Artykuł metodologiczny

Strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem

15.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2192

⸱

2 września 2010

 ,  , 
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Dążymy do zdefiniowania immunologicznego sygnalizowania neuronalnego odpowiedzialnego za prekondycjonowanie zimnem, aby zidentyfikować nowe cele dla rozwoju terapii chroniących mózg przed wystąpieniem urazu. Przedstawiamy strategie dla takich badań, które wymagają systemów biologicznych, manipulacji eksperymentalnych oraz możliwości technicznych o wysokiej czułości i powtarzalności.

Streszczenie

Uszkodzenia neurologiczne są częstą przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanych z narkozą ogólną i powiązanymi z nią procedurami chirurgicznymi, co mogłoby zostać ograniczone poprzez opracowanie skutecznych, łatwych w podaniu i bezpiecznych metod prekondycjonowania. Dążymy do zdefiniowania szlaków sygnalizacji immunologicznej w układzie nerwowym odpowiedzialnych za prekondycjonowanie zimnem, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne służące ochronie mózgu przed wystąpieniem urazu. Zmiany w niskopoziomowej sygnalizacji mediatorów prozapalnych w czasie są niezbędne dla neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem. Sygnalizacja ta jest zgodna z podstawowymi zasadami fizjologicznej hormezy kondycjonowania, która wymaga, aby bodźce drażniące osiągnęły określoną wartość progową, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającego czasu na adaptację do tych bodźców, aby efekt ochronny stał się widoczny.

W związku z tym, opisanie szlaków sygnalizacji immunologicznej zaangażowanej w neuroprotekcję indukowaną prekondycjonowaniem zimnem wymaga, aby systemy biologiczne, manipulacje eksperymentalne oraz możliwości techniczne były wysoce powtarzalne i czułe. Nasze podejście polega na wykorzystaniu hodowli skrawków hipokampa jako modelu in vitro, który ściśle odzwierciedla ich odpowiedniki in vivo z wielosynaptycznymi sieciami neuronalnymi pod wpływem dojrzałej i spoczynkowej makroglei / mikroglei. Ten stan gleju jest szczególnie istotny w przypadku mikroglei, ponieważ stanowi ona główne źródło cytokin, które działają w zakresie femtomolarnym. Ponadto hodowle skrawków mogą być utrzymywane in vitro przez kilka tygodni, co jest wystarczającym czasem na wywołanie bodźców aktywujących i ocenę odpowiedzi adaptacyjnych. Wreszcie, warunki środowiskowe mogą być precyzyjnie kontrolowane przy użyciu hodowli skrawków, tak aby sygnalizację cytokinową prekondycjonowania zimnem można było zmierzyć, naśladować i modulować w celu przeanalizowania krytycznych węzłów sygnalizacyjnych. Analizy systemu sygnalizacji cytokinowej wymagają zastosowania czułych i powtarzalnych technik multipleksowych. Wykorzystujemy ilościową PCR dla TNF-α w celu przesiewowej oceny aktywacji mikroglei, a następnie screening za pomocą macierzy ilościowej qPCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić zmiany cytokinowe w całej tkance. Ta druga metoda jest najczulszym i najbardziej powtarzalnym sposobem jednoczesnego pomiaru zmian w sygnalizacji wielu systemów cytokinowych. Istotne zmiany są potwierdzane za pomocą ukierunkowanej qPCR, a następnie detekcji białek. Badamy zmiany białek cytokinowych w tkankach, stosując multipleksowe analizy cytometryczne z użyciem mikrosfer w technologii Luminex. Komórkową produkcję cytokin określa się za pomocą podwójnej immunohistochemii. Podsumowując, ta metoda przygotowania tkanki mózgowej i sposób jej wykorzystania, w połączeniu z sugerowanymi strategiami badawczymi, mogą stanowić optymalne podejście do identyfikacji potencjalnych celów dla opracowania nowych terapii, które mogłyby naśladować korzyści płynące z prekondycjonowania zimnem.

Protokół

Techniki sterylne i aseptyczne są kluczowe dla przygotowania, utrzymania i stosowania kultur plastrów tkankowych przez dłuższe okresy. Ponadto uzasadnienie dla stosowania kultur plastrów dopiero po 18 dniach in vitro opiera się na dowodach wskazujących, że przekaźnictwo synaptyczne pobudzające i hamujące osiąga wtedy najwyższy stopień dojrzałości, a glej (astrocyty i mikroglej) staje się spoczywający i spójny ze swoimi odpowiednikami in vivo (Rysunek 1).

1. Przygotowanie i utrzymanie kultur plastrów hipokampa

  1. W dniu hodowli zrównoważyć sterylne wkłady w 1,1 mL pożywki wzrostowej składającej się z 50 mL Basal Medium Eagle, 25 mL Earle's Balanced Salt Solution, 23 mL surowicy końskiej, 0,5 mL Glutamax (stok 200 mM), 0,1 mL gentamycyny (stok 10 mg/mL), 0,4 mL Fungizone (250 μg/mL), 1,45 mL D-glukozy (45%; łącznie 42 mM).
  2. Przechowywać płytki sześciodołkowe w inkubatorze w temperaturze 36°C, przy 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności.
  3. W celu zapewnienia maksymalnej sterylności hodowlę najlepiej prowadzić w pomieszczeniu do hodowli z nadciśnieniem i filtrami HEPA, w którym powietrze jest dodatkowo oczyszczane za pomocą autonomicznych wentylatorów z lampami ultrafioletowymi, nosząc czysty fartuch laboratoryjny i sterylne rękawiczki naciągnięte na rękawy fartucha.
  4. Przygotować hodowle plastrów w laminarnym dygestorium klasy BSL-1, zawierającym wszystkie niezbędne materiały (tj. przecinarkę tkankową McIlwaina, odpowiednie wkłady teflonowe, ostrze do krojenia, chłodzącą płytkę sekcyjną (3-4°C), narzędzia chirurgiczne oraz szalki Petriego do sekcji), korzystając ze stereomikroskopu Wild (M8).
  5. Pozostawić płytkę chłodzącą (zasilaną z pobliskiej łaźni wodnej) do osiągnięcia temperatury 3-4°C przez co najmniej 30 min, jednocześnie naświetlając materiały sekcyjne światłem ultrafioletowym, aby dodatkowo zapewnić sterylność obszaru sekcji i narzędzi.
    1. Dygestorium z przepływem laminarnym jest okresowo testowane za pomocą miernika światła ultrafioletowego krótkofalowego, aby upewnić się, że światło UV ma wystarczającą moc na poziomie blatu.
  6. Użyć szczurząt (P8-P9 i ok. 23 g/szt. z miotów zredukowanych do 10 osobników przy urodzeniu), znieczulonych 100% dwutlenkiem węgla w klatce dla małych zwierząt na aseptycznym blacie za dygestorium i oczyszczonych poprzez zanurzenie w 100% etanolu wewnątrz dygestorium, w którym wykonuje się wszystkie kolejne kroki.
  7. Odciąć głowy szczurząt w jednej połowie szalki Petriego o średnicy 100 mm i umieścić głowę w drugiej połowie, używając nowej szalki dla każdego szczurzęcia.
  8. Wypreparować mózg i umieścić go w dolnej połowie szalki Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 10 mL sterylnego, chłodnego (3-4°C) Gey's Balanced Salt Solution uzupełnionego D-glukozą do stężenia 6,5 mg/mL (tj. 7,5 mL 45% d-glukozy na 500 mL butelkę Gey's).
  9. Wypreparować hipokamp z każdej półkuli i umieścić je na dysku teflonowym do przecinarki McIlwaina. Odsunąć pożywkę od tkanki mózgowej za pomocą szpatułki z przysłoną, aby zapobiec przyleganiu wyciętych sekcji mózgu do ostrza tnącego.
  10. Wyciąć sekcje hipokampów prostopadle do ich długiej osi za pomocą przecinarki McIlwaina, ustawiając grubość sekcji na 350-400 μm.
  11. Szybko wypłukać świeżo wycięte plastry z wkładów teflonowych do górnej połowy szalki Petriego o średnicy 60 mm zawierającej chłodny (3-4°C) Gey's Balanced Salt Solution z 6,5 mg/mL D-glukozy, używając pipetora 1 mL.
  12. Obejrzeć plastry pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że zakręt zębaty i warstwa komórek piramidowych są nienaruszone.
  13. Ostrożnie umieścić największe plastry na wkładzie (trzy na wkład i 12 plastrów/szczurzę) i utrzymywać w normalnych warunkach inkubacji w inkubatorze czyszczonym co sześć miesięcy i kalibrowanym co trzy miesiące za pomocą podczerwiennego analizatora dwutlenku węgla oraz termometru z dokładnością do jednej cyfry po przecinku.
  14. Wymieniać pożywkę wzrostową w naczyniach hodowlanych co 3-4 dni in vitro, korzystając z dygestorium BSL-2 i technik sterylnych.
  15. Po 7 dniach in vitro zastąpić pożywkę 1,1 mL pożywki bezzsurowiczej (SFM) składającej się z 97 mL Neurobasal, 2 mL B27, 0,5 mL Glutamax (200 mM), 0,1 mL kwasu askorbinowego (0,5 M) i 0,68 mL D-glukozy (45%; łącznie 42 mM).

