Artykuł metodologiczny

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2208

⸱

27 sierpnia 2010

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York at Stony Brook, 2Bio-Medical Engineering Department, NED University of Engineering and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

W niniejszej pracy przedstawiamy prosty i szybki protokół wykrywania i oceny zakresu transportu makromolekularnego między komórkami in planta. W tym protokole białko zainteresowania z tagiem fluorescencyjnym jest przejściowo ekspresowane w tkance roślinnej po dostarczeniu konstruktu DNA kodującego to białko za pomocą biolistyki. Następnie rozkład wewnątrz- i międzykomórkowy tagowanego białka jest analizowany przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Szczegółowo opisujemy tę technologię, dostarczając protokoły krok po kroku w celu analizy i oceny zakresu symplastycznego transportu białek u trzech gatunków roślin: Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana oraz N. tabacum (tytoń).

Protokół

Wstęp

Transport symplastyczny makrocząsteczek poprzez połączenia międzykomórkowe roślin, czyli plasmodesmaty, jest przedmiotem zainteresowania wielu fitopatologów i biologów roślin. Na przykład wiadomo, że kilka białek wirusowych reguluje granice wykluczania wielkości plasmodesmat, aby umożliwić przemieszczanie się wirusa1-3. Ponadto przyjmuje się, że niektóre białka endogenne, w tym ważne regulatory rozwojowe, przemieszczają się z komórki do komórki, prawdopodobnie przez plasmodesmaty, aby pełnić funkcje nieautonomiczne komórkowo4. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na wiarygodną metodologię służącą do identyfikacji i wizualizacji transportu makrocząsteczek między komórkami roślinnymi.

1) Hodowla roślin docelowych

W celu uzyskania wysokiej wydajności transformacji należy używać zdrowych, silnych roślin.

1. Rośliny Arabidopsis

Wyprawia się jedną roślinę Arabidopsis na podłożu Pro-Mix BX w doniczce (10 cm x 10 cm x 10 cm) w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi, przy krótkim fotoperiodzie (8 h światła o natężeniu 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C/16 h ciemności w temperaturze 20°C) i wilgotności względnej 40-65% przez okres od 6 do 8 tygodni5. Rośliny należy okresowo nawozić dostępnymi komercyjnie produktami zgodnie z opisem5. Do eksperymentów wybiera się liście o rozmiarach przekraczających 15 mm x 35 mm (pomiar długości obejmuje ogonek liściowy).

2. N. benthamiana oraz N. tabacum

Uprawiaj jedną roślinę w podłożu Pro-Mix BX w doniczce (20 cm x 20 cm x 20 cm) w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi przy długim fotoperiodzie (16 h światła o natężeniu 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C/8 h ciemności w 20°C) i względnej wilgotności 40-65% przez 7 do 10 tygodni. Nawoź rośliny sporadycznie dostępnymi w handlu produktami zgodnie z opisem. Do doświadczeń wybieraj liście o rozmiarach większych niż 50 mm x 70 mm dla N. benthamiana lub 10 mm x 125 mm dla N. tabacum (pomiary długości nie obejmują ogonka).

2) Przygotowanie wkładu do armatki genowej z mikrocząsteczkami złota pokrytymi DNA

Protokół dla tego etapu eksperymentu został opisany szczegółowo we wcześniejszej publikacji6. Aby uzyskać najwyższą wydajność transformacji, co ułatwia późniejszą analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej na dalszych etapach eksperymentu, bardzo ważne jest zastosowanie dobrze oczyszczonego DNA plazmidowego o wysokim stężeniu (~1 μg/μl).

W przypadku tego testu ważne jest upewnienie się, że przygotowany wkład nie transformuje jednocześnie dwóch lub więcej sąsiadujących komórek z wysoką częstotliwością, ponieważ liczba komórek związanych z klastrem sygnału fluorescencyjnego służy jako wskaźnik zakresu transportu symplastycznego (tj. pojedyncza komórka zawierająca sygnał wskazuje na brak ruchu, natomiast wielokomórkowy klaster sygnału wskazuje na jego wystąpienie). Jakość każdego wkładu można sprawdzić, analizując ekspresję białka 16–20 godzin po bombardowaniu. Nasz protokół6 produkuje wkłady, w których klastry ekspresji wielokomórkowej powstają wyłącznie w <3% wszystkich zdarzeń ekspresji w tym przedziale czasowym, co czyni je odpowiednimi do niniejszego eksperymentu.

