Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Podsumowanie

Przedstawiamy procedury wykazujące za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że ligandy wiążą się z błoną powierzchniową pierwotniaków trawiących celulozę w jelitach tajwańskich termitów podziemnych oraz że ligandy sprzężone z peptydami litycznymi zabijają te pierwotniaki in vitro (beztlenowa hodowla pierwotniaków) i in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita).

Streszczenie

Opracowujemy nowatorskie podejście do zwalczania termitów podziemnych, które doprowadziłoby do zmniejszenia zależności od stosowania chemicznych pestycydów. Termity podziemne są zależne od pierwotniaków znajdujących się w jelitach robotnic, które umożliwiają im efektywne trawienie drewna. Wykazano, że peptydy lityczne zabijają różne pasożytnicze pierwotniaki (Mutwiri et al. 2000), a także pierwotniaki w jelitach termita podziemnego formozańskiego, Coptotermes formosanus (Husseneder i Collier 2009). Peptydy lityczne stanowią część nieswoistego układu odpornościowego eukariotów i niszczą błony komórkowe mikroorganizmów (Leuschner i Hansel 2004). Większość peptydów litycznych prawdopodobnie nie szkodzi wyższym eukariotom, ponieważ nie wpływają one na elektrycznie obojętne błony komórkowe zawierające cholesterol, charakterystyczne dla wyższych eukariotów (Javadpour et al. 1996). Działanie peptydów litycznych można skierować do konkretnych typów komórek poprzez dodanie liganda. Na przykład Hansel et al. (2007) donieśli, że peptydy lityczne sprzężone z ligandami receptorów błon komórkowych komórek nowotworowych mogą być wykorzystywane do niszczenia komórek raka piersi, podczas gdy same peptydy lityczne lub sprzężone z peptydami nieswoistymi nie były skuteczne. Peptydy lityczne sprzężono również z hormonami ludzkimi, które wiążą się z receptorami na komórkach guza, w celu celowego niszczenia komórek raka prostaty i jąder (Leuschner i Hansel 2004).

W niniejszym artykule przedstawiamy techniki stosowane do wykazania aktywności protozoobójczej peptydy litycznej (Hecate) sprzężonej z ligandem heptapeptydowym, który wiąże się z błoną powierzchniową pierwotniaków pochodzących z jelit tajwanowskiego termita podziemnego. Techniki te obejmują wycinanie jelit z robotnic termitów, beztlenową hodowlę pierwotniaków jelitowych (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), a także potwierdzenie mikroskopowe, że ligand znakowany barwnikiem fluorescencyjnym wiąże się z pierwotniakami jelitowymi termitów oraz innymi wolnożyjącymi pierwotniakami, lecz nie wiąże się z bakteriami ani tkanką jelitową. Wykazujemy również, że ten sam ligand sprzężony z peptydem litycznym skutecznie zabija pierwotniaki jelitowe termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) oraz in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego robotnic), przy czym wykazuje on mniejszą aktywność bakteriobójczą niż sam peptyd lityczny. Utrata pierwotniaków prowadzi do śmierci termitów w czasie krótszym niż dwa tygodnie.

W przyszłości będziemy genetycznie modyfikować mikroorganizmy zdolne do przetrwania w jelicie tylnym termitów, które rozprzestrzeniając się w kolonii jako „konie trojańskie”, będą ekspresować peptydy ligandolityczne. Peptydy te doprowadziłyby do śmierci pierwotniaków w jelitach termitów, a w konsekwencji do wyginięcia osobników w kolonii. Peptydy ligandolityczne mogą być również przydatne w opracowywaniu leków przeciwko pasożytniczym pierwotniakom.

Protokół

Eksperyment 1: Wyizolowanie pierwotniaków z jelit termitów w warunkach beztlenowych

