Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1360 xg przez 10 minut. Resuspenderuj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowa wartość OD wynosiła 0,2. Ta wartość OD odpowiada 108 jednostkom tworzących kolonie (CFU)/mL. Po przygotowaniu bakterii przystąp do przygotowania liści i przeprowadzenia testu.
2. Barwienie liści i inkubacja z bakteriami
- Aby zbarwić liście, należy najpierw przygotować 20 μM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarcza do jednoczesnego zbarwienia 3 małych liści.
- Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odciąć 3 młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurzyć całe liście w roztworze PI na 5 minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.
- Następnie położyć liść na szkiełku przedmiotowym stroną dolną do dołu. Przeciąć liść ostrym ostrzem żyletki na cztery części, omijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka.
- Aby inkubować bakterie z liśćmi, dodać 300 μL zawiesiny bakteryjnej pod fragmenty liścia na szkiełku. Upewnić się, że dolna powierzchnia liścia styka się z inokulum.
- Inkubować próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie obserwacji liści pod mikroskopem przenieść fragmenty liścia na nowe szkiełko stroną dolną do góry. Należy pamiętać, że podczas montowania preparatów nie stosuje się szkiełek nakrywkowych. Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można dostosować do celów badawczych.
3. Mikroskopia, pomiary i analiza danych
- Do badania liści wykorzystuje się konfokalny mikroskop skaningowy (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.). Należy obserwować dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI (wzbudzenie 453 nm, emisja 543 i 620 nm).
- Przy użyciu tych samych próbek liści należy rejestrować obrazy aparatów szparkowych w odstępach czasowych. Obrazy należy zapisać w celu pomiaru szerokości otworu szparkowego.
- Za pomocą przeglądarki obrazów LSM należy zmierzyć szerokość otworu co najmniej 60 szparek dla każdego wariantu badawczego w każdym punkcie czasowym.
- Należy obliczyć średnią i błąd standardowy dla szerokości otworu szparkowego. Istotność statystyczną wyników można obliczyć za pomocą dwustronnego, parzystego testu t Studenta.
4. Reprezentatywne obrazy odpowiedzi szparek aparatów szparkowych na inkubację z bakteriami
- Oto typowy obraz mikroskopowy (z użyciem obiektywu 20x) powierzchni liścia Arabidopsis wykonany za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego w trybie jasnego pola (Rysunek 1).
- Jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych, a dodatkowo pozwala na zidentyfikowanie nieuszkodzonych komórek do gromadzenia danych (Rysunek 2). Na tych mikrofotografiach można zaobserwować różny stopień otwarcia ujść szparek, od całkowicie zamkniętych po szeroko otwarte.
- Całkowicie zamknięte szparki są identyfikowane po kształcie komórek szparkowych (Rysunek 3). Szerokość otworu uznaje się w takim przypadku za 0 μm.
- W przypadku szparek otwartych (Rysunek 4) pokazaną szerokość otworu mierzy się, rysując linię prostą przez najszerszy obszar otworu szparkowego.
- Są to typowe wyniki eksperymentalne tego testu szparek. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami Pseudomonas syringae. Tylko bakteria Pst DC3000 była w stanie otworzyć zamknięte w ciemności szparki, co zmierzono na podstawie szerokości otworu 60 losowo wybranych szparek na każdy szczep bakteryjny (Rysunek 5).
Rysunek 1. Mikrograf powierzchni liścia Arabidopsis. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Należy zauważyć, że szparki są mniej wyraźne w porównaniu z obrazem fluorescencyjnym uzyskanym dzięki barwieniu jodkiem propidynyum (Rysunek 2).
Rycina 2. Mikrografia powierzchni liścia Arabidopsis barwionego jodkiem propidyny. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Zwróć uwagę na różny stopień otwarcia ujść szparek. Żółte strzałki wskazują całkowicie zamknięte szparki, a zielone strzałki wskazują szparki szeroko otwarte.
Rycina 3. Całkowicie zamknięte aparaty szparkowe zidentyfikowane na podstawie kształtu i szczeliny między komórkami szparkowymi. Szerokość otworu uznaje się za 0 μm.
Rysunek 4. Otwarte szparki ukazujące szerokość otworu w μm. Pomiary wykonano za pomocą przeglądarki LSCM na podstawie linii prostej narysowanej w najszerszym obszarze poru szparkowego.
Rycina 5. Otwór szparkowy liści Arabidopsis inkubowanych z trzema szczepami Pseudomonas syringae pv. tomato: DC3118, DB29 oraz DC3000. Rośliny przetrzymywano w ciemności podczas czasu trwania eksperymentu. Wyniki przedstawiono jako średnią (n=50-70) ± błąd standardowy. Istotność statystyczną określono za pomocą obustronnego testu t Studenta. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki.
Dyskusja
Przedstawiliśmy prostą procedurę pomiaru szerokości otworu szparkowego w nienaruszonym tkance liścia, co pozwala na łatwą ocenę reakcji szparek na różne zabiegi.
Choć przedstawiliśmy wyniki uzyskane w systemie modelowym Arabidopsis/Pseudomonas syringae, test aparatów szparkowych na nienaruszonym liściu można potencjalnie przeprowadzić z dowolną kombinacją rośliny i bakterii. Protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do wymagań wzrostowych innych roślin i patogenów bakteryjnych. Ogólna zasada i procedura pozostają takie same. Ponadto metoda ta może być przydatna badaczom pragnącym badać funkcjonalną odpowiedź komórek szparkowych nie tylko na żywe mikroorganizmy, ale także na inne bodźce i czynniki chemiczne w warunkach zachowujących naturalne środowisko liścia.
Obrazowanie całego liścia może być trudne ze względu na jego grubość i nierówną topografię. Problem ten można rozwiązać poprzez usunięcie żyłki środkowej liścia, aby leżał on płasko na szkiełku, oraz stosując mikroskopię konfokalną. Można jednak wykorzystać inne rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych w celu uzyskania obrazów powierzchni liścia o wysokiej rozdzielczości.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie to zostało sfinansowane z grantu National Institute of Health oraz ze środków University of Texas at Arlington przyznanych dla MM.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jodek propidyny | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Tryptona | Fisher Scientific | BP1421-1 | |
| Ekstrakt drożdżowy | Difco Laboratories | 0127-01-7 | |
| Chlorek sodu | VWR international | 7647-14-5 | |
| Agar | Bio Express | J637-2500G | |
| Komora wzrostu roślin | |||
| Inkubator z wytrząsarką | |||
| Konfokalny mikroskop skaningowy |
Bibliografia
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
Przedruki i uprawnienia