2. Wstępna ocena żywotności kultur plastrów

  1. Przygotuj alikwoty roztworu zapasu Sytox Green (10 μL) i przechowuj w temperaturze -20°C.
  2. Rozcieńcz roztwór zapasu Sytox do stężenia roboczego 500 nM w bezz écoulkowym medium wzrostowym (tj. 10 μL w 100 mL medium). Medium z Sytox przechowuj w temperaturze 4°C i wykorzystaj w ciągu jednego tygodnia.
  3. Nalej 1,1 mL medium z Sytox do każdego dołka w 6-dołkowych naczyniach hodowlanych i ogrzej do 36°C przy 5% dwutlenku węgla przez odpowiedni czas (tj. do momentu zniknięcia kondensatu na naczyniach hodowlanych).
  4. W międzyczasie pozwól lampie ultrafioletowej (tj. fluorescencyjnemu źródłu światła z filtrem FITC) zasilanej przez stabilizator napięcia w celu zapewnienia jednorodnej intensywności światła rozgrzać się przez co najmniej 20 min.
  5. Umieść hodowle plastrów (18 dni in vitro) w medium z Sytox na 10 min, a następnie przenieś je z powrotem do SFM, aby wykluczyć nieodwracalne uszkodzenia warstwy piramidalnej CA1.
  6. Obserwuj hodowle na aseptycznej powierzchni mikroskopu odwróconego przy 5-krotnym powiększeniu.
  7. Zakwalifikuj do dalszych badań hodowle zawierające mniej niż 30 komórek wybarwionych Sytox w obszarze CA1.

3. Kondycjonowanie zimnem

  1. Do płytek hodowlanych z 6 dołkami wlać 1,1 mL SFM. Schłodzone medium (np. 30°C) należy pozostawić w inkubatorze (5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności) na co najmniej 20 min w celu wyrównania parametrów przed użyciem. Brak kondensatu na płytkach hodowlanych świadczy o upływie wystarczającego czasu na equilibrację.
  2. Przenieść inserty z kulturami plastrów do tacy z schłodzonym medium (1,1 mL/dołek) utrzymywanej w temperaturze 30°C i inkubować przez 90 min, stosując technikę sterylną w dygestorium BSL-2.
  3. Przenieść kultury plastrów z powrotem do standardowego SFM w normalnych warunkach inkubacji na 24 godziny, ponownie stosując technikę sterylną w dygestorium BSL-2.

4. Uszkodzenie ekscytotoksyczne

  1. Rozpocznij eksperyment na hodowlach plastrów od wstępnej selekcji poprzez inkubację w medium z Sytox przez 20 min.
    1. Nabyj obrazy poszczególnych plastrów, utrzymując ich orientację analogiczną do tej stosowanej podczas wstępnej selekcji (obrazy tła). W tym celu należy zaznaczyć markerem jeden punkt po lewej stronie i dwa punkty po prawej stronie, odpowiednio na godzinie „10” i „dwóch” na każdym wkładzie. Zabieg ten ułatwia stosowanie tego samego kształtu obszaru zainteresowania dla każdego zestawu obrazów z hodowli.
  2. Jednocześnie włącz źródło światła ultrafioletowego (pod regulowanym zasilaczem) oraz kamerę CCD na co najmniej 20 min, aby osiągnęły temperaturę roboczą.
  3. Następnie skalibruj kamerę CCD za pomocą wzorca fluoresceiny.
    1. „Wyczyść” kamerę CCD, eksponując ją na światło przez 50 cykli, chyba że używana jest kamera CCD z automatyczną kalibracją. Stworzyliśmy program w oprogramowaniu MetaMorph do czyszczenia kamery Cool Snap używanej do ilościowej oceny uszkodzeń.
    2. Dodaj 10 μL fluoresceiny do 90 mL PBS (bufor fosforanowy 10 mM, 150 mM NaCl przy pH 7.3) i wymieszaj w wirówce typu vortex.
    3. Pipetuj 10 μL mieszaniny fluoresceiny na komorę licznikową (hemacytometr) o głębokości 100 μm.
    4. Ustaw pełną intensywność obrazu na 1000/4096.
  4. Wykonaj obrazy tła hodowli plastrów, aby zweryfikować, czy wstępne schładzanie nie spowodowało uszkodzeń (tzn. odrzuć hodowle z intensywnością obszaru zainteresowania CA1 ≥ 250).
  5. Przygotuj tacki z medium zawierającym NMDA.
    1. Przygotowuj roztwór stokowy NMDA 10 mM co najmniej raz w tygodniu.
    2. W celu wywołania uszkodzeń ekscytotoksycznych rozcieńcz NMDA do stężenia 20–50 μM w SFM i inkubuj w normalnych warunkach przez co najmniej 20 min.
  6. Używając dygestorium klasy BSL-2 i technik sterylnych, umieść wkłady w medium z NMDA na 60 min w normalnych warunkach inkubacji.
  7. Wypłucz NMDA z wkładów, zanurzając każdy wkład trzy razy w trzech oddzielnych szalkach 60 mm, z których każda zawiera 10 mL medium Neurobasal podgrzanego do 36°C. Nie używaj więcej niż trzech wkładów dla każdego zestawu trzech szalek płuczących 60 mm.
  8. Przywróć hodowle do normalnych warunków inkubacji.
  9. Wykonaj obrazy uszkodzeń 24 godziny po ekspozycji na NMDA.
    1. Skalibruj kamerę za pomocą wzorca fluoresceiny zgodnie z powyższym opisem.
    2. Umieść hodowle w medium z Sytox na 20 min.
  10. Ilościowa ocena uszkodzeń:
    1. Używając oprogramowania MetaMorph, wyznacz obszar AOI wokół regionu CA1.
    2. Zmierz intensywność wybranego regionu dla obrazu „uszkodzeń” (injury).
    3. Skopiuj i wklej AOI z obrazu „uszkodzeń” na obraz „tła” (background).
    4. Wprowadź wartości z obrazów „uszkodzeń” i „tła” do programu Excel.
    5. Oblicz wartość „licznik minus tło” dla hodowli kontrolnych i wstępnie schłodzonych.
    6. Używając oprogramowania statystycznego (np. SigmaStat), przeprowadź odpowiednie testy statystyczne, aby porównać uszkodzenia w grupach eksperymentalnych z grupą kontrolną, która zawsze powinna być uwzględniona w każdej serii eksperymentalnej.
    7. Uwaga: Jeśli poziom uszkodzeń na obrazach wykonanych jeden dzień po urazie jest niski, przedłuż eksperyment do dwóch–trzech dni. Efekt ochronny w hodowlach może być zamaskowany z powodu braku podatności na uszkodzenia (Rysunek 2).
    8. Uwaga: Kwestia „ochrony” skłoniła nas do przejścia na pomiar poziomów uszkodzeń, a nie ich stosunków, we wszystkich porównaniach (Rysunek 3).

