Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.
Artykuł metodologiczny
Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość wektorów ekspresyjnych reagujących na HIV opiera się na promotorze HIV, czyli długiej powtórzonej sekwencji końcowej (LTR). Choć LTR reaguje na wczesne białko HIV, Tat, jest on również podatny na stany aktywacji komórkowej oraz lokalną aktywność chromatyny w miejscu, w którym doszło do integracji. Może to prowadzić do wysokiej aktywności niezależnej od HIV, co ograniczyło użyteczność reporterów opartych na LTR w znakowaniu komórek z dodatnim wynikiem w kierunku HIV 1,2,3. W niniejszej pracy skonstruowaliśmy lentiwirusowy wektor ekspresyjny, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada liczne sekwencje DNA HIV, obejmujące element odpowiedzi Rev oraz miejsca splicingowe HIV 4,5,6. Wektor ten włączono do lentiwirusowego wirusa reporterowego, co umożliwiło bardzo specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek. Aktywność wektora mierzono poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Zastosowanie opisanego tutaj wektora stanowi nową, alternatywną metodę w stosunku do istniejących technik, takich jak PCR in situ czy barwienie na antygeny HIV, w celu identyfikacji komórek HIV-dodatnich. Wektor ten może być również wykorzystany do ekspresji genów terapeutycznych w badaniach podstawowych lub klinicznych, aby celować w komórki HIV-dodatnie.
Protokół
1. Transfekcja plazmidów w celu produkcji cząstek lentiwirusowych zależnych od białka Rev
Przygotowanie: Zależny od Rev lentiwirusek wektor GFP, pNL-GFP-RRE-SA, został opisany wcześniej4,5,6. W celu montażu w cząstkę wirusową, plazmid został współtransfekowany do komórek HEK293 T wraz z konstruktem pakującym HIV-1, pCMVΔ8.2 (uprzejmie udostępnionym przez dr. Didera Trono), oraz plazmidem niosącym glikoproteinę VSV-G (pHCMV-G). Transfekcję przeprowadzono metodą fosforanu wapnia.
Przygotowanie buforów: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) przygotowano poprzez rozpuszczenie 5 g Hepes, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dekstrozy oraz 0,103 g Na2HPO4 (bezwodnego) w 100 mL H2O. Bufor 10 X HBS należy podzielić na alykwoyty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C. W momencie transfekcji należy rozcieńczyć 10 X HBS do 2 X HBS za pomocą H2O (rozcieńczenie 1:5) i dostosować pH do wartości między 7,05 a 7,12 (dla 10 mL 2 X HBS zazwyczaj wymagane jest około 50 μL 1M NaOH). Bufor 2X HBS należy wysterylizować przez filtrację przez filtr Millipore 0,22 μM. Bufor CaCl2 przygotowano poprzez rozpuszczenie CaCl2 w 10 mM Hepes do stężenia końcowego 2M. Należy dostosować pH do wartości 5,8, wysterylizować bufor przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
Procedura:
- Na jeden dzień przed transfekcją wysiać 2 x 106 komórek HEK293T do szalki Petriego o średnicy 100 mm i hodować komórki przez noc w 10 mL DMEM + 10% FBS w temperaturze 37°C, 5% CO2.
- Następnego dnia usunąć nadosad z komórek i zastąpić go 5 mL świeżego DMEM + 10% FBS, a następnie kontynuować hodowlę komórek przez 4 godziny.
- Do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL dodać 480 μL buforu 2X HBS.
- Do drugiej polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL dodać 60 μL buforu 2M CaCl2, plazmidowe DNA oraz bufor TE do transfekcji (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) do uzyskania całkowitej objętości 480 μL. Dla każdej szalki Petriego plazmidy należy dodać w proporcjach: 10 μg pNL-GFP-RRE-SA, 7,5 μg pCMVΔR8.3 i 2,5 mg pHCMV-G.
- Mieszaninę plazmidowego DNA i CaCl2 dodawać kroplami do probówki z 2X HBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powstanie drobny osad.
- Za pomocą pipety dodać kroplami 960 μL mieszaniny do komórek. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc.
- Następnego dnia usunąć nadosad i dodać 10 mL świeżego DMEM + 10% FBS, a następnie kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc.
- W 48 godzinach po transfekcji zebrać wirusa poprzez usunięcie nadosadu i przeniesienie go do sterylnych probówek o pojemności 50 mL. Do każdej szalki Petriego dodać 10 mL świeżego DMEM + 10% FBS i kontynuować hodowlę przez noc. Nadosad zawierający wirusa przechowywać w temperaturze 4°C.
- Kontynuować zbiór w 72 godzinach po transfekcji poprzez pobranie nadosadu. Połączyć wszystkie nadosady i wirować w 500 x g przez 15 minut w celu osadzenia i usunięcia resztek komórkowych.
- Nadosady zebrano i przefiltrowano przez filtr Millipore 0,22 μM. Wirus został następnie skoncentrowany przy użyciu kolumn do chromatografii wykluczania.
2. Zagęszczenie cząsteczek wirusa i oznaczenie miana wirusa
- Cząsteczki wirusa skoncentrowano za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego (próg odcięcia 100 000 MW, Centricoin). Nadosad wirusowy naniesiono na kolumnę, a następnie wirówkowano przy 6 000 x g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
- Skoncentrowany nadosad wirusowy zebrano, podzielono na aلیکwoty i przechowywano w temperaturze -80°C.
