$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Transfekcja plazmidów w celu produkcji cząsteczek lentiwirusowych zależnych od białka Rev
Przygotowanie: Lentiwirusowy wektor GFP zależny od białka Rev, pNL-GFP-RRE-SA, został opisany wcześniej4,5,6. W celu złożenia w cząstkę wirusową, plazmid został współtransfekowany do komórek HEK293 T wraz z konstruktem pakującym HIV-1, pCMVΔ8.2 (uprzejmie udostępnionym przez dr. Didera Trono), oraz plazmidem niosącym glikoproteinę VSV-G (pHCMV-G). Transfekcję przeprowadzono metodą fosforanu wapnia.
Przygotowanie buforów: 10 X HBS (bufor solny z Hepesem) przygotowano przez rozpuszczenie 5 g Hepesu, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dekstrozy i 0,103 g Na2HPO4 (bezwodnego) w 100 mL H2O. Bufor 10 X HBS należy podzielić na alikwoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C. W momencie transfekcji należy przekształcić 10 X HBS w 2 X HBS za pomocą H2O (rozcieńczenie 1:5) i dostosować pH do poziomu od 7,05 do 7,12 (dla 10 mL 2 X HBS zazwyczaj wymagane jest około 50 μL 1M NaOH). Bufor 2X HBS należy wysterylizować poprzez filtrację przez filtr Millipore 0,22 μM. Bufor CaCl2 przygotowano przez rozpuszczenie CaCl2 w 10 mM Hepesie do stężenia końcowego 2M. Należy dostosować pH do 5,8, wysterylizować bufor poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
Procedura:
- Na jeden dzień przed transfekcją wysiać 2 x 106 komórki HEK293T w 100-milimetrowej szalce Petriego i inkubować komórki przez noc w 10 ml pożywki DMEM + 10% FBS w temperaturze 37°C, 5% CO2.
- Następnego dnia usunąć supernatant z komórek i zastąpić go 5 ml świeżej pożywki DMEM + 10% FBS, a następnie inkubować komórki przez 4 godziny.
- Do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml dodać 480 μBufor HBS 2X.
- Do drugiej probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml dodać 60 μ2 M CaCl₂2 bufor, plazmidowe DNA oraz bufor TE do transfekcji (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) do całkowitej objętości 480 μL. Do każdej szalki Petriego należy dodać plazmidy w stosunku 10 μg pNL-GFP-RRE-SA, 7,5 μg pCMVΔR8.3 oraz 2,5 mg pHCMV-G.
- Dodać plazmid DNA-CaCl22 mieszaninę kroplami do probówki z 2 X HBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powstanie drobny osad.
- Dodaj 960 μL mieszaniny kroplami za pomocą pipety do komórek. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO22 przez noc.
- Następnego dnia usunąć supernatant, dodać 10 ml świeżej pożywki DMEM + 10% FBS i kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37°C°C, 5% CO2 przez noc.
- W 48 godzinach po transfekcji zebrać wirusa, usuwając nadsącz i przenosząc go do sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Do każdej płytki Petriego dodać 10 ml świeżego medium DMEM z dodatkiem 10% FBS i kontynuować hodowlę przez noc. Nadsącz z wirusem przechowywać w temperaturze 4°C.°C.
- Kontynuuj etap zbioru w 72. godzinie po transfekcji poprzez zebranie supernatantu. Połącz wszystkie supernatanty, a następnie odwiruj je przy 500 x g przez 15 minut, aby osadzić i usunąć debris komórkowy.
- Nadstawiwo zebrano i przefiltrowano przez filtr o rozmiarze porów 0,22 µm. μfiltr Millipore o rozmiarze oczek M. Wirusa dodatkowo zagęszczono przy użyciu kolumn do chromatografii wykluczania wielkości.