5. Współleczenie stosowane wraz z prekondycjonowaniem zimnem

Ważną zaletą hodowli plastrów jest możliwość precyzyjnej kontroli warunków środowiskowych. Oznacza to, że sygnalizacja cytokinowa wynikająca z prekondycjonowania zimnem może być mierzona, naśladowana i modulowana w celu przeanalizowania kluczowych aspektów węzłowych.

  1. Białka rekombinowane (np. agoniści) oraz białka neutralizujące (np. przeciwciała lub receptory rozpuszczalne) mogą być stosowane odpowiednio do naśladowania i modulowania sygnalizacji cytokinowej.
  2. Zasadniczo białka te są rekonstytuowane i przechowywane w formie aliquotów w temperaturze -20°C do wykorzystania w ciągu sześciu miesięcy w celu zapewnienia odpowiedniej bioaktywności.
  3. W niniejszym opracowaniu opisujemy przykładowe zastosowanie zniesienia sygnalizacji TNF-α przy użyciu rozpuszczalnego receptora 1 TNF (sTNFR1).
    1. Zrekonstytuować sTNFR1 w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej w PBS do stężenia zapasu wynoszącego 50 μg/mL, podzielić na aliquoty po 20-50 μL ilości i przechowywać w temperaturze -20°C.
    2. Przed użyciem rozcieńczyć sTNFR1 do stężenia 200 ng/mL w podgrzanej do 36°C następnie należy umieścić hodowle plastrów w pożywce sTNFR1 na 20 min przed wstępnym chłodzeniem.
      1. Uwaga: Aby zmniejszyć wariancję, najlepiej rozcieńczyć sTNFR1 w stężeniu 200 ng/ml w dużej objętości pożywki wzrostowej (tj. rozcieńczenie 1:250 z 50 μg/mL roztwór sTNFR1 w 10 ml pożywki wzrostowej wymaga 40 μL sTNFR1) w porównaniu do bezpośredniego dodawania sTNFR1 do każdego dołka w płytce (4.4 μL na 1,1 ml pożywki).
    3. Rozcieńczyć sTNFR1 do stężenia 200 ng/mL w pożywce i nanieść 1,1 ml do każdego dołka wkładki. Pozostawić pożywkę do wyrównania temperatury z 30°C przez co najmniej 20 min przed poddaniem kultur skrawków prekondycjonowaniu zimnem przez 90 min, zgodnie z powyższym opisem.
    4. Umieść hodowle plastrów z powrotem w 36°C w obecności sTNFR1 w medium.
    5. Po 24 godzinach należy poddać kultury działaniu medium Sytox przez 20 min, zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie zebrać obrazy tła w celu zweryfikowania, czy prekondycjonowanie zimnem nie uszkodziło kultur.
  4. Ilościowo określ dane zgodnie z powyższym opisem.
  5. Wymieniać medium z dodatkami co 3–4 dni in vitro.

6. Natychmiastowe i opóźnione uszkodzenie ekscytotoksyczne po prekondycjonowaniu zimnem

  1. Natychmiastowe uszkodzenie z prekondycjonowaniem zimnem.
    1. Przeprowadzić prekondycjonowanie zimnem zgodnie z powyższym opisem.
      1. Po prekondycjonowaniu zimnem przywrócić hodowle do normalnej inkubacji na 20 min.
      2. Następnie poddać hodowle działaniu 20-50 μM NMDA w celu wywołania uszkodzenia przez jedną godzinę.
      3. Przepłukać hodowle trzy razy zgodnie z powyższym opisem i przywrócić do normalnej inkubacji.
      4. Po 24 godzinach wykonać zdjęcia uszkodzeń zgodnie z powyższym opisem.
  2. Opóźnione efekty prekondycjonowania zimnem.
    1. Przeprowadzić prekondycjonowanie zimnem zgodnie z powyższym opisem.
    2. Poddać hodowle działaniu NMDA w celu wywołania uszkodzenia 24 godziny później zgodnie z powyższym opisem.
    3. Kontynuować pozyskiwanie obrazów uszkodzeń do trzech dni po początkowym prekondycjonowaniu zimnem w celu monitorowania ochrony.

7. Izolacja RNA

Poniższe procedury analizy ekspresji genów są dostosowane do pojedynczej hodowli plastrów.

  1. Przenieś kultury plastrów z pożywki wzrostowej i normalnej inkubacji do 3 mL RNAlater w 6-dołkowych naczyniach hodowlanych w celu stabilizacji RNA. Przechowuj w temperaturze 4°C do trzech dni do czasu przetworzenia zgodnie z poniższym opisem.
  2. Delikatnie podnieś kulturę plastra z wkładki za pomocą pędzla z cienkim włosiem i umieść w 1 mL zimnego (4°C) PBS w 1,5 mL probówce do mikrocentryfugi (wolnej od DNazy, RNazy i DNA).
  3. Wiruj próbki przez 30 s i usuń nadsącz PBS.
  4. Przechowuj próbki w temperaturze -80°C.
  5. Aby wyizolować RNA z kultur plastrów (~250 ng/ea.), rozmroź próbki na lodzie.
  6. Wyizoluj RNA za pomocą zestawu Qiagen MicroRNeasy zgodnie z poniższymi procedurami, które zostały szczegółowo opisane i dostosowane z podręcznika RNeasy Micro (Qiagen).
    1. Wlej 350 μL Buforu RLT (zawierającego 10 μL β-merkaptoetanolu na mL) do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej jedną kulturę plastra.
    2. Zhomogenizuj próbki, mieszając je na wirówce typu vortex przez 30 s. W razie potrzeby (np. gdy osad tkankowy jest nadal widoczny) rozetrzyj tkankę za pomocą jednorazowego tłuczka, aż zostanie całkowicie zhomogenizowana w Buforze RLT.
    3. Dodaj 350 μL 70% etanolu do mieszaniny lizatu i wymieszaj pipetując.
    4. Przenieś homogenat do kolumny wirowej i umieść ją w probówce zbiorczej (zarówno kolumna wirowa, jak i probówka zbiorcza są dostarczane przez firmę Qiagen).
    5. Wiruj próbkę przez 15 s z maksymalną prędkością. Zachowaj kolumnę.
    6. Przemyj kolumnę wirową, dodając 350 μL Buforu RW1, a następnie wiruj przez 15 s z maksymalną prędkością. Usuń bufor.
    7. Rozcieńcz 10 μL stoku DNazy I w 70 μL Buforu RDD, aby uzyskać objętość całkowitą 80 μL. Wymieszaj delikatnie pipetując, nie używaj wirówki typu vortex. Przygotuj 80 μL rozcieńczonego stoku DNazy na każdą próbkę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    8. Dodaj 350 μL Buforu RW1 do kolumny wirowej z próbką i wiruj przez 15 s. Usuń probówkę zbiorczą.
    9. Używając nowej probówki zbiorczej, dodaj 500 μL Buforu RPE do próbki, wiruj przez 15 s i usuń bufor.
    10. Dodaj 500 μL 80% etanolu na próbkę i wiruj przez 2 min. Usuń probówkę zbiorczą.
    11. Osusz kolumny wirowe, wirując przez 5 min z maksymalną prędkością przy otwartych nakrętkach probówek, usuń probówki zbiorcze i przenieś kolumnę wirową do 1,5 mL probówki zbiorczej dostarczonej w zestawie.
    12. Aby zebrać wyizolowane RNA, nanieś 14 μL wody wolnej od RNaz na środek membrany kolumny wirowej. Wiruj przez jedną minutę i zbierz ciecz.
    13. Dodaj 2 μL RNasin (rozcieńczonego do 1 U/ μL w buforze TE) i przechowuj w temperaturze -80°C. Bufor TE składa się z 10 mM Tris (tris[hydroksymetylo]aminometan) i 1 mM EDTA (dwusodowa sól hydratu kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przy pH 8,0.

