Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Podsumowanie

Przedstawiamy procedury wykazujące za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że ligandy wiążą się z błoną powierzchniową pierwotniaków trawiących celulozę w jelitach tajwańskich termitów podziemnych oraz że ligandy sprzężone z peptydami litycznymi zabijają te pierwotniaki in vitro (beztlenowa hodowla pierwotniaków) i in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita).

Streszczenie

Opracowujemy nowatorskie podejście do zwalczania termitów podziemnych, które doprowadziłoby do zmniejszenia zależności od stosowania chemicznych pestycydów. Termity podziemne są zależne od pierwotniaków znajdujących się w jelitach robotnic, które umożliwiają im efektywne trawienie drewna. Wykazano, że peptydy lityczne zabijają różne pasożytnicze pierwotniaki (Mutwiri et al. 2000), a także pierwotniaki w jelitach termita podziemnego formozańskiego, Coptotermes formosanus (Husseneder i Collier 2009). Peptydy lityczne stanowią część nieswoistego układu odpornościowego eukariotów i niszczą błony komórkowe mikroorganizmów (Leuschner i Hansel 2004). Większość peptydów litycznych prawdopodobnie nie szkodzi wyższym eukariotom, ponieważ nie wpływają one na elektrycznie obojętne błony komórkowe zawierające cholesterol, charakterystyczne dla wyższych eukariotów (Javadpour et al. 1996). Działanie peptydów litycznych można skierować do konkretnych typów komórek poprzez dodanie liganda. Na przykład Hansel et al. (2007) donieśli, że peptydy lityczne sprzężone z ligandami receptorów błon komórkowych komórek nowotworowych mogą być wykorzystywane do niszczenia komórek raka piersi, podczas gdy same peptydy lityczne lub sprzężone z peptydami nieswoistymi nie były skuteczne. Peptydy lityczne sprzężono również z hormonami ludzkimi, które wiążą się z receptorami na komórkach guza, w celu celowego niszczenia komórek raka prostaty i jąder (Leuschner i Hansel 2004).

W niniejszym artykule przedstawiamy techniki stosowane do wykazania aktywności protozoobójczej peptydy litycznej (Hecate) sprzężonej z ligandem heptapeptydowym, który wiąże się z błoną powierzchniową pierwotniaków pochodzących z jelit tajwanowskiego termita podziemnego. Techniki te obejmują wycinanie jelit z robotnic termitów, beztlenową hodowlę pierwotniaków jelitowych (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), a także potwierdzenie mikroskopowe, że ligand znakowany barwnikiem fluorescencyjnym wiąże się z pierwotniakami jelitowymi termitów oraz innymi wolnożyjącymi pierwotniakami, lecz nie wiąże się z bakteriami ani tkanką jelitową. Wykazujemy również, że ten sam ligand sprzężony z peptydem litycznym skutecznie zabija pierwotniaki jelitowe termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) oraz in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego robotnic), przy czym wykazuje on mniejszą aktywność bakteriobójczą niż sam peptyd lityczny. Utrata pierwotniaków prowadzi do śmierci termitów w czasie krótszym niż dwa tygodnie.

W przyszłości będziemy genetycznie modyfikować mikroorganizmy zdolne do przetrwania w jelicie tylnym termitów, które rozprzestrzeniając się w kolonii jako „konie trojańskie”, będą ekspresować peptydy ligandolityczne. Peptydy te doprowadziłyby do śmierci pierwotniaków w jelitach termitów, a w konsekwencji do wyginięcia osobników w kolonii. Peptydy ligandolityczne mogą być również przydatne w opracowywaniu leków przeciwko pasożytniczym pierwotniakom.

Protokół

Eksperyment 1: Wyizolowanie pierwotniaków z jelit termitów w warunkach beztlenowych