3) Biolistyczna dostawa mikrocząsteczek powlekanych DNA

  1. Odetnij liście w tym samym stadium rozwoju (tj. o tej samej wielkości i wieku, patrz krok 1) za pomocą ostrej żyletki i natychmiast ułóż je stroną abaksjalną do góry na płaskiej powierzchni ze styropianu. Strona abaksjalna liścia stanowi lepszy substrat do bombardowania ze względu na mniejszą gęstość trichomów i cieńszą kutykulę. Liście Arabidopsis, ze względu na ich stosunkowo niewielki rozmiar, należy przykryć kawałkiem siatki okiennej, a następnie przymocować siatkę do powierzchni styropianowej za pomocą pinezek. Utrzymanie liści w pozycji płaskiej zwiększa efektywność dostarczania cząsteczek i minimalizuje uszkodzenia tkanki podczas mikrobombardowania.
  2. Włóż do pistoletu kasetę z mikrocząsteczkami pokrytymi DNA (przygotowaną w kroku 1). W przypadku Arabidopsis strzelanie przeprowadza się przy ciśnieniu 80-10 psi dla mikrocząsteczek 1-μm oraz 140-160 psi dla mikrocząsteczek 0.6-μm. W przypadku N. benthamiana i tytoniu strzelanie przeprowadza się przy ciśnieniu 10-120 psi dla mikrocząsteczek 1-μm oraz 160-180 psi dla mikrocząsteczek 0.6-μm. W przypadku Arabidopsis zazwyczaj wykorzystujemy jedną kasetę na liść, ponieważ każdy liść posiada powierzchnię wystarczającą tylko na jeden strzał, który rozprowadza mikrocząsteczki na obszarze o średnicy 10-12 mm. W przypadku większych liści N. benthamiana i tytoniu możliwe jest wielokrotne bombardowanie tego samego liścia; musi ono być jednak przeprowadzone w symetrycznych pozycjach po każdej stronie nerwu głównego, aby celować w obszary liścia będące w tym samym stadium rozwoju (patrz Dyskusja).
  3. Zdejmij liście z powierzchni styropianowej i umieść je w szalce Petriego na 3 warstwach zwilżonego papieru filtracyjnego Whatman, szczelnie zamknij szalkę Parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 36-48 hr, aby umożliwić ekspresję dostarczonych transgenów oraz potencjalny ruch produktów białkowych z komórki do komórki.

4) Obrazowanie ekspresji białka

Sygnał fluorescencyjny przejściowo ekspresowanych białek z tagiem jest wizualizowany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy zadbać o dobór optymalnych ustawień mikroskopu dla detekcji każdego badanego białka. Na przykład białka wykazujące ograniczoną akumulację wewnątrzkomórkową i słabą intensywność sygnału, takie jak białko ruchu wirusa mozaiki tytoniu (TMV MP) zlokalizowane w plazmodesmatach1-3,6, powinny być obserwowane przy użyciu obiektywu 40X, który zapewnia wyższą rozdzielczość i czułość, podczas gdy białka o rozkładzie cytoplazmatycznym i silnej intensywności sygnału, takie jak wolne YFP, mogą być wizualizowane przy użyciu obiektywu 10X z funkcją zoomu konfokalnego w celu szybszego obrazowania (patrz. Rycina 1).

Transport symplastyczny wnioskuje się na podstawie pojawienia się wielokomórkowych klastrów zawierających sygnał fluorescencyjny. Liczba takich klastrów oraz liczba komórek w każdym klastrze wskazują na zakres transportu międzykomórkowego. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy zarejestrować co najmniej 10 klastrów ekspresji dla każdego systemu eksperymentalnego. Na przykład, jeśli porównywany jest transport białka między komórkami w dwóch różnych tle genetycznych (np. w roślinach typu dzikiego i transgenicznych), należy zarejestrować łącznie 20 klastrów ekspresji. Co ważne, eksperymenty, których wyniki mają być ze sobą porównane, powinny być przeprowadzane jednocześnie.