1. Użyj wentylatora skrzynkowego (Coy Laboratories) w komorze rękawicowej, aby stale cyrkulować powietrze przez osuszacz i pakety Stak-Paks z katalizatorem typu D w celu kontrolowania wilgotności i poziomu tlenu oraz eliminacji nierównomiernych temperatur. Wypełnij komorę rękawicową ciągłym strumieniem azotu przez 20 do 30 min. Monitoruj poziom tlenu za pomocą czujnika tlenu (C-squared, Inc.) przez 1 h. W razie potrzeby użyj azotu, aby osiągnąć i utrzymać warunki beztlenowe.
2. Przygotuj podłoże Trager U (Trager 1934) i dostosuj pH do 7,0. Przeżuwaj sterylizowane przez filtr podłoże w komorze rękawicowej mieszaniną 2,5% wodoru, 5% dwutlenku węgla i 92,5% azotu przez 1 h, aby usunąć pozostałości tlenu.
3. Zasylikuj wszystkie materiały, w tym szkiełka przedmiotowe, probówki do mikrocentryfugi, pipety, szkło laboratoryjne itp., wykorzystywane w eksperymentach, używając Sigmacote, aby zapobiec adsorpcji pierwotniaków lub peptydów do powierzchni (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/ Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Ponieważ pierwotniaki z jelit termitów są organizmami ściśle beztlenowymi, nie mogą być one wystawione na działanie tlenu. Dlatego następujące kroki są wykonywane w warunkach beztlenowych w komorze rękawicowej (patrz 1.1). Za pomocą pęsety zanurz całe ciało robotnicy termita w 70% etanolu i delikatnie obracaj przez około 10 s, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe.
5. Wyjmij robotnicę z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na czystej chusteczce Kimwipe przez około 20 s. Użyj sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami, aby utrzymać odwłok robotnicy, a końcówkę odwłoka chwyć drugą pęsetą, aby delikatnie wyciągnąć jelita w górę lub w dół pod kątem 45 stopni. Jeśli jelita zostaną wyciągnięte pod kątem prostym i zbyt dużą siłą, prawdopodobnie ulegną przerwaniu. Umieść 10 jelit w kropli 100 μl podłoża Trager U na szkiełku przedmiotowym.
6. Przebij jelita sterylnymi, cienkimi sondami sekcyjnymi, aby uwolnić pierwotniaki, a następnie delikatnie przenieś zawartość jelit pipetą 200 μl do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1 ml zawierającej 900 μl podłoża Trager U. Po odczekaniu na sedymentację fragmentów ścian jelit (5 s), przenieś 900 μl supernatantu do nowej probówki.
7. Przenieś 10 μl hodowli pierwotniaków na zasylikowane szkiełko przedmiotowe i sprawdź stan pierwotniaków pod mikroskopem przy powiększeniu 200 X.
8. Przygotuj hodowle kontrolne tlenowych pierwotniaków Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp., Euglena sp. i Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC), a także nocną hodowlę Escherichia coli w podłożu hodowlanym zalecanym przez dostawcę.

Eksperyment 2: Dodanie liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym do kultur pierwotniaków i bakterii w celu przetestowania wiązania z błonami powierzchniowymi i ścianami komórkowymi

Wcześniej wykorzystaliśmy biblioteki fagowej prezentacji (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) do zidentyfikowania 19 sekwencji heptapeptydowych wiążących się z pierwotniakami (protokoły dostępne pod adresem http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Ligand o sekwencji peptydowej (ALNLTLH), która wykazywała podobieństwo do domniemanych glikoprotein znanych z błony Trypanosoma brucei, został zsyntetyzowany i sprzężony z fluorescencyjną sondą C-końcową (EDANS, kwas 5-((2-aminoetylo)amino)naftaleno-1-sulfonowy, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) poprzez syntezę peptydów w fazie stałej (SSPS) przy użyciu żywicy EDANS NovaTag (EMD Biosciences). W niniejszej pracy wykazujemy, że ligand wiąże się z pierwotniakami wyizolowanymi z jelita termitów oraz innymi wolnożyjącymi pierwotniakami, ale nie wiąże się z bakteriami.

1. Hodowlę pierwotniaków przeprowadzić zgodnie z opisem w Exp. 1. Pierwotniaki utrwalić 10 % formaldehydem w temperaturze 4 °C przez 12 h.
2. Zawiesinę pierwotniaków odwirować (30 x g, 10 min), odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć osad zawierający utrwalone pierwotniaki w 1ml pożywki Trager U. Osad ponownie zawiesić w 1 ml pożywki Trager U. W analogiczny sposób utrwalić inne pierwotniaki oraz bakterie E. coli w celu przygotowania kontroli.
3. Utrwalone mikroorganizmy inkubować przez 1-2 h z roztworem syntetycznego liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym EDANS (przygotowanym w wodzie) w stężeniu końcowym 50 μM. Ligand lepiej rozpuszcza się w wodzie niż w pożywce Trager U.
4. Mikroorganizmy obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400 X, przy maksimum absorbancji 341 nm i emisji w obszarze niebieskim przy 471 nm.

Eksperyment 3: Badanie aktywności protozoacydalnej ligandu sprzężonego z peptydem litycznym in vitro (hodowla pierwotniaków)

Konjugat liganda i peptydu litycznego Hecate (Mutwiri et al. 2000) został wcześniej zsyntezowany w LSU Protein Facility.

