Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Podsumowanie

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Streszczenie

Możliwość systematycznego badania odpowiedzi komórkowej in vitro na kombinacje bodźców mechanobiologicznych w inżynierii tkankowej, poszukiwaniu nowych leków lub w fundamentalnych badaniach biologii komórki jest ograniczona przez obecne technologie bioreaktorów, które nie pozwalają na jednoczesne przykładanie różnorodnych bodźców mechanicznych do hodowanych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię mikrofabrykowanych platform zaprojektowanych do przesiewowego badania efektów bodźców mechanicznych w formacie wysokoprzepustowym. W niniejszym protokole demonstrujemy wykonanie macierzy mikroaktuatorów z pionowo przemieszczanymi słupkami, na której oparta jest ta technologia, a następnie pokazujemy, w jaki sposób technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodowli komórkowych w paradygmatach hodowli dwu- i trójwymiarowych.

Protokół

A. Opis i zasada działania urządzenia

Urządzenia są wytwarzane przy użyciu wielowarstwowej litografii miękkiej¹ w polidimetylosiloksanie (PDMS) i umożliwiają jednoczesne generowanie szeregu warunków mechanicznych w poszczególnych miejscach hodowli komórek w obrębie mikrofabrykowanej matrycy. W niniejszym protokole w pierwszej kolejności opisano kroki niezbędne do wytworzenia matrycy pneumatycznie sterowanych mikrofilarów, a następnie opisano kroki modyfikacji urządzenia w celu umożliwienia dynamicznej hodowli mechanicznej w paradygmatach hodowli dwuwymiarowej (2D) i trójwymiarowej (3D). Przedstawione podejście mikrofabrykacyjne zwiększa wydajność w porównaniu z istniejącymi systemami w skali makro i najlepiej nadaje się do przesiewania efektów różnorodnych warunków mechanicznych.

Zasada działania urządzenia opiera się na macierzy pionowo aktualizowanych mikrosłupków. Mikrosłupki są wytwarzane na swobodnie zawieszonej membranie i są podnoszone oraz opuszczane poprzez przyłożenie dodatniego i ujemnego ciśnienia pod membraną sterującą (Rycina 1). Kluczową cechą macierzy jest to, że poprzez zmianę rozmiaru membrany sterującej, pojedyncze źródło ciśnienia może zostać wykorzystane do uzyskania zakresu przemieszczeń pionowych w obrębie całej macierzy. Zasada ta jest wykorzystywana do szybkiego przesiewowego badania odpowiedzi komórkowej na dużą liczbę mechanicznych warunków stymulujących za pomocą jednego urządzenia.

Opierając się na analogicznej konstrukcji w skali makro opracowanej przez Schaffera et al.², nasz projekt obejmuje drugą zawieszoną i nasmarowaną warstwę hodowli komórkowej nad filarem, co pozwala komórkom doświadczać odkształcenia podłoża 2D w momencie, gdy warstwa hodowlana przesuwa się nad podniesionym filarem obciążającym. Alternatywnie, fotowzorowanie matrycy hydrożeli z zawieszonymi komórkami nad filarami obciążającymi umożliwia stymulację kompresyjną komórek w hodowli 3D. Poniżej znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji tych systemów.

B. Wytwarzanie macierzy pneumatycznych mikroaktuatorów

Wytwarzanie matrycy pneumatycznych mikroaktuatorów wymaga precyzyjnego wyrównania w wielowarstwowych strukturach PDMS. Jest to zadanie trudne ze względu na błędy rejestracji wyrównania spowodowane skurczem materiału. Aby rozwiązać ten problem, stosujemy proces wytwarzania określany jako „sandwich mold fabrication”³, który wykazał skuteczność w eliminowaniu tego zjawiska⁴.

Przygotowanie materiałów

1. Jedno- lub wielopoziomowe matryce SU-8 dla każdego z poszczególnych poziomów są wytwarzane w pomieszczeniu czystym zgodnie ze standardowymi procedurami. W przypadku tych urządzeń matryce mają grubość 200-400 μm, w zależności od zastosowania. Przed użyciem matryce są poddawane utwardzaniu termicznemu (hardbake) w temperaturze 80 °C przez trzy dni.
2. Czyste szkiełka przedmiotowe oraz matryce SU-8 są silanizowane w komorze próżniowej, aby zapobiec przyleganiu utwardzanego PDMS do materiałów. W dygestorium 60 μL środka silanizującego (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (United Chemical Technologies, Bristol, PA) jest pipetowane do szalki Petriego w komorze. Gołe szkło oraz matryce SU-8 są umieszczane w komorze i pozostawiane pod próżnią przez noc.
3. Dwie gąbki piankowe (dostępne w sklepach z artykułami plastycznymi) oraz folia do drukarek atramentowych są wycinane do rozmiarów nieco większych niż matryca SU-8 używana do wykonania formy kanapkowej.