- Miano wirusa określono poprzez zakażenie linii komórkowej Jacket J1.1, pozytywnej pod kątem HIV-1 i traktowanej TNF. Komórki hodowano na płytce 96-dołkowej w zagęszczeniu 2,5 x 105 komórek na mL (całkowita objętość 100 mL) i zakażano 100 mL seryjnie rozcieńczonego vNL-GFP-RRE-SA przez tydzień. Miano (TCID50) cząsteczek oszacowano poprzez zliczenie dołków pozytywnych pod kątem GFP zgodnie z metodą Reeda i Muencha.
3. Znakowanie komórek dodatnich pod kątem HIV-1 za pomocą cząsteczki lentiwirusowej vNL-GFP-RRE-SA
Przygotowanie: linię ludzkich limfocytów T CD4, CEM-SS, najpierw zainfekowano HIV-1. Po 48 godzinach od infekcji komórki poddano superinfekcji cząsteczkami lentiwirusowymi vNL-GFP-RRE-SA. Po kolejnych dwóch dniach superinfekcji komórki GFP-dodatnie przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej. W ramach kontroli komórki CEM-SS niezainfekowane HIV-1 zainfekowano w identyczny sposób za pomocą vNL-GFP-RRE-SA. Tylko zainfekowane HIV-1 komórki CEM-SS dały początek komórkom GFP-dodatnim, natomiast nie zaobserwowano tego w przypadku komórek CEM-SS niezainfekowanych HIV-1.
Procedura:
- Na dwie godziny przed infekcją dodać polybrane do stężenia końcowego 4 mg / mL. Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję. Zainfekować komórki dawką 200 ng (p24) HIV-1NL4-3 przez 2 godziny.
- Po przemyciu komórek w wirówce przy 300 x g przez 10 minut, resuspendować komórki do stężenia 2 x 105 komórek / mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin.
- Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję vNL-GFP-RRE-SA. Dodać 100 mL vNL-GFP-RRE-SA i inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Przemyć komórki i resuspendować do stężenia 2 x 105 komórek / mL.
- Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej 48 godzin po superinfekcji. Zainfekowane komórki odwirować i resuspendować w 500 mL 1% paraformaldehydu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie przeanalizować na analizatorze FACScan (Becton Dickenson).
4. Reprezentatywne wyniki
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, w zakażonych HIV-1 komórkach CEM-SS za pomocą cytometru przepływowego zostanie wykryta znaczna populacja GFP, natomiast w kontroli komórki dodatnie pod kątem GFP nie zostaną wykryte w niezakażonych HIV-1 komórkach CEM-SS.
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, lentiwirusem wektor zależny od białka Rev, vNL-GFP-RRE-SA, umożliwi on wysoce specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych populacjach komórek poprzez pomiar ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). W tym przykładzie zebrane komórki CEM-SS zabarwiono znakowanym PE szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiemu CD24, HSA, a następnie przeanalizowano za pomocą cytometru przepływowego pod kątem ekspresji HSA oraz GFP.
Rysunek 1. Jak pokazano tutaj, w komórkach zakażonych HIV-1, które poddano superinfekcji vNL-GFP-RRE-SA, wykryto znaczną populację GFP (Rysunek 1c). W przeciwieństwie do tego, komórek dodatnich pod kątem GFP nie wykryto ani w komórkach CEM-SS niezakażonych HIV-1 bez superinfekcji lentiwirusem (Rysunek 1a), ani w komórkach niezakażonych HIV-1 z superinfekcją lentiwirusem (Rysunek 1b).
Dyskusja
Podobnie jak w przypadku wcześniej opracowanych wektorów ekspresyjnych zależnych od Tat, opisany tutaj system Rev jest wykorzystaniem ewolucyjnego procesu HIV. Wprowadzenie zależności od Rev sprawia, że oparty na LTR wektor ekspresyjny jest silnie zależny od obecności replikującego się HIV. Zastosowanie tego wektora, opisane tutaj jako zależny od HIV wirus reporterowy, oferuje nowatorskie podejście do identyfikacji komórek HIV-dodatnich. Wektor ten umożliwia badanie żywych komórek, może ekspresować dowolny gen na potrzeby podstawowych lub klinicznych eksperymentów i jako pseudotypowany lentiwirus ma dostęp do większości typów komórek i tkanek.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca była częściowo finansowana z grantu Public Health Service 1R01AI081568 z NIAID dla Y. W. oraz dzięki hojnym darowiznom darczyńców i uczestników rajdu 2009 NYCDC AIDS Ride zorganizowanego przez M. Rosen i Day2 Inc.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza | |||
| 37°C 5% CO2 inkubator | |||
| Cytometr przepływowy | FACSCalibur | ||
| Wirówka | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°lodówka C | |||
| -20°lodówka C | |||
| -80°lodówka C | |||
| Licznik komórek | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| linia komórkowa HEK293T | National Institutes of Health | ||
| linia komórkowa CEM-SS | National Institutes of Health | ||
| Linia komórkowa Jurkat J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | przygotowane poprzez transfekcję komórek HeLa sklonowanym prowiralnym DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | całkowita delecja wszystkich otwartych ramek odczytu (ORF) HIV z pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Wprowadzenie HIV-1 A5 i D4 do pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | udostępnione przez dr. Didera Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (bufor solny z Hepesem) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl₂2 bufor | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Wybielacz | |||
| probówki Falcon 50 ml | BD Biosciences | 358206 | |
| probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μfiltr Millipore M | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μfiltr M Millipore | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| szalka Petri 100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Kolumna do chromatografii wykluczania treści molekularnych (próg odcięcia 100 000 MW) | Sartorius AG | VS2041 | |
| probówka do mrożenia 2 ml | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| płytka 96-dołkowa | BD Biosciences | 353227 | |
| Probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml | Axygen Scientific | MCT-175-C |
Bibliografia
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
Przedruki i uprawnienia