1. Zasilanizuj materiały i przygotuj hodowlę pierwotniaków z jelit termitów w beztlenowej komorze z rękawicami, zgodnie z opisem w Exp. 1.
2. Przygotuj hodowle tlenowych mikroorganizmów kontrolnych (np. E. coli oraz wolnożyjącego gatunku pierwotniaków T. pyriformis).
3. W beztlenowym środowisku komory z rękawicami, pipetuj 6 aliquotów po 198 μl hodowli pierwotniaków do probówek Eppendorf o pojemności 0,5 ml. Do połowy aliquotów hodowli pierwotniaków z jelit termitów dodaj 2 μl roztworu litycznego peptydu z ligandem o stężeniu 100 μM (stężenie końcowe 1 μM). Do pozostałej połowy aliquotów dodaj 2 μl wody (kontrole).
4. Na blacie laboratoryjnym przygotuj analogiczne aliquoty E. coli i T. pyriformis z 1 μM peptydu litycznego, litycznego peptydu z ligandem lub wodą.
5. Po 1 h przenieś 10 μl każdej hodowli pierwotniaków na szkiełka. Porównaj przeżywalność potraktowanych pierwotniaków z kontrolami pod mikroskopem przy powiększeniu 200 X.
6. Po 1 h wysiej 100 μl rozcieńczenia ok. 10^-4 hodowli E. coli na podłożu BHI i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C. Porównaj liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytkach.

Eksperyment 4: Wstrzykiwanie liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym do jelita tylnego termita

1. Wytocz igły (Model GD-1, 1 X 900 mm) za pomocą wyciągarki do szklanych mikropipet Narishige PC-10 z dwustopniowym poziomem grzania (65 i 48), aby uzyskać rozmiar końcówki 20-30 μm. Potwierdź rozmiar końcówki, mierząc ją pod mikroskopem przy użyciu mikrometru.
2. Wypełnij jedną igłę około 30 μl 50 μM fluorescencyjnie znakowanego ligandu zawieszonego w wodzie, używając dołączonej strzykawki. Drugą igłę wypełnij wodą w celu uzyskania kontroli. Zamocuj mikropipetę (pojemność 0,5 μl i długość 32 mm, Drummond Scientific Company) w uchwycie mikromanipulatora. Zamocuj igłę w uchwycie systemu wstrzykiwania w drugim mikromanipulatorze. Ustaw wstępne parametry wstrzykiwania na około 1 s długości impulsu i ciśnienie wstrzykiwania 10-12 psi. Powoli wprowadź igłę do mikropipety i wstrzyknij roztwór za pomocą elektronicznego systemu wstrzykiwania wysokiej prędkości sterowanego pedałem, z kontrolą długości impulsu podłączoną do kontrolowanego przepływu azotu, co zapewnia powtarzalne wstrzykiwanie stałej objętości. Po wstrzyknięciu wyjmij mikropipetę i zmierz długość wstrzykniętego roztworu za pomocą suwmiarki Vernier. Oblicz objętość wstrzykniętego roztworu na podstawie znanych parametrów mikropipety. Dostosuj ciśnienie azotu i długość impulsu, aby w pojedynczej iniekcji podać 0,3 μl roztworu.
3. Uciśnij koniec odwłoka robotnicy termita miękką pęsetą, aby usunąć wszelkie odchody znajdujące się w odbytnicy. Unieruchom robotnicę termita, schładzając ją na lodzie przez 5 min.
4. Przygotuj odbiorniki do trzymania robotnic termitów, odcinając końcówki pipet o pojemności 100 μl za pomocą ostrza skalpela. Przytnij końcówkę do długości 10-12 mm i stosuj zgodnie z rozmiarem termitów.
5. Zamocuj odbiornik do mikromanipulatora. Umieść robotnicę na płytce Petriego stroną grzbietową do dołu i wciągnij ją głową do odbiornika za pomocą pompy ssącej z azotem, tak aby koniec ciała robotnicy wystawał z odbiornika.
6. Trzymając termita w odbiorniku, ostrożnie wprowadź wypełnioną igłę za pomocą mikromanipulatora, wkładając ją do odbytu robotnicy. Wstrzyknij 0,3 μl roztworu (fluorescencyjnie znakowanego ligandu lub wody dla kontroli).
7. Umieść robotnice po wstrzyknięciu ligandu lub wody w oddzielnych płytkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i utrzymuj je w temperaturze 26±2 °C przy 78% R.H.
8. Wypreparuj jelita z wstrzykniętych termitów i zbierz pierwotniaki po 24 h, zgodnie z opisem powyżej w Exp. 1. Utrwal i zaobserwuj pierwotniaki zgodnie z opisem w Exp. 2.

