W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dorosła mysia komórka macierzysta siatkówki (RSC) jest rzadką, spoczywającą komórką występującą w nabłonku rzęskowym (CE) oka ssaków1,2,3. CE składa się z niebarwnej warstwy wewnętrznej oraz barwnej warstwy zewnętrznej komórek, a klonalne kolonie RSC powstające z jednej barwnej komórki CE składają się zarówno z komórek barwnych, jak i niebarwnych, które mogą różnicować się w wszystkie typy komórek siatkówki nerwowej i nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Istnieją pewne kontrowersje co do tego, czy wszystkie komórki w obrębie sfer zawierają przynajmniej niewielką ilość pigmentu4; niemniej jednak komórki te nadal są zdolne do tworzenia różnych typów komórek występujących w siatkówce nerwowej1-3. U niektórych gatunków, takich jak płazy i ryby, oczy są zdolne do regeneracji po urazie5; jednak oko ssaków nie wykazuje takich właściwości regeneracyjnych. Dążymy do zidentyfikowania komórki macierzystej in vivo oraz zrozumienia mechanizmów, które utrzymują komórki macierzyste siatkówki ssaków w stanie spoczynku6-8, nawet po urazie, a także do wykorzystania ich jako potencjalnego źródła komórek wspomagających naprawę fizycznych lub genetycznych modeli uszkodzeń oka poprzez transplantację9-12. W niniejszym protokole opisujemy sposób izolacji komórek nabłonka rzęskowego z oka myszy oraz ich hodowlę w celu utworzenia klonalnych sfer komórek macierzystych siatkówki. Ponieważ nie są znane żadne markery komórek macierzystych in vivo, sfery te stanowią jedyny znany sposób na prospektywną identyfikację populacji komórek macierzystych w nabłonku rzęskowym oka.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów do sekcji i roztworów enzymów
- Przygotować wcześniej sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) oraz medium bezełkowe i przechowywać w lodówce.
- Odważyć kwas kynurenowy (0,2 mg/mL) i rozpuścić go wcześniej w 10 mL hilo ACSF w kąpieli wodnej o temperaturze 37° C, ponieważ substancja ta nie rozpuszcza się łatwo.
- Odważyć trypsynę (1,33 mg/mL) oraz hialuronidazę (0,67 mg/mL), umieścić w jednej probówce o pojemności 15 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia. Bezpośrednio przed zastosowaniem dodać do tej probówki roztwór kwasu kynurenowego i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 2 μm.
- Odważyć inhibitor trypsyny (owamukoid: 1 mg/mL), rozpuścić w ciepłym medium bezełkowym i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 2 μm.
- Przygotować medium do wysiewu: medium bezełkowe zawierające FGF2 (10 ng/mL) i heparynę (2 μg/mL).
2. Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy
- Izolację komórek macierzystych siatkówki przeprowadza się w specjalnym sterylnym pomieszczeniu przeznaczonym do eksperymentów z kulturami pierwotnymi. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować mikroskop stereoskopowy oraz źródło zimnego światła, a następnie rozłożyć sterylne narzędzia do mikrodissekcji. Każdy okap wyposażony jest w sterylizator kuleczkowy do sterylizacji narzędzi pomiędzy poszczególnymi etapami.
- Komórki macierzyste siatkówki będziemy izolować z oczu, które po wyjęciu z myszy uśpionych zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etyki dotyczącymi zwierząt, zostały niezwłocznie umieszczone w sterylnym naczyniu Petri zawierającym sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF).
- Pod mikroskopem stereoskopowym należy oczyścić oko za pomocą pęsety: usunąć włosy oraz tkankę łączną przylegającą do granicy rogówki i twardówki. Następnie przenieść oko do nowego naczynia z ACSF.
- Trzymając oko delikatnie i nieruchomo za pomocą pęsety ząbkowej, użyć skośnych nożyczek do mikrodissekcji, aby usunąć mięśnie gałki ocznej. Należy również usunąć nerw wzrokowy, jeśli nadal jest przytwierdzony do oka. Podczas tego procesu należy starać się nie zgniatać oka. Przenieść oczy do nowego naczynia z ACSF.
- Następnie użyć zakrzywionych nożyczek do mikrodissekcji, aby przeciąć oko na pół: zacząć od nerwu wzrokowego i przeciąć przez środek rogówki, wracając do miejsca rozpoczęcia cięcia przy nerwie wzrokowym. Idealnie byłoby, gdyby obie części oka były mniej więcej tej samej wielkości, co ułatwi kolejny krok.
- Trzymając rogówki za pomocą dwóch pęset, delikatnie rozdzielić dwie połowy oka. Usunąć i odrzucić soczewkę, zawartość wnętrza oka oraz siatkówkę neuronową z pochewek oka. Przenieść pochewki do nowego naczynia z ACSF.
- Teraz można przystąpić do izolacji nabłonka rzęsistego. Na początek zorientować pochewkę oka tak, aby rogówka znajdowała się po prawej stronie, a nabłonek pigmentowy siatkówki (RPE) po lewej. Delikatnie przytrzymać pochewkę oka prostą pęsetą od strony RPE.
- Następnie za pomocą skalpela oddzielić rogówkę i tęczówkę od nabłonka rzęsistego oka, delikatnie naciskając skalpel w dół, zamiast stosować ruchy piłujące.
- Po tym odciąć nabłonek rzęsisty od RPE. Użyć pęsety nieząbkowej, aby przenieść pasek nabłonka rzęsistego do nowego naczynia 35-mm zawierającego ACSF.
- W ten sam sposób wyizolować nabłonek rzęsisty z drugiej pochewki oka.