8. Oznaczanie ilości RNA

  1. Uwaga: RNasin nie zakłóca przebiegu analizy RiboGreen.
  2. Rozcieńczyć RiboGreen 1:200 w buforze TE wolnym od RNaz w następujący sposób:
    1. TE (mL): 1; Ribogreen (μL): 5;
    2. TE (mL): 4; Ribogreen (μL): 20;
    3. TE (mL): 6; Ribogreen (μL): 30.
  3. Standardy RNA przygotowuje się w następujący sposób:
    1. Jako standard RNA stosuje się tRNA drożdży. tRNA jest przechowywana (-20°C) w stężeniu 1 mg/mL w buforze TE.
    2. Roztwór stokowy 1 mg/mL rozcieńczyć 1:100 w buforze TE, używając probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (wolnych od DNaz, RNaz i DNA), aby uzyskać standard roboczy o stężeniu 1 μg/mL.
    3. Krzywą wzorcową przygotować bezpośrednio na fluorescencyjnej płytce do analizy z 96 dołkami, dodając najpierw rozcieńczalnik w postaci buforu TE, a następnie odpowiednią ilość standardu 1 μg/mL do buforu TE znajdującego się już w dołkach płytki, zgodnie z dołączoną tabelą. Przygotować dołki powtórzone dla każdego standardu w następujący sposób:
      1. Obj. standardu (μL): 100; Obj. TE (μL): 0; RNA w dołku (ng): 100;
      2. Obj. standardu (μL): 80; Obj. TE (μL): 20; RNA w dołku (ng): 80;
      3. Obj. standardu (μL): 60; Obj. TE (μL): 40; RNA w dołku (ng): 60;
      4. Obj. standardu (μL): 40; Obj. TE (μL): 60; RNA w dołku (ng): 40;
      5. Obj. standardu (μL): 20; Obj. TE (μL): 80; RNA w dołku (ng): 20;
      6. Obj. standardu (μL): 0; Obj. TE (μL): 0; RNA w dołku (ng): 0.
  4. Analizę przeprowadza się w następujący sposób:
    1. Do każdego z dołków na próbki na płytce 96-dołkowej dodać 99 μL buforu TE. Najbardziej efektywnym sposobem jest użycie pipety wielokanałowej.
    2. Do dołków z próbkami doświadczalnymi dodać 1 μL RNA.
    3. Do każdego dołka dodać 100 μL rozcieńczonego RiboGreen za pomocą pipety wielokanałowej i wymieszać, wykonując jeden lub dwa ruchy pipetowania.
    4. Odczytać wartości z płytki za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek przy wzbudzeniu 480 nm i emisji 520 nm.
    5. Wykreślić krzywą wzorcową w programie Microsoft Excel, wykorzystując zmierzone intensywności fluorescencji standardów RNA.
    6. Obliczyć stężenia RNA w próbkach, korzystając z równania liniowego otrzymanego z krzywej wzorcowej.

9. Ilościowy PCR z użyciem SYBR Green

  1. Procedury PCR najlepiej przeprowadzać w czystej strefie zarezerwowanej specjalnie do pracy z RNA (Rysunek 4).
    1. Przed użyciem należy odkażać obszar i powiązany sprzęt laboratoryjny z potencjalnego zanieczyszczenia DNA i aktywności RNaz za pomocą światła ultrafioletowego, 10% wybielacza lub preparatu RNase Away.
    2. Przez cały czas trwania wszystkich procedur należy nosić rękawiczki.
    3. We wszystkich procedurach należy stosować wodę wolną od RNaz dostarczoną w zestawie. Nie należy używać wody traktowanej DEPC (węglanem diethylopirokarbonianem).
    4. Wszystkie probówki związane z PCR należy zamykać natychmiast po użyciu, aby ograniczyć zanieczyszczenie aerozolem obcego DNA.
  2. Należy opracować i scharakteryzować startery dla docelowych mRNA. Metody te są szczegółowo opisane w Materiałach uzupełniających do pracy Hulse et al., Journal of Neuroscience, 2008 13.
  3. cDNA jest otrzymywane z 30-200 ng całkowitego RNA poprzez odwrotną transkrypcję przy użyciu iScript.
    1. Wybór początkowej ilości RNA jest podyktowany całkowitą dostępną ilością RNA, z celem przeprowadzenia analizy RT-PCR na części próbki (tj. 10%-20% całości).
    2. Pozostała, większa część RNA jest przechowywana do przyszłych analiz.
    3. Zestaw iScript wykorzystuje mieszaninę losowych heksamerów i starterów oligo-dT oraz zmodyfikowaną odwrotną transkryptazę MMLV w całkowitej objętości 20 μL.
    4. Odwrotna transkrypcja przebiega w temperaturze 25°C przez 30 min, a następnie w 42°C przez 50 min, po czym odwrotna transkryptaza jest denaturowana w 85°C przez 5 min.
    5. cDNA należy rozcieńczyć w buforze TE do końcowego stężenia 0,4 ng/μL w stosunku do początkowej ilości RNA.
  4. Do amplifikacji cDNA stosuje się strategię opartą na PCR z SYBR Green.
    1. Reakcje PCR są monitorowane w czasie rzeczywistym poprzez śledzenie inkorporacji SYBR Green.
    2. Reakcje o objętości 50 μL zawierają 3 mM MgCl2, 200 μM dNTP, po 15 pmol startera forward i reverse, 1 μM fluoresceiny, 1x barwnika SYBR Green, 10 μL (4 ng) cDNA z hodowli plastrów oraz 1,25 U polimerazy Platinum Taq w buforze reakcyjnym składającym się z 50 mM KCl i 10 mM Tris, pH 8,3.
    3. PCR jest przeprowadzany przy użyciu termocyklera iCycler, który umożliwia zbieranie danych w czasie rzeczywistym.
    4. Parametry cyklu obejmują 15 s denaturacji (95°C), a następnie 30 s przyłączania/elongacji (60°C), powtarzane 45 razy.
    5. Pomiary optyczne są dokonywane podczas etapu przyłączania/elongacji, a wartości Ct są wyznaczane przy użyciu oprogramowania systemu iCycler.
    6. cDNA dla docelowych cytokin oraz β-aktyny są wykorzystywane do konstrukcji krzywych wzorcowych.
      1. Liczba kopii jest wyznaczana na podstawie masy cząsteczkowej i masy cDNA plazmidowego.
      2. Konstruowane są krzywe wzorcowe liczby kopii/masy, które są uwzględniane w każdym teście.
      3. Wartości Ct dla każdego rozcieńczenia cDNA są wykorzystywane do wyznaczenia krzywej liczby kopii względem Ct.
    7. Poziomy liczby kopii cytokin i β-aktyny dla próbek są wyznaczane przy użyciu krzywych wzorcowych.

10. Ilościowy PCR dla mikromacierzy

Ilościowy screening za pomocą matryc qPCR w czasie rzeczywistym jest wysoce czułą i powtarzalną metodą badania zmian w ekspresji mediatorów zapalnych na niskim poziomie.