1. Użyj wentylatora w komorze rękawicowej (Coy Laboratories), aby stale cyrkulować powietrze przez osuszacz i wkłady katalityczne typu D Stak-Paks w celu kontrolowania poziomu wilgotności i tlenu oraz eliminacji nierównomiernych temperatur. Wypełniaj komorę rękawicową ciągłym strumieniem azotu przez 20 do 30 min. Monitoruj poziom tlenu za pomocą czujnika tlenu (C-squared, Inc.) przez 1 h. W razie potrzeby używaj azotu, aby uzyskać i utrzymać warunki beztlenowe.
2. Przygotuj medium Trager U (Trager 1934) i dostosuj pH do 7.0. Przepłucz sterylizowane przez filtr medium w komorze rękawicowej mieszaniną 2.5% wodoru, 5% dwutlenku węgla i 92.5% azotu przez 1 h, aby usunąć pozostałości tlenu.
3. Zasilanizuj wszystkie materiały używane w doświadczeniach, w tym szkiełka przedmiotowe, probówki do mikrocentryfugi, pipety, szkło laboratoryjne itp., używając Sigmacote, aby zapobiec adsorpcji pierwotniaków lub peptydów na powierzchniach (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/ Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Ponieważ pierwotniaki z jelit termitów są organizmami ściśle beztlenowymi, nie mogą być wystawione na działanie tlenu. Dlatego następujące kroki są wykonywane w warunkach beztlenowych w komorze rękawicowej (patrz 1.1). Za pomocą pęsety zanurz całe ciało robotnicy termita w 70% etanolu i delikatnie zakręć przez około 10 s, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe.
5. Wyjmij robotnicę z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na czystej chusteczce Kimwipe przez około 20 s. Użyj sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami, aby przytrzymać odwłok robotnicy, a końcówkę odwłoka chwyć drugą pęsetą, aby delikatnie wyciągnąć jelito w górę lub w dół pod kątem 45 stopni. Jeśli jelito zostanie pociągnięte pod kątem prostym i zbyt dużą siłą, prawdopodobnie pęknie. Umieść 10 jelit w kropli 100 μl medium Trager U na szkiełku przedmiotowym.
6. Przebij jelita parą sterylnych, cienkich sond sekcyjnych, aby uwolnić pierwotniaki, a następnie delikatnie przenieś zawartość jelit pipetą 200 μl do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1 ml zawierającej 900 μl medium Trager U. Po odczekaniu na sedymentację fragmentów ściany jelita (5 s), przenieś 900 μl nadsączu do nowej probówki.
7. Przenieś 10 μl hodowli pierwotniaków na zasilanizowane szkiełko przedmiotowe i sprawdź stan pierwotniaków pod mikroskopem przy powiększeniu 200 X.
8. Przygotuj hodowle kontrolne tlenowych pierwotniaków Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp., Euglena sp. i Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) oraz nocną hodowlę Escherichia coli w pożywkach zalecanych przez dostawcę.

Eksperyment 2: Dodanie liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym do kultur pierwotniaków i bakterii w celu przetestowania wiązania z błonami powierzchniowymi i ścianami komórkowymi

Wcześniej wykorzystaliśmy biblioteki fagowego displayu (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) do zidentyfikowania 19 sekwencji heptapeptydowych wiążących się z pierwotniakami (protokoły dostępne pod adresem http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Ligand o sekwencji peptydowej (ALNLTLH), która wykazywała podobieństwo do domniemanych glikoprotein znanych z błony Trypanosoma brucei, został zsyntetyzowany i sprzężony z fluorescencyjną sondą C-końcową (EDANS, kwas 5-((2-aminoetylo)amino)naftaleno-1-sulfonowy, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej (SSPS) przy użyciu żywicy EDANS NovaTag (EMD Biosciences). W niniejszej pracy wykazujemy, że ligand wiąże się z pierwotniakami wyizolowanymi z jelit termitów oraz innymi wolnożyjącymi pierwotniakami, ale nie wiąże się z bakteriami.

1. Hodować pierwotniaki zgodnie z opisem w Exp. 1. Utrwalić pierwotniaki 10 % formaldehydem w temperaturze 4 °C przez 12 h.
2. Odwirować zawiesinę pierwotniaków (30 x g, 10 min), odlać nadsącz i dwukrotnie przemyć osad zawierający utrwalone pierwotniaki w 1ml pożywki Trager U. Ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki Trager U. W analogiczny sposób utrwalić inne pierwotniaki oraz bakterie E. coli do celów kontrolnych.
3. Inkubować utrwalone mikroorganizmy przez 1-2 h z roztworem syntetycznego liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym EDANS (przygotowanym w wodzie) przy końcowym stężeniu 50 μM. Ligand lepiej rozpuszcza się w wodzie niż w pożywce Trager U.
4. Obserwować mikroorganizmy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 400 X, przy maksimum absorbancji 341 nm i emisji w obszarze niebieskim przy 471 nm.

Eksperyment 3: Testowanie aktywności protozoacydalnej ligandu sprzężonego z peptydem litycznym in vitro (hodowla pierwotniaków)

Koniugat ligandu i peptydu litycznego Hecate (Mutwiri et al. 2000) został wcześniej zsyntetyzowany w Protein Facility na LSU.