- Po zebraniu obu pasków nabłonka rzęsistego przenieść je do naczynia 35-mm zawierającego 2 mL Dispase. Umieścić naczynie z paskami w inkubatorze w temperaturze 37° C na 10 minut.
- Po 10 minutach przenieść paski z Dispase do naczynia zawierającego 2 mL filtrowanej trypsyny, hialuronidazy i kwasu kynurenowego. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Powrócić do mikroskopu stereoskopowego. Przytrzymując twardówkę prostą pęsetą, użyć końcówki zakrzywionej pęsety nieząbkowej, aby delikatnie zeskrobać nabłonek rzęsisty z twardówki.
- Usunąć twardówkę z naczynia. W naczyniu powinny pozostać teraz jedynie interesujące nas komórki oraz roztwór enzymatyczny.
- Za pomocą wypalanej pipety z watowym korkiem przenieść ten roztwór do probówki 14-ml. Przeprowadzić triturację roztworu 30 razy, aby rozbić komórki nabłonkowe, delikatnie wciągając i wypuszczając roztwór z pipety.
- Wirować probówkę przez 5 minut przy 150 RPM. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki, ponieważ na tym etapie komórki mają tendencję do odrywania się od dna probówki.
- Delikatnie odessać większość supernatantu za pomocą wypalanej pipety, a następnie dodać do komórek 1 mL inhibitora trypsyny w medium bezsurowiczym. Użyć pipety z wąskim otworem i watowym korkiem, aby triturować próbkę około 50 razy, aż powstanie zawiesina pojedynczych komórek.
- Ponownie wirować probówkę przez 5 minut przy 150 RPM.
- Usunąć supernatantu i zastąpić go 1 mL medium do wysiewu. Delikatnie triturować za pomocą wypalanej pipety szklanej, aby resuspendować komórki.
- Po policzeniu komórek wysiać je z pożądaną gęstością na płytkę 24-dołkową. Zazwyczaj wysiewamy 10 komórek/μL, wypełniając każdy dołek najpierw medium, a następnie dodając zawiesinę komórkową, aby uzyskać końcową objętość 50 μL medium.
- Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37° C, gdzie nie będzie ona przemieszczana aż do momentu policzenia sfer, które pojawią się po 7 dniach.
3. Wyniki izolacji komórek macierzystych siatkówki
- Po pomyślnym przeprowadzeniu tej procedury, wypreparowane komórki nabłonka rzęsnego po dysocjacji i wysianiu przy niskiej gęstości powinny wyglądać w ten sposób (Rycina 1).
- Po 7 dniach hodowli należy policzyć powstałe sfery macierzystych komórek siatkówki. Aby sfera została policzona jako sfery pochodzące z komórek macierzystych, musi mieć średnicę powyżej 75 μm i być wolno pływająca (Rycina 2). Jednak niektóre komórki będą wykazywać ograniczoną proliferację i tworzyć sferoidy, które nie spełniają kryterium wielkości i nie zostaną policzone jako sfery pochodzące z komórek macierzystych; przykład takiego sferoidu pokazano tutaj (Rycina 2).
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1.
Rycina 2.
Dyskusja
Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji komórek macierzystych siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy 1-3. Metodyka izolacji pasków nabłonka rzęskowego może być zróżnicowana, jednak w tym protokole zoptymalizowano enzymy oraz metodologię uzyskiwania zawiesiny pojedynczych komórek. Ważne jest również, aby wyizolowane paski nabłonka rzęskowego nie zawierały dużych ilości nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) ani rogówki, ponieważ wydają się one negatywnie wpływać na całkowitą liczbę sfer, które można wyizolować z każdego oka. Ponadto stosowane przez nas bezsurowicze medium, pierwotnie sformułowane dla neurosfer mózgowych 13, jest idealne do hodowli sfer komórek macierzystych siatkówki. Należy również upewnić się, że komórki nie są niepokojone po ich wysianiu i umieszczeniu w inkubatorze, aby rosnące sfery nie ulegały agregacji 14.
Po utworzeniu przez komórki macierzyste siatkówki sfer klonalnych można je przeliczyć, aby uzyskać przybliżoną liczbę komórek macierzystych na oko. Następnie sfery można dysocjować do pojedynczych komórek i pasażować w celu oceny zdolności do samoodnowy lub różnicować w różne typy komórek siatkówki nerwowej i RPE, stosując różne kombinacje czynników wzrostu i/lub białek.
Oświadczenia
Brak deklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Laurze Clarke za nieocenioną pomoc. Praca ta jest wspierana przez NCE: Stem Cell Network, CIHR oraz NIH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zimne źródło światła | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | optyczne światło z podwójnym ramieniem |
| Zakrzywione mini nożyczki Vannasa | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Kątowe nożyczki Vannasa | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pinceta Dumont nr 7 | Fine Science Tools | 11272-30 | nieząbkowana |
| Pinceta Dumont nr 5 | Fine Science Tools | 11251-10 | prosta |
| Pinceta precyzyjna | Fine Science Tools | 11051-10 | ząbkowana zakrzywiona |
| Rękojeść skalpela nr 3 | Almedic | 2586-M36-10 | |
| Ostrza skalpela nr 10 | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Sterylizator koralikowy | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hialuronidaza | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kwas kynurenowy | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Inhibitor trypsyny | Roche Group | 10109878001 | |
| Szkiełka 35 mm | VWR international | CA354235 | |
| Płytka 24-dołkowa | VWR international | CA73521-004 | |
| Pipety z watowym czopkiem | VWR international | 14672-400 | polerowane ogniowo |
| Probówki 14 mL | Falcon BD | 352057 | Polistyren |
| Poziom medium bezsurowiczego | Ref# 13 w celu uzyskania składu | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
Bibliografia
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
Przedruki i uprawnienia