  1. Do badania zmian w ekspresji genów mediatorów stanu zapalnego wykorzystuje się zestaw RT2 Profiler PCR array firmy SABiosciences; kolejne kroki zostały szczegółowo opisane przez producenta.
  2. W teście wykorzystuje się 0,1-1,0 μg RNA. Stosujemy obszary lokalnych wycinków (np. CA1, z którego uzyskuje się ~250 ng całkowitego RNA z dwóch połączonych próbek) lub pojedyncze całe wycinki zawierające podobną ilość całkowitego RNA.
  3. RNA z próbek i kontroli poddaje się odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici (np. #C-03).
    1. Otrzymane cDNA miesza się z mieszanką do PCR opartą na barwniku SYBR Green (#PA-011), a następnie dozuje po 25 μL do każdego z 96 dołków płytki PCR array (mierzącej ekspresję 84 unikalnych genów eksperymentalnych i 16 genów referencyjnych).
    2. Jedną płytkę array przygotowuje się dla próbki eksperymentalnej, a drugą dla kontroli.
    3. Uwaga: Dostarczona przez producenta mieszanka SYBR Green master mix jest dedykowana dla konkretnego modelu termocyklera.
  4. Termocykling przeprowadza się za pomocą urządzenia iCycler zgodnie z protokołem 40 cykli, składającym się z etapu denaturacji przez 15 sec w 95°C, a następnie etapu elongacji przez jedną min w 60°C. Dane optyczne są zbierane podczas etapu elongacji. Po termocyklingu przeprowadza się analizę krzywej topnienia, skanując zakres temperatur 55-95°C w przyrostach 0,5°C.
  5. Względną ekspresję genów w płytkach badanych i kontrolnych określono metodą 2-ΔΔCt przy użyciu dostarczonego oprogramowania opartego na arkuszach Excel i wyrażono jako krotność wzrostu lub spadku w stosunku do kontroli.
  6. Do dalszej oceny brane są geny wykazujące dwukrotny wzrost lub spadek ekspresji.
  7. Geny zidentyfikowane podczas przesiewu za pomocą PCR array (np. z użyciem #PARN-011A dla prekondycjonowania zimnem) są następnie potwierdzane metodą qPCR.
    1. Macierze PCR array pozwalają zidentyfikować, które geny są regulowane w odpowiedzi na bodźce.
    2. W przypadku prekondycjonowania zimnem zidentyfikowaliśmy gen IL-11 jako regulowany pozytywnie w odpowiedzi na prekondycjonowanie zimnem.
    3. Kolejnym krokiem analizy jest potwierdzenie, że nowo zidentyfikowany gen jest regulowany w kulturach wycinków przy użyciu testu qPCR opisanego powyżej.

11. Multipleksowy proteomiczny test cytometrii przepływowej z użyciem mikrosfer

  1. Poddać hodowle plastrów prekondycjonowaniu zimnem zgodnie z powyższym opisem.
  2. Zebrać hodowle plastrów do oznaczania całkowitej zawartości białka.
    1. Delikatnie zdjąć plastry z insertu za pomocą pędzla z cienkim włosiem i umieścić w 1 mL zimnego (4°C) PBS.
    2. Odwirować probówki i usunąć PBS z hodowli plastrów. Przechowywać na suchym lodzie do zakończenia zbioru.
    3. Przechowywać probówki w temperaturze -80°C.
  3. Zhomogenizować próbki hodowli plastrów w celu przeprowadzenia oznaczania całkowitej zawartości białka.
    1. Przygotować bufor do lizy komórek do homogenizacji.
      1. Zgodnie z instrukcjami producenta (Bio-Rad), dodać inhibitory proteaz do 5 mL buforu do lizy i odstawić na lód.
    2. Nanieść 100 μL buforu do lizy na hodowle plastrów i wymieszać plastry, pipetując w górę i w dół pięć razy za pomocą końcówki do pipety 100 μL odciętej do 1 mm.
    3. Wstrząsać próbkami na wytrząsarce do płytek w temperaturze 4°C przez 20 min.
    4. Odwirować próbki z prędkością 13 000 rpm przez 15 min w temperaturze 4°C.
    5. Przenieść nadsącz do czystej probówki i odstawić na lód.
  4. Przeprowadzić oznaczanie całkowitej zawartości białka.
    1. Przygotować standardy białkowe BSA (albuminy surowicy bydlęcej).
      1. Zrekonstytuować roztwór zapasowy BSA wodą ultrapure zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Przygotować standardy białkowe w zakresie 0-1000 μg/mL, rozcieńczone w buforze do lizy.
    2. Obliczyć objętość potrzebnego odczynnika roboczego zgodnie z instrukcją zestawu.
      1. Na przykład, (osiem standardów + 18 nieznanych próbek) x (dwie powtórki) x (200 μL odczynnika roboczego wymagane na próbkę) = 10,4 mL całkowitej objętości odczynnika roboczego wymaganego do napełnienia mikropłytki 96-dołkowej (np. w przypadku analizy cytometrycznej z mikrosferami, patrz poniżej).
      2. Podczas mieszania Odczynnika A z Odczynnikiem B może wystąpić zmętnienie, które powinno jednak szybko ustąpić.
    3. Nanieść 10 μL standardów i próbek na mikropłytkę.
    4. Nanieść 0,2 mL odczynnika roboczego do dołków.
    5. Przykryć mikropłytkę taśmą uszczelniającą i wstrząsać na wytrząsarce do płytek przez 30 s.
    6. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 37°C przez 30 min.
    7. Schłodzić mikropłytkę do temperatury pokojowej (około 10 min) przed odczytem na czytniku płytek przy długości fali 595 nm.
    8. Wyznaczyć krzywą standardową w programie Microsoft Excel na podstawie zmierzonych wartości absorbancji standardów BSA.
    9. Obliczyć stężenia białek w próbkach, korzystając z otrzymanego równania liniowego z krzywej standardowej.
      1. Rozcieńczyć wszystkie próbki buforem do lizy do najniższego zmierzonego stężenia i przechowywać w temperaturze -80°C.
  5. Przeprowadzić analizy cytokin w tkankach (lub płynach) w wariancie single-plex i multiplex zgodnie ze szczegółowym opisem w referencjach #12 i 16.