Eksperyment 5: Badanie aktywności protozoobójczej ligandu sprzężonego z peptydem litycznym in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita)

1. Przeprowadzić silanizację materiałów zgodnie z opisem w Exp. 1.
2. Przygotować 500 μM roztwór peptydu litycznego ligandu w wodzie.
3. Wykonać kroki od 3.1) do 3.4), aby przygotować szklane igły, odbiorniki oraz robotnice termitów.
4. Zgodnie z metodami opisanymi w 3.5) wstrzyknąć 0,3 μl roztworu peptydu litycznego ligandu (grupa badawcza) lub wody (grupa kontrolna) do jelita tylnego 20 robotnic termitów.
5. Utrzymywać termity przez 24 h, następnie usunąć jelita z kilku robotnic i obserwować ich zawartość pod mikroskopem zgodnie z opisem w 3.6) i 3.7).
6. Niezwłocznie po potwierdzeniu śmierci pierwotniaków w jelicie termitów, pozostali traktowani termity oraz grupa kontrolna powinny być przechowywane w szalkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym; śmiertelność należy obserwować codziennie.

Reprezentatywne wyniki:

Doświadczenie 1: Zazwyczaj, przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury, jelito przednie, środkowe i tylne uzyskuje się jako jeden fragment (Rysunek 1a). Pierwotniaki występują w dużym zagęszczeniu w beztlenowych częściach jelita tylnego i mogą zostać uwolnione poprzez przebicie jelita tylnego pęsetą (Rysunek 1b 1&2). Największym gatunkiem pierwotniaka w jelitach termita formozańskiego jest wrzecionowaty P. grassii, który ma 200-300 μm długości i 150 μm szerokości i jest widoczny gołym okiem. Drugim co do wielkości gatunkiem jest gruszkowaty H. hartmanni (50-140 μm długości i 30-80 μm szerokości). Najmniejszym gatunkiem jest stożkowaty S. leidyi (15-50 μm długości i 8-30 μm szerokości; Lai et al. 1983). Gatunki pierwotniaków przedstawiono na Rysunku 2.

W optymalnych warunkach hodowli trzy gatunki pierwotniaków wyizolowane z jelita tajwańskich termitów podziemnych pozostaną żywe i zdrowe przez co najmniej 72 h w anaerobowej pożywce Trager U (Rycina 3a). Jednak w przypadku nieoptymalnych warunków hodowli pierwotniaki szybko giną. Jeśli w pożywce znajdują się pozostałości tlenu, ruch pierwotniaków natychmiast ustaje. Jeśli ciśnienie osmotyczne jest zbyt wysokie lub integralność błony zostaje naruszona, błona powierzchniowa pierwotniaków wypukla się, a komórki pękają (Rycina 3b). Jeśli ciśnienie osmotyczne jest zbyt niskie lub błony są uszkodzone, pierwotniaki marszczą się i kurczą (Rycina 3c).

Eksperyment 2: Potwierdziliśmy, że ligand sprzężony z sondą fluorescencyjną wiązał się ze wszystkimi trzema gatunkami pierwotniaków z jelita tylnego tajwańskich termitów podziemnych w wykrywalnych gęstościach. Wiązanie ligandu zachodzi na całej powierzchni komórki (Rysunek 4). Miejsca wiązania są skoncentrowane w przedniej części pierwotniaków na aksonstylu (warstwie mikrotubul) oraz jądrze w przypadku P. grassii.

Zaobserwowaliśmy nieregularną autofluorescencję cząsteczek drewna pochłoniętych przez pierwotniaki. Jednak autofluorescencję zazwyczaj łatwo odróżnić od specyficznego wiązania ligandu, ponieważ powierzchnia, aksonstyl oraz jądro nie wykazują autofluorescencji (Rysunek 4).

Wykryliśmy również fluorescencję u wszystkich badanych gatunków wolnożyjących pierwotniaków tlenowych (Rysunek 5), co sugeruje, że ligand wiąże się ze strukturami typowymi dla pierwotniaków. Jednak w przypadku E. coli nie zaobserwowano wiązania ligandu.