5. Reprezentatywne wyniki

Poniższa rycina przedstawia reprezentatywne eksperymenty służące do wykrywania transportu symplastycznego białek znakowanych fluorescencyjnie. Panele A i B pokazują typowe obrazy konfokalne uzyskane po mikrobombardowaniu liścia N. benthamiana konstruktem ekspresyjnym TMV MP-YFP. W panelu A obserwuje się ruch symplastyczny TMV MP-YFP na podstawie pojawienia się wielokomórkowych skupisk sygnału YFP. Nie wszystkie przejściowo ekspresowane białka TMV MP-YFP są zdolne do przemieszczania się, co potwierdza sygnał jednokomórkowy w niektórych próbkach po mikrobombardowaniu (panel B). Statystycznie, w <40% policzonych skupisk sygnału TMV MP-YFP nie jest w stanie przemieszczać się między komórkami, podczas gdy w >60% skupisk białko przemieszcza się między 2-5 komórkami, przy czym najczęstszym jest rozprzestrzenienie na dwie komórki (ok. ~50% przypadków) (Rycina 1C).

Białka o stosunkowo niewielkim rozmiarze cząsteczkowym, nieposiadające wrodzonej aktywności ruchowej, mogą dyfundować przez PD, przemieszczając się z komórki do komórki. Na przykład wolne YFP, lub 1xYFP (ok. 27 kDa, panel D), rozprzestrzenia się pomiędzy kilkoma komórkami w 30% policzonych skupisk (panele C). Ta niespecyficzna dyfuzja nie występuje w przypadku translacyjnego dimeru YFP, czyli 2xYFP (54 kDa, panel E), którego rozmiar jest porównywalny z białkiem fuzyjnym TMV MP-YFP (57 kDa) i który jest całkowicie autonomiczny komórkowo (Rycina 1C).

Analiza fluorescencyjna mikroskopowa; ekspresja białek wirusowych; schemat; wyniki eksperymentu; porównanie.
Rycina 1.Typowe wyniki uzyskane w teście transportu symplastycznego w N. benthamiana tkanki liściowe. (A, B) Wizualizacja TMV MP-YFP. (C) Ilościowe oznaczenie klastrów sygnału. Odpowiednio 1xYFP i 2xYFP, wolne YFP i translacyjny dimer YFP. (D) Wizualizacja 1xYFP. (E) Wizualizacja 2xYFP. Na mikrografiach lewe panele przedstawiają sygnał YFP, a prawe panele przedstawiają obrazy złożone z sygnałów YFP (na zielono) i autofluorescencji chloroplastów (na biało). Obrazy stanowią pojedyncze przekroje konfokalne. Gwiazdki na mikrografiach wskazują komórki epidermy wykazujące sygnał YFP. Paski skali = 50 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczem do sukcesu analizy transportu symplastycznego jest uzyskanie wysokiej wydajności transformacji, co pozwala na wytworzenie statystycznie istotnych i łatwo wykrywalnych skupisk sygnałów. Można to osiągnąć, wykorzystując liście zebrane ze zdrowych, silnych roślin oraz przygotowując cząsteczki złota pokryte czystym i skoncentrowanym preparatem DNA.

Użycie liści znajdujących się na tym samym etapie wzrostu jest również kluczowe dla wiarygodności analizy. Znane jest, że otwór plasmodesm jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Nasza praca jest wspierana przez granty z NIH/NIGMS, NSF, USDA/NIFA oraz BARD przyznane VC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrocząsteczki złota, o średnicy 1,0 μmBio-Rad165-2262
Mikrocząsteczki złota, o średnicy 0,6 μmBio-Rad165-2263
SpermidynaSigma-AldrichS0266-1G
Przewody TefzelBio-Rad165-2441
Stacja przygotowawcza do kartridży HeliosBio-Rad165-2420
Obcinak do przewodówBio-Rad165-2422
Działo genowe HeliosBio-Rad165-2432
Regulator gazu heluBio-Rad165-2413

Bibliografia

  1. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  2. Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
  3. Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
  4. Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
  5. Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
  6. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
  7. Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
  8. Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
  9. Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
  10. Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
  11. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  12. Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
  13. Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport mi dzykom rkowymikroskopia konfokalnaledzenie bia ek fluorescencyjnychepidermisz ro linytransport symplastycznydostarczanie za pomoc armatki genowejlokalizacja bia ekArabidopsis thalianaNicotiana benthamiana

Powiązane artykuły