12. Immunohistochemia

  1. Utrwalaj hodowle przez 24 godziny za pomocą utrwalacza PLP składającego się z 10 mL 16% paraformaldehydu, 1,096 g lizyny, 0,42 g fosforanu sodu i 0,17 g nadtlenku sodu, dopełniając do całkowitej objętości 80 mL wodą ultrapure (pH utrwalacza wynosi 6,2).
    1. Stwierdzono, że utrwalacz PLP jest łagodnym środkiem utrwalającym, który umożliwia wykrycie słabego barwienia immunocytochemicznego, które w przeciwnym razie nie byłoby widoczne przy użyciu innych utrwalaczy.
    2. Hodowle utrwala się przez 24 godziny, a następnie przenosi za pomocą cienkiego pędzla do PBS zawierającego azydek sodu (100 mg/L).
  2. Barwienie immunocytochemiczne w świetle przechodzącym dla pływających całych plastrów hodowli przeprowadza się w następujący sposób, łącząc wszystkie etapy z mieszaniem przy prędkości ~ 50 rpm.
    1. Przemywaj hodowle plastrów w 3 mL PBS trzy razy po 10 min.
    2. Wygaszaj hodowle plastrów w 0,3% H2O2.
      1. Rozcieńcz 30% roztwór zapasowy H2O2 w PBS.
    3. Przemywaj hodowle plastrów w PBS trzy razy, po 10 min każde płukanie.
    4. Blokuj hodowle plastrów przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w 3 mL roztworu blokującego w płytce sześciodołkowej, składającego się z 10 mL surowicy koziej, 0,75 mL Triton X-100 i 89,25 mL PBS.
      1. Surowica do roztworu blokującego powinna pochodzić od tego samego gatunku, u którego wytworzono przeciwciało wtórne.
    5. Inkubuj hodowle plastrów przez noc w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym w temperaturze 4°C.
      1. Maksymalna objętość roztworu przeciwciał pierwszorzędowych dla małych szklanych dołków Pyrex powinna wynosić 0,3 mL; większe objętości mają tendencję do wypływania poza krawędź płytki.
      2. Umieść naczynie w zamkniętym, nawilżonym pojemniku. Nie przykrywamy naczynia folią przylegającą, ponieważ sekcje mogłyby przykleić się do folii i zostać utracone w dalszych etapach obróbki.
      3. Dostosuj prędkość wstrząsania wytrząsarki płytkowej tak, aby była wystarczająca do cyrkulacji plastrów w roztworze przeciwciał.
    6. Wyjmij plastry z szklanej płytki i przemywaj w PBS trzy razy po 10 min na każde płukanie.
    7. Inkubuj plastry w przeciwciałach wtórnych w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę podczas mieszania.
      1. Użyj małych szklanych naczyń Pyrex, aby nanieść 0,3 mL roztworu przeciwciał wtórnych.
    8. Przemywaj trzy razy w PBS, po 10 min na każde płukanie.
    9. Wizualizuj barwienie za pomocą 3'-diaminobenzydyny (DAB).
      1. Rozpuść 30 mg DAB w 3 mL dimetylosulfotlenku.
      2. Przefiltruj DAB za pomocą dwóch papierów filtrujących nr 1 i przemyj 54 mL PBS.
      3. Bezpośrednio przed użyciem dodaj 20 μL 30% H2O2.
      4. Inkubuj hodowle w roztworze DAB przez 5-7 min w temperaturze pokojowej.
      5. Uwaga: DAB jest kancerogenem i musi być utylizowany w odpowiedni sposób. Wylewaj wszystkie roztwory DAB do oznakowanego pojemnika przechowywanego w dygestorium i umieszczaj wszystkie naczynia w roztworze wybielacza, aby dezaktywować DAB. Wszystkie roztwory DAB powinny zostać ostatecznie przekazane do utylizacji za pośrednictwem Biura Bezpieczeństwa Instytucjonalnego.
    10. Przemywaj hodowle plastrów w PBS trzy razy po 10 min każde płukanie.
    11. Wykonaj montaż na mokro hodowli plastrów na szkiełkach pokrytych żelatyną (lub silanem), używając 100 μL detergentu do naczyń rozpuszczonego w wodzie destylowanej. Susz przez noc w temperaturze pokojowej.
      1. Unikaj używania podgrzewaczy do szkiełek; nadmierne ciepło może spowodować pękanie hodowli zamontowanych na szkiełkach.
    12. Odwodnij szkiełka w serii rozcieńczeń etanolu (50, 75, 95, 95, 100, 100 %) przez 30 s w każdym etapie.
    13. Przejrzyść szkiełka w ksylenie cztery razy po dziesięć minut każde.
    14. Za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieś 0,1 mL medium montującego na wierzch szkiełka i ostrożnie przykryj szkiełkiem nakrywką, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Susz przez noc w temperaturze pokojowej.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne.
    1. Przygotuj sekcje hodowli plastrów o grubości 20 μm przy użyciu kriotomu.
      1. Ustaw parametry kriotomu na -16°C dla temperatury wewnętrznej i -12°C dla temperatury obiektu.
      2. Nanieś niewielką ilość wody na metalowy uchwyt za pomocą pipety Pasteura i zamroź na suchym lodzie.
      3. Nanieś cienką warstwę dysku medium Tissue-Tek na wierzch zamrożonego uchwytu.
      4. Pozostaw uchwyt do zamrożenia i wyrównania temperatury z komorą kriotomu.
      5. Wykonaj sekcję medium Tissue-Tek, aby stworzyć płaską powierzchnię odpowiednią do płaskiego ułożenia hodowli plastrów.
      6. Zwróć uwagę na orientację uchwytu podczas sekcjonowania; zapewnia to spójny kąt cięcia, który zapobiega spadaniu medium montującego z uchwytu.
      7. Po zamrożeniu wyjmij uchwyt i umieść go w uchwycie. Używając metalnej szpatułki i pędzla z cienkim końcem, nasuń jedną hodowlę plastra na szpatułkę i przenieś ją na środek spłaszczonej warstwy medium Tissue-Tek na uchwycie.
      8. Nałóż cienką warstwę medium Tissue-Tek na zamontowaną hodowlę plastra i zamroź w temperaturze komory przez co najmniej 10 min.
      9. Po aktywacji przycisku „trim” sekcjonuj górne warstwy medium Tissue-Tek, aż hodowla plastra stanie się widoczna.
      10. Przełącz z ustawienia „trim” na ustawienie „section” przy 20 μm.
      11. Pobieraj sekcje 20 μm na szkiełka pokryte żelatyną w temperaturze pokojowej i susz szkiełka przez noc.
      12. Medium Tissue-Tek będzie widoczne na szkiełkach, ale rozpuści się podczas płukania w PBS.
    2. Barwienie immunocytochemiczne.
      1. Przemywaj szkiełka w PBS trzy razy po 10 min każde płukanie.
      2. Wygaszaj w 0,3% H2O2 przez 15 min w temperaturze pokojowej, mieszając.
      3. Przemywaj szkiełka w PBS trzy razy po 10 min każde płukanie.
      4. Używając wzmacniacza sygnału SFX, nanieś kilka kropel Komponentu A bezpośrednio na sekcje na szkiełku i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze.
        • Inkubacja z Komponentem A zastępuje etap blokowania 10% roztworem surowicy koziej stosowanym w immunohistochemii w świetle przechodzącym.
      5. Inkubuj szkiełka w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w 0,75% Triton X-100 w PBS przez dwie godziny w 37°C.
        • Nanieś roztwór przeciwciał pierwszorzędowych bezpośrednio na wierzch szkiełek i inkubuj w nawilżonej komorze, aby zapobiec parowaniu.
        • Nie dodawaj surowicy do żadnego z roztworów przeciwciał; używaj wyłącznie PBS i Triton X-100.
      6. Przemywaj szkiełka w PBS trzy razy po 10 min każde płukanie.
      7. Inkubuj w przeciwciałach wtórnych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc szkiełka przed światłem.
        • Wirowarkuj wszystkie fluorescencyjne przeciwciała wtórne przez 20 min, aby zapobiec przedostaniu się agregatów do roztworu przeciwciał.
        • Przygotuj rozcieńczenia przeciwciał, używając 0,75% Triton X-100 w PBS.
      8. Przemywaj szkiełka w PBS trzy razy po 10 min każde płukanie.
      9. Zanurz szkiełka raz w wodzie destylowanej, aby wypłukać sole z PBS.
      10. Susz szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej, przykryte i chronione przed światłem.
      11. Przykryj szkiełka medium ProLong Antifade.
        • Rozmroź Komponent A w mikrofalówce przez 5-10 s i dodaj około 1 mL do fiolki z Komponentem B. Wymieszaj za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.
        • Wirowarkuj przez 5 min z maksymalną prędkością, aby usunąć pęcherzyki.
        • Nanieś cienką warstwę medium ProLong na wierzch szkiełka za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie stworzyć pęcherzyków powietrza.
        • Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkę na wierzchu szkiełka i susz przez noc, przykryte i chronione przed światłem.
      12. Podwójne barwienie immunofluorescencyjne (Rycina 5).
        1. Przeprowadź barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z powyższym opisem, z wyjątkiem tego, że oba przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńcz w tym samym roztworze inkubacyjnym.
        2. Rozcieńcz wszystkie przeciwciała wtórne w tym samym roztworze i inkubuj zgodnie z powyższym opisem.
        3. Seryjne okresy inkubacji z użyciem dwóch przeciwciał skutkowały osłabieniem barwienia immunocytochemicznego.

13. Reprezentatywne wyniki

Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca obszary CA1, CA3 i DG neuronów hipokampa; analiza morfologii komórek.
Rysunek 1. Wygląd kultur plastrów hipokampa i mikrogleju. Obraz po lewej stronie przedstawia typową dojrzałą (tj. 21-dniową in vitro) kulturę plastrów hipokampa barwioną NeuN (zielony) w celu zilustrowania cytoarchitektury głównych neuronów. Neurony piramidalne widoczne są w obszarach CA1 i CA3, a neurony zakrętu zębatego (DG) po lewej stronie. Pasek skali wynosi 250 μm. Obraz po prawej stronie pochodzi z obszaru CA1 i jest przedstawiony w większym powiększeniu, aby zilustrować rozgałęzioną strukturę spoczynkowej mikroglei w dojrzałych kulturach plastrów. Komórki zostały znakowane markerem powierzchniowym mikrogleju, cd11b. Pasek skali wynosi 50 μm.

