Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Podsumowanie

Niniejszy film przedstawia ogólne techniki stosowane w hodowli Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych. Metody opieki nad komarami laboratoryjnymi są zaprezentowane na wszystkich etapach cyklu życiowego organizmu: od larw i poczwarek po dorosłe osobniki pobierające krew.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje hodowlę komarów w insekterium. W pomieszczeniach insekterium utrzymuje się temperaturę 28°C i wilgotność ~80% przy 12-godzinnym cyklu dnia i nocy. Do przeprowadzenia tej procedury będą potrzebne: klatki dla komarów, 10% sterylny roztwór sacharozy, ręczniki papierowe, zlewka, papier filtracyjny Whatman, szklane karmniki, krew oraz surowica ludzka, łaźnia wodna, parafilm, woda destylowana, czyste plastikowe tace, pokarm dla komarów (opisany poniżej), siatka przeciwkomarowa do przykrycia tac, odkurzacz oraz komora do zbierania osobników dorosłych.

Protokół

Pokarm dla komarów:

1. Pokarm A: zmielony pokarm dla ryb (Aquaricare). Należy dodać małą szczyptę.
2. Pokarm B: zmielony pokarm dla kotów (Purina). Należy dodać małą szczyptę.
3. Pokarm C: pokarm dla kotów (Purina). Należy dodać dwie tabletki.

Krew:

Do hodowli komarów można wykorzystać krew zwierzęcą lub ludzką. Świeżą krew pobiera się strzykawką i przelewa do sterylnej probówki Falcon o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml CPD (antykoagulantu) na każde 10 ml krwi, a następnie delikatnie miesza i wiruje w temperaturze pokojowej przy 2000 rpm przez 5 min. Nadpływ odrzuca, dbając o usunięcie warstwy białkowoeleukocytarnej (buffy coat), która składa się z pozostałych komórek krwi (np. WBC). Osad RBC zawiesza się poprzez pipetowanie w równymt objętości medium RPMI, a następnie przemywa w tym medium trzykrotnie. Po ostatnim przemyciu osad RBC resuspensuje się w równymt objętości medium RPMI i przechowuje w temperaturze 4°C (można przechowywać przez 8-10 dni). Bezpośrednio przed karmieniem RBC (w medium RPMI) wiruje się (2000 rpm przez 5 min) w celu osadzenia komórek, a upakowane RBC resuspensuje się w surowicy (ludzka surowica grupy O+) do uzyskania 40% hematokrytu. Krew przeznaczona do karmienia musi być stale utrzymywana w temperaturze 37°C.

DZIEŃ 1:

1. Samice dorosłych komarów w wieku 3-5 dni są karmione krwią w celu zniesienia jaj.
2. Do karmienia krwią stosuje się metodę z wykorzystaniem sztucznej membrany (parafilmu) w następujący sposób:
   
   
   1. Erytrocyty (patrz powyżej w sekcji przygotowania krwi) miesza się z serum inaktywowanym ciepłem, aby uzyskać hematokryt na poziomie ~40% (40% skonsolidowanych erytrocytów i 60% serum). Mieszaninę tę wprowadza się do szklanego karmnika.
   2. Karmnik zostaje podłączony do ciepłej płaszcza wodnego (37°C) i umieszczony na klatce, aby umożliwić komarom dostęp do powierzchni membrany.
   3. Komarom pozwala się żerować przez ~30 minut.

DZIEŃ 3:

1. Samice złożą jaja dwa dni po spożyciu krwi. Mały kawałek papieru filtru owinięty w kształt stożka umieszcza się w małym zlewce z wodą destylowaną, dbając o to, aby papier filtracyjny był wilgotny. Zlewkę pozostawia się w klatce na noc, aby komary mogły złożyć jaja.

DZIEŃ 4:

1. Papier filtracyjny zawierający jaja komarów umieszcza się w plastikowej kuwecie z ~300 ml wody destylowanej. Do kuwety dodaje się szczyptę pożywki A i pozostawia jaja do wyklucia się larw w ciągu kolejnych dni.

DNI 5 - 8:

1. Rozwijające się larwy karmiono codziennie dwiema tabletkami pożywki C, monitorując jednocześnie zagęszczenie oraz liczebność populacji. Ósmego dnia (larwy 5-dniowe) populację larw przeniesiono z 1 kuwety do ok. 10 kuwet, dodając do każdej szczyptę pożywki A oraz dwie tabletki pożywki C. (~30 min)

DNI 9 - 12:

1. Larwy są karmione codziennie pokarmem C. W 12. dniu (larwy w wieku 9 dni) wodę wymienia się na świeżą i dodaje pokarm (szczyptę pokarmu B oraz dwie tabletki pokarmu C). Na tym etapie rozpoczyna się rozwój poczwarek. Tace przykrywa się siatkami, aby zapobiec ucieczce osobników dorosłych. (~ 8-10 mins)

DZIEŃ 13 - 15:

Przez kolejne 2 - 3 dni oczekuje się na wyjście imago z pociorek. Larwy/pociorek są karmione codziennie, przy czym siatkę zdejmuje się ostrożnie, aby zapobiec ucieczce osobników dorosłych.

DZIEŃ 16:

1. Osobniki dorosłe zbiera się do klatki za pomocą aspiratora podłączonego do pompy próżniowej. Klatka składa się z małej butelki o pojemności 100 ml z bawełnianym knotkiem nasączonym 10% sacharozą (autoklawowaną) oraz wyłożonym na dnie ręcznikiem papierowym, który ma wchłaniać ewentualne wycieki cukru mogące wystąpić podczas manipulowania klatką. (~ 30-40 mins)

DZIEŃ 17 - 21:

1. Osobniki dorosłe (zarówno samce, jak i samice) są następnie utrzymywane w insektarium przez 4-5 dni i karmione 10% sacharozą przed kolejnym karmieniem krwią w celu rozpoczęcia następnego cyklu. Te same komary mogą być wykorzystywane do składania jaj wielokrotnie.
2. Komary, które nie są potrzebne do eksperymentów lub hodowli, można zabić, umieszczając klatkę w zamrażarce. Używane tace i klatki należy oczyścić i wysuszyć przed ponownym użyciem.

UWAGA: Metoda hodowli komarów może wykazywać pewne różnice, a poszczególne laboratoria mogą stosować odmienne techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pokarm A		Aquaricare		Zmielony pokarm dla ryb. Należy dodać małą szczyptę.
Pokarm B		Purina		Zmielony pokarm dla kotów. Należy dodać małą szczyptę.
Pokarm C		Purina		Pokarm dla kotów. Należy dodać dwa tablety
RBC				przygotowane erytrocyty: 40% hematokrytu w ludzkim serum
RPMI	Pożywka
CPD				antykoagulant
serum				ludzkie serum grupy O+
Karmiarka do komarów
parafilm
Anopheles gambiae				komary
10% sacharozy				pokarm dla komarów
insektarium