1. Zasilanizuj materiały i przygotuj kulturę pierwotniaków z jelit termitów w beztlenowej komorze rękawicowej zgodnie z opisem w Exp. 1.
2. Przygotuj kultury tlenowych mikroorganizmów kontrolnych (np. E. coli oraz wolnożyjącego gatunku pierwotniaka T. pyriformis).
3. W beztlenowym środowisku komory rękawicowej pipetuj 6 alikwotów po 198 μl kultury pierwotniaków do probówek Eppendorf o pojemności 0,5 ml. Do połowy alikwotów kultury pierwotniaków z jelit termitów dodaj 2 μl roztworu peptydu ligand-litycznego o stężeniu 100 μM (stężenie końcowe 1 μM). Do pozostałej połowy alikwotów dodaj 2 μl wody (kontrole).
4. Na blacie laboratoryjnym przygotuj analogiczne alikwoty E. coli oraz T. pyriformis z dodatkiem 1 μM peptydu litycznego, peptydu ligand-litycznego lub wody.
5. Po 1 h przenieś 10 μl każdej kultury pierwotniaków na szkiełka. Porównaj przeżywalność pierwotniaków traktowanych z przeżywalnością kontroli pod mikroskopem przy powiększeniu 200 X.
6. Po 1 h wysiej 100 μl rozcieńczenia ok. 10^-4 kultur E. coli na podłożu BHI i inkubuj w temperaturze 37°C przez noc. Porównaj liczbę jednostek tworzących kolonie na płytkach.

Eksperyment 4: Wstrzykiwanie liganda sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym do jelita tylnego termita

1. Wytnij igły (model GD-1, 1 X 900 mm) przy użyciu wyciągarki do szklanych mikropipet Narishige PC-10 z dwustopniowym poziomem nagrzewania (65 i 48), aby uzyskać rozmiar końcówki wynoszący 20-30 μm. Potwierdź rozmiar końcówki, mierząc ją pod mikroskopem za pomocą mikrometru.
2. Wypełnij jedną igłę za pomocą dołączonej strzykawki ok. 30 μl 50 μM fluorescencyjnie znakowanego liganda zawieszonego w wodzie. Drugą igłę wypełnij wodą do celów kontrolnych. Zamocuj mikropipetę (pojemność 0,5 μl i długość 32 mm, Drummond Scientific Company) w uchwycie mikromanipulatora. Zamocuj igłę w uchwycie systemu wtryskowego drugiego mikromanipulatora. Ustaw początkowe parametry wtrysku na ok. 1 s długości impulsu i ciśnienie wtrysku 10-12 psi. Powoli wprowadź igłę do mikropipety i wtryśnij roztwór za pomocą elektronicznego systemu wtrysku wysokiej prędkości sterowanego pedałem z kontrolą długości impulsu, podłączonego do kontrolowanego przepływu gazu azotowego, co zapewnia powtarzalne wtryskiwanie stałej objętości. Po wtrysku wyjmij mikropipetę i zmierz długość wstrzykniętego roztworu za pomocą suwmiarki Vernier. Oblicz objętość wtrysku na podstawie znanych parametrów mikropipety. Dostosuj ciśnienie azotu i długość impulsu tak, aby podczas jednego wtrysku wydalić 0,3 μl roztworu.
3. Ściśnij koniec odwłoka robotnicy termitów miękkim pincetem, aby usunąć wszelkie odchody znajdujące się w odbytnicy. Unieruchom robotnicę termitów, chłodząc ją na lodzie przez 5 min.
4. Przygotuj odbiorniki do utrzymywania robotnic termitów, odcinając końcówki pipet 100 μl za pomocą ostrza skalpela. Odetnij końcówkę do długości 10-12 mm i stosuj zgodnie z rozmiarem termitów.
5. Zamocuj odbiornik do mikromanipulatora. Umieść robotnicę na płytce Petriego stroną grzbietową do dołu i wciągnij robotnicę głową do odbiornika za pomocą pompy ssącej z azotem, tak aby koniec ciała robotnicy wystawał z odbiornika.
6. Trzymając termita w odbiorniku, ostrożnie wprowadź wypełnioną igłę za pomocą mikromanipulatora do odbytu robotnicy. Wstrzyknij 0,3 μl roztworu (fluorescencyjnie znakowanego liganda lub wody dla kontroli).
7. Umieść robotnice po wstrzyknięciu liganda lub wody w oddzielnych płytkach Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i przechowuj je w temperaturze 26±2 °C przy wilgotności względnej 78% R.H.
8. Wyizoluj jelita z wstrzykniętych termitów i zbierz pierwotniaki po 24 h, zgodnie z opisem w Exp. 1. Utrwal i obserwuj pierwotniaki zgodnie z opisem w Exp. 2.