Porównanie intensywności fluorescencji w komórkach; 24h, maksymalne punkty czasowe; kontrola vs. traktowanie CP.
Rysunek 2. Neuroprotekcja indukowana prekondycjonowaniem zimnem w kulturach skrawków hipokampa. Kultury inkubowano z Sytox Green, fluorescencyjnym markerem martwych komórek. Górny rząd przedstawia kultury kontrolne (sham), a dolny rząd skrawki eksponowane na 28°C przez 90 min. Zdjęcia po lewej stronie, wykonane przed badaniem właściwym, nie wykazują uszkodzeń w obszarze CA1. Skalę kalibracji kolorów względnego uszkodzenia przedstawiono na obrazie w lewym górnym rogu. Zdjęcia w środkowym rzędzie pokazują względne uszkodzenie kultur skrawków 24 godziny po ekspozycji na 20 μM NMDA. Zauważalnie uszkodzenia w grupie kontrolnej (sham) są większe niż w kulturach poddanych prekondycjonowaniu zimnem (CP). Tradycyjnie kultury eksponuje się następnie na 20 μM NMDA przez noc, aby zmaksymalizować poziom uszkodzeń neuronów CA1 oraz względne uszkodzenie CP w stosunku do sham, zapisywane jako stosunek uszkodzenia/uszkodzenia maksymalnego. Jednak ekspozycja na bodźce wywołujące uszkodzenia maksymalne może być niewystarczająca do przełamania neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania. W związku z tym stosowanie stosunków uszkodzenia/uszkodzenia maksymalnego może nie odzwierciedlać dokładnie neuroprotekcji z prekondycjonowania. Jest to widoczne na obrazach po prawej stronie, które pokazują, że maksymalne poziomy w grupie CP są niższe niż w grupach kontrolnych (sham).

Wykres przedstawiający względny stopień uszkodzenia w dniach po urazie z dwiema seriami danych do porównania.
Rycina 3. Schemat ilustrujący użyteczność pomiarów z pierwszego dnia w celu ilościowego określenia poziomu uszkodzeń w eksperymentach z prekondycjonowaniem zimnem. Jak wspomniano powyżej, stwierdzono, że stosowanie stosunków (uszkodzenie/maksymalne uszkodzenie) może maskować neuroprotekcję wynikającą z prekondycjonowania zimnem. Można to zauważyć na schemacie po lewej stronie, gdzie uszkodzenie pozorowane (sham) przedstawiono kolorem czerwonym, a uszkodzenie po prekondycjonowaniu zimnem kolorem niebieskim. Jeden dzień po ekspozycji na NMDA prekondycjonowanie zimnem wykazuje względny poziom uszkodzenia „3” w porównaniu do kontroli sham („5”), co jest zgodne z 40% neuroprotekcją. Jednakże, jeśli zastosuje się tradycyjny format oparty na stosunkach (tj. uszkodzenie/maksymalne uszkodzenie), żadna ochrona nie jest widoczna [tj. (5/10)=50% dla sham w porównaniu do (3/6)=50% dla prekondycjonowania zimnem].

Analiza qPCR; krzywa standardowa, wykres amplifikacji; obliczanie wydajności PCR, kwantyfikacja DNA.
Rycina 4. Przedstawiono typowe wyniki qPCR. Górna krzywa przedstawia liczbę kopii RNA w funkcji cyklu progowego dla amplifikacji PCR, wykazując próbki kontrolne (niebieski) i próbki badawcze (czerwony). Dolny obraz przedstawia typowe profile amplifikacji dla czterech próbek (czarny, zielony, żółty i fioletowy). Zauważmy, że późniejsze cykle progowe Ct (oznaczone pomarańczową linią) występują przy wartościach 26,0, 29,5, 31,0 i 32,5.

Mikroskopia immunofluorescencyjna, barwienie IL-11/NeuN, identyfikacja neuronów, analiza fluorescencji, komórki.
Rysunek 5. Podwójne barwienie immunocytochemiczne zastosowane w celu potwierdzenia wyników qPCR i macierzy qPCR. Przekrój hodowlany poddano barwieniu na IL-11 (czerwony) oraz NeuN (zielony; w celu znakowania neuronów), aby zbadać lokalizację komórkową ekspresji IL-11. Zauważalnie niektóre neurony piramidowe (strzałki) wykazują barwienie na IL-11 i NeuN (żółty), podczas gdy kilka mniejszych komórek (strzałki), prawdopodobnie astrocytów, wykazuje jedynie zwiększone barwienie na IL-11 (czerwony).

Dyskusja

Dwie fundamentalnie ważne koncepcje istotne dla określenia systemu sygnalizacji cytokin zaangażowanego w neuroprotekcję indukowaną prekondycjonowaniem zimnem zostały zilustrowane na rysunkach 6 i 7. Po pierwsze, cytokiny są cząsteczkami sygnałowymi występującymi w normalnym mózgu w skrajnie niskich stężeniach. Niemniej jednak, fizjologiczne zmiany stężenia cytokin mają ogromny potencjał do zmiany struktury i funkcji mózgu (tj. fenotypu) ze względu na ich zdolność do modyfikowania ekspresji genów (rysunek 6). Ponadto cytokiny charakteryzują się wysoką redundancją i plejotropią, co oznacza, że wiele cytokin może wywoływać podobne efekty, a pojedyncza cytokina może wywoływać zróżnicowane efekty (rysunek 7). Zatem, aby dokładnie ustalić wrodzone podstawy cytokinowe neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania zimnem (lub innych fizjologicznych bodźców prekondycjonujących), należy przeprowadzić analizę kompozytową powiązanych zmiennych sygnalizacyjnych. Jest to realizowane za pomocą strategii analizy multipleksowej. Pozwoli to na ustalenie „sygnatury” cytokinowej neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem.

Diagram porównawczy wielkości z oznaczeniami kota, owoców, krajobrazu miasta, linii brzegowej, Ziemi i Księżyca w zależności od skali.
Rycina 6. Moc sygnalizacji cytokin w mózgu. Ilustracje przekazują ogromną moc sygnalizacji fizjologicznych stężeń cytokin w mózgu w porównaniu do stężeń innych, dobrze znanych odpowiedników. Stężenie przedstawiono jako odwrotność odległości, przyjmując za punkt odniesienia pojedynczy wąs kota. Sód (10-1M zilustrowany ziarnkiem pieprzu) i potas (10-3M zilustrowany pomidorem) występują w przestrzeni śródmiąższowej mózgu na poziomach około 150 i 3 mM odpowiednio i pełnią uznane role w funkcji elektrofizjologicznej komórek nerwowych. Podobnie przedstawiono pH (tj. poziomy jonów wodoru ~10-7M zilustrowane jako 780 metrów wzdłuż nabrzeża jeziora w Chicago) oraz wapń (tj. poziomy ~10-8M pokazane jako 7,8 km na zdjęciu satelitarnym Google wzdłuż nabrzeża jeziora w Chicago, od McCormick Place do Promontory Point w Hyde Park w pobliżu University of Chicago). Ponadto neuroprzekaźniki uwalniane do przestrzeni śródmiąższowej w stężeniach powyżej tych wartości wpływają na aktywność lokalnych obszarów mózgu. W przeciwieństwie do nich, cytokiny (pokazane jako odległość z Ziemi na Marsa) mogą zmieniać funkcje mózgu przy stężeniach ponad dziesięć milionów razy niższych.