2. Koncentracja cząsteczek wirusa i oznaczenie miana wirusa
- Cząstki wirusowe skoncentrowano za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania sterycznego (próg odcięcia 100 000 MW, Centricoin). Nadnadbątek wirusowy naniesiono na kolumnę, a następnie odwirowano przy 6 000 x g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
- Skoncentrowany nadnadbątek wirusowy zebrano, podzielono na alykwo ty i przechowywano w temperaturze -80°C.
- Miano wirusa określono poprzez zakażenie linii komórkowej J1.1, będącej linią komórek Jacket dodatnią pod kątem HIV-1 i traktowaną TNF. Komórki hodowano na płytce 96-dołkowej w zagęszczeniu 2,5 x 105 komórek na mL (całkowita objętość 100 mL) i infekowano 100 mL seryjnie rozcieńczonego vNL-GFP-RRE-SA przez tydzień. Miano (TCID50) cząstek oszacowano poprzez policzenie dołków z GFP zgodnie z metodą Reeda i Muencha.
3. Markerowanie komórek HIV-1 dodatnich za pomocą cząsteczki lentiwirusowej vNL-GFP-RRE-SA
Przygotowanie: linię ludzkich limfocytów T CD4, CEM-SS, zainfekowano najpierw wirusem HIV-1. 48 godzin po infekcji komórki poddano superinfekcji cząsteczkami lentiwirusowymi vNL-GFP-RRE-SA. Po kolejnych dwóch dniach superinfekcji komórki GFP-dodatnie poddano analizie metodą cytometrii przepływowej. Jako kontrolę komórki CEM-SS niezainfekowane HIV-1 zainfekowano w identyczny sposób cząsteczkami vNL-GFP-RRE-SA. Wyłącznie zainfekowane HIV-1 komórki CEM-SS dały początek komórkom GFP-dodatnim, natomiast nie zaobserwowano tego w przypadku komórek CEM-SS niezainfekowanych HIV-1.
Procedura:
- Na dwie godziny przed infekcją dodać polybrane do stężenia końcowego 4 mg / mL. Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję. Zainfekować komórki wirusem HIV-1NL4-3 w ilości 200 ng (p24) przez 2 godziny.
- Przemyć komórki, wirując w wirówce przy 300 x g przez 10 minut, resuspender komórki do stężenia 2 x 105 komórek / mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin.
- Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję vNL-GFP-RRE-SA. Dodać 100 mL vNL-GFP-RRE-SA i inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Przemyć komórki i resuspender do stężenia 2 x 105 komórek / mL.
- Przeprowadzić analizę cytometryczną 48 godzin po superinfekcji. Zainfekowane komórki odwirywać i resuspender w 500 mL 1% paraformaldehydu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie analizować za pomocą analizatora FACScan (Becton Dickenson).
4. Reprezentatywne wyniki
W przypadku prawidłowego przeprowadzenia eksperymentów, w komórkach CEM-SS zainfekowanych HIV-1 za pomocą cytometru przepływowego zostanie wykryta znaczna populacja GFP, podczas gdy w grupie kontrolnej w niezinfekowanych HIV-1 komórkach CEM-SS nie zostaną wykryte komórki GFP-dodatnie.
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, zależny od Rev wektor lentiwirusowy vNL-GFP-RRE-SA umożliwi wysoce specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek poprzez pomiar ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). W niniejszym przykładzie zebrane komórki CEM-SS zabarwiono szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiemu CD24 i HSA, znakowanym PE, a następnie poddano analizie na cytometrze przepływowym w celu oceny ekspresji zarówno HSA, jak i GFP.
Rycina 1. Jak pokazano tutaj, znaczną populację GFP wykryto w komórkach zainfekowanych HIV-1, które poddano superinfekcji vNL-GFP-RRE-SA (Rycina 1c). W przeciwieństwie do tego, komórek pozytywnych pod kątem GFP nie wykryto ani w niezinfekowanych HIV-1 komórkach CEM-SS bez superinfekcji lentiwirusowej (Rycina 1a), ani w niezinfekowanych HIV-1 komórkach z superinfekcją lentiwirusową (Rycina 1b).