Eksperyment 5: Badanie aktywności protozoobójczej ligandu sprzężonego z peptydem litycznym in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita)

1. Przeprowadzić silanizację materiałów zgodnie z opisem w Exp. 1.
2. Przygotować 500 μM roztwór peptydu litycznego liganda w wodzie.
3. Postępować zgodnie z krokami od 3.1) do 3.4), aby przygotować szklane igły, odbiorniki oraz robotnice termitów.
4. Stosując metody opisane w punkcie 3.5), wstrzyknąć 0,3 μl roztworu peptydu litycznego liganda (grupa badawcza) lub wody (grupa kontrolna) do jelita tylnego 20 robotnic termitów.
5. Utrzymywać termity przez 24 h, wypreparować jelita z kilku robotnic i obserwować zawartość jelit pod mikroskopem zgodnie z opisem w punktach 3.6) i 3.7).
6. Po potwierdzeniu obumarcia pierwotniaków w jelicie termitów, pozostałe osobniki z grupy badawczej i kontrolnej przenieść do płytek Petriego z wilgotnym papierem filtracyjnym i codziennie monitorować śmiertelność.

Reprezentatywne wyniki:

Doświadczenie 1: Zazwyczaj, przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury, jelito przednie, środkowe i tylne są pobierane w jednym kawałku (Rysunek 1a). Pierwotniaki występują w dużym zagęszczeniu w beztlenowych częściach jelita tylnego i mogą zostać uwolnione poprzez przebicie jelita tylnego pęsetą (Rysunek 1b).&2). Największym gatunkiem pierwotniaków w jelicie tajwańskiej termity podziemnej jest wrzecionowaty P. grassii, która wynosi 200-300 μm długi i 150 μm szerokie i widoczne gołym okiem. Drugim co do wielkości gatunkiem jest gruszkowaty H. hartmanni (50-140 μm długi i 30-80 μm szeroki). Najmniejszym gatunkiem jest stożkowaty S. leidyi (15-50 μm długi i 8-30 μm szeroki; Lai i wsp. 1983). Gatunki pierwotniaków przedstawiono na rysunku 2.

W optymalnych warunkach hodowli trzy gatunki pierwotniaków wyizolowane z jelita tajwańskich termitów podziemnych pozostaną żywe i zdrowe przez co najmniej 72 h w anaerobowym medium Trager U (Rysunek 3a). Jednakże, jeśli warunki hodowli nie są optymalne, pierwotniaki szybko giną. W przypadku obecności resztek tlenu w medium ruch pierwotniaków natychmiast ustanie. Jeśli ciśnienie osmotyczne jest zbyt wysokie lub integralność błony zostaje naruszona, błona powierzchniowa pierwotniaków wybrzuszy się, a komórki pękną (Rysunek 3b). Jeśli ciśnienie osmotyczne jest zbyt niskie lub błony są uszkodzone, pierwotniaki zmarszczą się i skurczą (Rysunek 3c).

Eksperyment 2: Potwierdziliśmy, że ligand sprzężony z sondą fluorescencyjną wiąże się z wykrywalnym zagęszczeniem ze wszystkimi trzema gatunkami pierwotniaków z jelita tylnego tajwańskich termitów podziemnych. Wiązanie ligandu zachodzi na całej powierzchni komórki (Rysunek 4). Miejsca wiązania są skoncentrowane w przedniej części pierwotniaków na aksonstylu (warstwie mikrotubul) oraz jądrze w P. grassii.

Zaobserwowaliśmy miejscową autofluorescencję cząsteczek drewna pochłoniętych przez pierwotniaki. Autofluorescencję zazwyczaj łatwo odróżnić od specyficznego wiązania liganda, ponieważ nie występuje ona na powierzchni, w aksostylu ani w jądrze (Rysunek 4).

Wykryliśmy również fluorescencję we wszystkich badanych gatunkach wolnożyjących pierwotniaków tlenowych (Rysunek 5), co sugeruje, że ligand wiąże się ze strukturami typowymi dla pierwotniaków. Jednakże nie zaobserwowano wiązania ligandu w przypadku E. coli.