Schemat szlaków sygnalizacji komórkowej; przedstawia oddziaływania cytokin w odpowiedzi immunologicznej.
Rycina 7. Interaktywna sygnalizacja wrodzonych szlaków cytokinowych. Cytokiny wykazują wysoką redundancję i plejotropię, co oznacza, że wiele cytokin może wywoływać podobne efekty, a pojedyncza cytokina może mieć zróżnicowane działanie. Taka różnorodność wynika ze złożonej interaktywnej sygnalizacji zachodzącej na poziomie ligandów, receptorów i fosfoprotein. Dalsza złożoność wynika z faktu, że mózg składa się z różnych typów komórek, z których każda jest zdolna do specyficznych dla danego typu komórki zmian w zakresie wrodzonych cytokin, receptorów i powiązanych fosfoprotein. W celach ilustracyjnych przedstawiono tutaj wyłącznie wrodzone szlaki sygnalizacji cytokinowej (pochodzące z badań nad komórkami odpornościowymi). Dla uproszczenia mózg narysowano jako pojedynczą komórkę (biała linia), pokazując potencjalne interakcje dla wrodzonych cytokin (IL-1α i IL-1β (tutaj określanych jako IL-1α/β), TNF-α, IL-6, IFN-γ i IL-10), receptorów (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR i IL-10R), fosfoprotein (tj. kinaz ERK1/2, P38 (P38-MAPK) i JNK) oraz czynników transkrypcyjnych (ATF-2, NFκB i STAT3). Na przykład TNF-α sygnalizuje poprzez TNFR1 do JNK, p38-MAPK i ERK1/2, co wyzwala ekspresję genów poprzez ATF-2. TNF-α zmienia również ekspresję genów bezpośrednio poprzez aktywację NFκB. Wspólnie aktywacja tych czynników transkrypcyjnych wywołuje zwiększoną (strzałka) i zmniejszoną (tępy koniec) ekspresję cytokin i ich receptorów, jak wskazano. Co ważne, szlaki te pokazują, że zmiany w jednej cytokinie (np. TNF-α) wpływają na produkcję innych cytokin (np. IL-1β). Zatem, aby dokładnie ustalić podstawy cytokinowe neuroprotekcji wynikającej z prekondycjonowania zimnem, należy określić złożoną analizę powiązanych zmiennych sygnalizacyjnych. Pozwoli to na ustalenie wrodzonego „podpisu” cytokinowego prekondycjonowania zimnem. (Obraz opracowano na podstawie danych z pozycji bibliograficznej #25.)

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantów National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), Migraine Research Foundation oraz White Foundation przyznanych Richardowi P. Kraigowi. Pani Marcia P. Kraig pomogła w przygotowaniu pożywek oraz utrzymaniu kultur plastrów. Dziękujemy Yelenie Grinberg za uwagi i poprawki do ostatecznej wersji tego artykułu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie kultur skrawków
Wkładki do hodowli tkankowych Millicell-CM (30 mm)PICM0-3050
Podłoże podstawowe Eagle (Basal Medium Eagle)21010
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (Earle's Balanced Salt Solution)E2888
Surowica konia26050-088
Glutamax35050
Gentamycyna15710-064
Fungizone15295
D-glukozaG8769
Dygestorium BSL-1
Krojarka do tkanek McIlwaina
Dyski teflonowe023-49-310-1
Szpatułka14-373-25A
Zakrzywione nożyczki irydowe14091-09
Długie nożyczki proste14002-14
Długie pęseta13-812-40
Pęseta kątowa11808-02
Krótka pęseta13-812-38
Pęseta Inox #511254-20
2 szpatułki irydowe10094-13
Szalki Petriego 150 x 15 mm08-757-148
Szalki Petriego 60 x 15 mm08-757-100B
Stereomikroskop Wild M8
Zrównoważony roztwór soli Geya (Gey's balance salt solution)G9779
Miernik promieniowania ultrafioletowego krótkofalowego Blak-RayJ-225
6-dołkowe naczynia hodowlane Falcon08-772-1B
Neurobasal21103
Suplement B2717504
Gem21 Neuroplex400-160-010
Kwas askorbinowyA4544
Analizator CO2#2820
Wstępna ocena żywotności kultur skrawków
Sytox GreenS7020
Mikroskop odwrócony DMIBRE
Wstępne schłodzenie
Dygestorium BSL-2
Uszkodzenie ekscytotoksyczne
Kamera CCD CoolSnap fx
FluoresceinaF36915
Oprogramowanie MetaMorphv. 7.5.04
Hemocytometr o głębokości 100 μm
N-metylo-D-asparginian454575
Oprogramowanie SigmaStatv. 3.5
Współleczenie stosowane podczas wstępnego schłodzenia
sTNFR1425-R1-050
Sery Albuminy Bydłowej (BSA)A-4503
Izolacja RNA
RNAlaterAM7021
Zestaw Micro RNEasy74004
β-merkapto–etanol03446-100
Jednorazowy tłuczek 1,5 wolny od RNazy749521-1590
RNasinN261A
Tris[hydroksymetylo]aminometanT3069
EDTA (dwusodowa sól hydratu kwasu etylenodiaminotetraoctowego)#E7889
Ilościowe oznaczanie RNA
Test RiboGreenR11491
tRNA drożdży15401-011
Probówki wirówkowe 1,5 mL16155500
96-dołkowa fluorescencyjna płytka testowaDK-4000
96-dołkowy fluorescencyjny czytnik płytekSafire II
Ilościowy PCR (qPCR)
Zestaw do odwrotnej transkrypcji iScript170-8891
SYBR GreenS7563
Polimeraza Platinum TaqRNA Ultrasense 11732-927
Termocykler iCyclerModuł Optyczny iCycler
Oprogramowanie systemowe iCyclerv. 3.1
Ilościowy PCR dla mikromacierzy
RNase Away#7000
Zestaw do pierwszej nici RT2C-03
Mieszanina PCR oparta na SYBR GreenSpecyficzna dla iCyclerPA-011
Macierz PCR RT2 ProfilerPARN-011A
Analiza proteomiczna
Zestaw do lizy komórek171-304011
MikrowirówkaMicro 7
Roztwór zapasowy białka BSA500-0007
Zestaw do oznaczania białek BCA23225
Płytki Immuno 96 MicroWell449824
Taśma uszczelniająca2239444
Czytnik płytek 96-dołkowychlicznika wieloetykietowego 1420
Test cytokin Bioplex Rat TNF-αX0000001T
Immunobarwienie
16% Paraformaldehyd43368
LizynaL-6001
Fosforan soduS374-1
Jodynian soduS-1878
Azydek soduS-2002
Nadtlenek wodoru (30%)H1009
Surowica kozyCS 0920
Triton X-100T-8787
Kuwety do barwienia14511
Wstrząsarka do płytek3520
Papier filtracyjny #1 (185 mm)1001-185
3,3'-diaminobenzydynaD8001
DimetylosulfoksydD8418
Etanol111000200
KsylenX3S-4
Medium montażowe PermountSP15-100
Kriostatcm3050 S
Tissue-Tek27050
Pędzel z cienkim końcem11806
Pisak blokujący PAP22309
Wzmacniacz sygnału SFXA31631
ProLong AntifadeP7481

Bibliografia

  1. Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression. Brain Res. 998, 155-163 (2004).
  2. Beattie, E. C. Control of synaptic strength by glial TNFalpha. Science. 295, 2282-2285 (2002).
  3. Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain. J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).
  4. Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression. J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).
  5. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).
  6. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia. J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).
  7. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production. J Neurochem. 72, 565-575 (1999).
  8. Calabrese, E. J. Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications. Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).
  9. Calabrese, E. J. Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework. Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).
  10. Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. Hormesis: the dose-response revolution. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).
  11. Hansel, N. N. Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms. Allergy. 63, 366-369 (2008).
  12. Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).
  13. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha. J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).
  14. Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture. Glia. 33, 169-179 (2001).
  15. Kraig, R. P. TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine. International Dose-Respose Society. , (2010).
  16. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures. J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).
  17. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).
  18. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).
  19. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).
  20. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture. Hippocampus. 14, 356-367 (2004).
  21. Lambertsen, K. L. Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).
  22. Lee, J. K. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  23. Mattson, M. P. Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways. Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).
  24. Ning, B. Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes. J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).
  25. Oppenheim, J., Feldman, M. in Cytokine Reference. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).
  26. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).
  27. Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha. J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).
  28. Stellwagen, D., Malenka, R. C. Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha. Nature. 440, 1054-1059 (2006).
  29. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40, 133-139 (2002).
  30. Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro. Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Strategie neuroprotekcyjnekultury plastrów hipokampasygnalizacja cytokinowaaktywacja mikroglejusygnalizacja prozapalnatest multipleksowyilościowa PCRimmunohistochemiamodel uszkodzenia NMDA
Strategie badania neuroprotekcji indukowanej prekondycjonowaniem zimnem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.