Eksperyment 3: Stężenie 1 μM peptydu litycznego z ligandem zabiło wszystkie trzy gatunki pierwotniaków z jelit robotnic termitów podziemnych formozańskich oraz wolnożyjących T. pyriformis in vitro w czasie krótszym niż 10 min, podczas gdy kontrole przeżyły. Rysunek 6 przedstawia postępującą utratę integralności błon pierwotniaków z jelit termitów poddanych działaniu peptydu litycznego z ligandem. Błony pęcznieją i pękają, a pierwotniaki kurczą się i giną. Nie zaobserwowano różnic w liczbie kolonii E. coli pomiędzy grupami traktowanymi peptydem litycznym z ligandem a wodą. Jednakże peptyd lityczny bez ligandu znacznie zredukował liczbę kolonii E. coli (Rysunek 7). Sugeruje to, że przyłączenie ligandu w pewnym stopniu chroni mikroorganizmy niebędące celem przed lizą.

Eksperyment 4: Po wstrzyknięciu 0,3 μl 50 μM liganda znakowanego fluorescencyjnie do jelita tylnego robotnic termitów, wiązanie z P. grassii, S. leidyi oraz H. hartmanni potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w sposób analogiczny do Eksperymentu 2 (Rysunek 4). Tkanka jelita termitów nie wykazywała fluorescencji.

Eksperyment 5: Iniekcja 0,3 μl 500 μM litycznego peptydu z ligandem doprowadziła do wyeliminowania wszystkich trzech gatunków pierwotniaków w jelitach tajwańskich termitów podziemnych w ciągu 24 h. Termity padły w ciągu 10 dni po utracie symbiotycznych pierwotniaków. Wcześniej Husseneder i Collier (2009) wstrzyknęli taką samą koncentrację peptydu litycznego do jelit termitów. Bez dołączonego ligandu czas potrzebny na śmierć pierwotniaków w jelitach (72 h) oraz śmierć termitów (sześć tygodni) był dłuższy. Sugeruje to, że ligand zwiększa skuteczność protozoobójczą peptydów litycznych, najprawdopodobniej poprzez wiązanie peptydów litycznych z pierwotniakami.

Rysunek 1. a: Jelito termita formosańskiego na szkiełku preparatu, przedstawiające główne odcinki przewodu pokarmowego (przedjelito, jelito środkowe, jelito końcowe); b 1& 2: Przebicie jelita końcowego pęsetą w celu uwolnienia treści jelitowej zawierającej pierwotniaki.

Rysunek 2. Trzy gatunki pierwotniaków biczowanych występujących w jelicie tylnym tajlandzkiej termity podziemnej: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni oraz c) Spirotrichonympha leidyi.

Rycina 3. Pierwotniaki w hodowli, a) Zdrowe pierwotniaki, b) Pierwotniaki z wypukłymi błonami, c) Skurczone pierwotniaki.

Rycina 4. Potwierdzenie wiązania liganda sprzęgniętego z sondą fluorescencyjną do pierwotniaków jelita termitów (od góry do dołu: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), potraktowanych ligandem znakowanym fluorescencyjnie oraz niepotraktowane kontrole (wykazujące autofluorescencję).

Rysunek 5. Wiązanie ligandu do wolno żyjących pierwotniaków tlenowych: a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena oraz d) Paramecium.

Rysunek 6. Traktowanie pierwotniaków a) wodą (kontrola) oraz b) 1 μM litycznym peptydem ligandowym.

Rysunek 7. Kolonie E. coli na płytkach (rozcieńczenie 10^-4): a) Traktowane wodą (kontrola), b) Traktowane 1 μM peptydem litycznym z ligandem, c) Traktowane 1 μM peptydem litycznym.

Dyskusja

Peptydy ligand-lityczne zostały z sukcesem wykorzystane do skutecznego celowania i niszczenia komórek nowotworowych (Hansel i Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). W oparciu o tę koncepcję opracowaliśmy ligand w formie heptapeptydu, który wiąże się z powierzchnią pierwotniaków w jelitach tajwańskich termitów podziemnych, a następnie połączyliśmy go z peptydem litycznym w celu zniszczenia tych obligatoryjnych, trawiących celulozę symbiontów w jelitach termitów, aby zrealizować kontrolę populacji tych owadów (Husse...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Beztlenowa komora rękawicowa	Coy Laboratories, Inc.	Wykonana na zamówienie
Kontroler środowiskowy Intellus	Percival Scientific, Inc.	I36NL
Wytciągacz szklanych mikropipet PC-10	Narishige International	PC-10
Igły szklane (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Mikromanipulatory Leitz	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Mikroiniekto	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Mikrokapsułki	Drummond Scientific	1-000-0005
System obrazowania fluorescencyjnego LEICA	Leica Microsystems	DMRxA2
Stereomikroskop LEICA	Leica Microsystems	MZ16
Mikroskop LEICA	Leica Microsystems	DMLB
Stereomikroskop Olympus	Olympus Corporation	SZ61