Eksperyment 3: 1 μM peptydu litycznego z ligandem zabił wszystkie trzy gatunki pierwotniaków z jelit robotnic termitów podziemnych z Tajwanu oraz wolnożyjące T. pyriformis in vitro w czasie krótszym niż 10 min, podczas gdy w grupie kontrolnej przeżyły. Rycina 6 przedstawia postępującą utratę integralności błony pierwotniaków z jelit termitów poddanych działaniu peptydu litycznego z ligandem. Błony wybrzuszają się i pękają, a pierwotniaki kurczą się i giną. Nie zaobserwowano różnic w liczbie kolonii E. coli pomiędzy grupami traktowanymi peptydem litycznym z ligandem a wodą. Jednak peptyd lityczny bez ligandu znacznie zmniejszył liczbę kolonii E. coli (Rycina 7). Sugeruje to, że przyłączenie ligandu w pewnym stopniu chroni mikroorganizmy niebędące celem przed lizą.

Eksperyment 4: Po wstrzyknięciu 0,3 μl 50 μM znakowanego fluorescencyjnie ligandu do jelita tylnego robotnic termitów, wiązanie z P. grassii, S. leidyi oraz H. hartmanni potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w sposób analogiczny do Eksperymentu 2 (Rycina 4). Tkanka jelita termitów nie wykazywała fluorescencji.

Eksperyment 5: Iniekcja 0,3 μl 500 μM peptydu litycznego z ligandem zabiła wszystkie trzy gatunki pierwotniaków w jelitach tajwańskich termitów podziemnych w ciągu 24 h. Termity padły w ciągu 10 dni po utracie swoich symbiotycznych pierwotniaków. Wcześniej Husseneder i Collier (2009) wstrzyknęli taką samą koncentrację peptydu litycznego do jelit termitów. Bez przyłączonego ligandu czas do śmierci pierwotniaków w jelitach (72 h) oraz śmierci termitów (sześć tygodni) był dłuższy. Sugeruje to, że ligand zwiększa skuteczność protozoabójczą peptydów litycznych, najprawdopodobniej poprzez wiązanie peptydów litycznych z pierwotniakami.

Rysunek 1. a: Jelito termita tajwańskiego na szkiełku, przedstawiające główne odcinki układu pokarmowego (przedjelito, jelito środkowe, jelito końcowe); b 1& 2: Przebicie jelita końcowego pęsetą w celu uwolnienia zawartości jelita zawierającej pierwotniaki.

Rysunek 2. Trzy gatunki pierwotniaków biczowców znalezione w jelicie tylnym tajwanzkiej termity podziemnej: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni oraz c) Spirotrichonympha leidyi.

Rysunek 3. Pierwotniaki w hodowli, a) Zdrowe pierwotniaki, b) Pierwotniaki z wybrzuszonymi błonami, c) Skurczone pierwotniaki.

Rysunek 4. Potwierdzenie wiązania liganda sprzężonego z sondą fluorescencyjną z pierwotniakami jelitowymi termitów (od góry do dołu: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), traktowanych ligandem znakowanym fluorescencyjnie oraz kontrole nietraktowane (wykazujące autofluorescencję).

Rysunek 5. Wiązanie ligandu do wolno żyjących pierwotniaków tlenowych, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena oraz d) Paramecium.

Rysunek 6. Traktowanie pierwotniaków a) wodą (kontrola) i b) 1 μM litycznego peptyduliganda.

Rycina 7. Kolonie E. coli na płytkach (rozcieńczenie 10^-4): a) traktowane wodą (kontrola), b) traktowane 1 μM peptydem litycznym z ligandem, c) traktowane 1 μM peptydem litycznym.

Dyskusja

Peptydy ligand-lityczne zostały z sukcesem wykorzystane do skutecznego celowania i niszczenia komórek nowotworowych (Hansel i Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). W oparciu o tę koncepcję opracowaliśmy ligand w formie heptapeptydu, który wiąże się z powierzchnią pierwotniaków w jelitach tajwańskich termitów podziemnych, a następnie połączyliśmy go z peptydem litycznym w celu zniszczenia tych obligatoryjnych, trawiących celulozę symbiontów w jelitach termitów, aby zrealizować kontrolę populacji tych owadów (Husse...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Beztlenowa komora rękawicowa	Coy Laboratories, Inc.	Wykonana na zamówienie
Kontroler środowiskowy Intellus	Percival Scientific, Inc.	I36NL
Wytciągacz szklanych mikropipet PC-10	Narishige International	PC-10
Igły szklane (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Mikromanipulatory Leitz	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Mikroiniekto	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Mikrokapsułki	Drummond Scientific	1-000-0005
System obrazowania fluorescencyjnego LEICA	Leica Microsystems	DMRxA2
Stereomikroskop LEICA	Leica Microsystems	MZ16
Mikroskop LEICA	Leica Microsystems	DMLB
Stereomikroskop Olympus	Olympus Corporation	SZ61