Wytwarzanie formy warstwowej

1. Każda warstwa urządzenia wielowarstwowego wymaga warstwy PDMS uformowanej za pomocą tej metody. Schemat procesu wytwarzania formy kanapkowej przedstawiono na Rysunku 1.
2. Monomer PDMS i utwardzacz są dokładnie wymieszane w standardowym stosunku 10:1. 3 mL nieutwardzonej mieszaniny PDMS nanosi się na wcześniej przygotowaną matrycę SU-8, a następnie odgazowuje w komorze próżniowej.
3. Podkładka z pianki i matryca SU-8 są umieszczane na płytce bazowej z pleksiglasu.
4. Folię przezroczystą ostrożnie opuszcza się na nieutwardzony PDMS, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Folie do drukarek atramentowych mają stronę szorstką i gładką; istotne jest, aby to strona gładka stykała się z nieutwardzonym PDMS.
5. Zasilanizowane szkiełko przedmiotowe umieszcza się na folii przezroczystej, pod drugą podkładką z pianki i górną płytką z pleksiglasu. Całość jest następnie ściskana za pomocą ścisku śrubowego.
6. „Kanapka” z PDMS jest utwardzana w piecu w temperaturze 80 °C przez co najmniej 4 godziny.
7. Konstrukcję wyjmuje się z pieca i pozostawia do ostygnięcia przed zdjęciem ścisku.
8. Ścisk jest usuwany, a konstrukcja rozbierana; podkładki z pianki są utylizowane. Folię przezroczystą ostrożnie oddziela się od matrycy SU-8, zachowując ustrukturyzowaną warstwę PDMS.
9. Takie ustrukturyzowane warstwy PDMS wraz z warstwami folii pomocniczej mogą być przechowywane w środowisku wolnym od kurzu do momentu użycia. Z powodzeniem korzystaliśmy z warstw PDMS o wieku do dwóch miesięcy, nie obserwując żadnych zauważalnych negatywnych skutków.

Budowa urządzenia wielowarstwowego

Schemat wykonania matrycy mikroaktuatorów przedstawiono na rysunku 2A, a działanie aktuatorów pokazano na rysunkach 2B i C. Aby wykonać urządzenie:

1. Najniższa strukturalna warstwa PDMS jest przygotowywana metodą formowania kanapkowego. W tych eksperymentach zastosowano wzory koliste o średnicy od 600 do 1200 μm.
2. Warstwę PDMS przenosi się następnie na czystą szkiełko przedmiotowe. Do obróbki powierzchni PDMS i szkła plazmą tlenową wykorzystuje się urządzenie do wyładowań koronnych, po czym obie powierzchnie doprowadza się do kontaktu. Cały zestaw umieszcza się następnie na płycie grzewczej w temperaturze 80 °C, aby zakończyć proces wiązania. Następnie można odkleić i usunąć folię przezroczystą. W trakcie tego procesu strukturalna błona PDMS nigdy nie jest oddzielana od sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw.
3. W zależności od powodzenia etapu formowania kanapkowego może zajść potrzeba usunięcia cienkich warstw PDMS, które nie zostały wyciśnięte spośród struktur SU-8 i folii przezroczystej. Można to zrobić ręcznie, używając igły 25G pod stereomikroskopem.
4. Druga warstwa formowana kanapkowo powstaje jako negatywowa matryca replikacyjna pożądanej struktury membrany i słupków. Wynika to z faktu, że wytwarzanie matryc SU-8 o dużej powierzchni jest trudne, jednak zastosowanie alternatywnych procesów wytwarzania mogłoby wyeliminować ten dodatkowy krok. W tej demonstracji zastosowano koliste słupki o średnicy 500 μm. Negatywowa matryca replikacyjna zostaje poddana silanizacji i tymczasowo przytwierdzona do szkiełka przedmiotowego za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Niewulkanizowany PDMS jest nanoszony, odgazowywany i rozprowadzany metodą spin-coatingu na tę warstwę matrycy kanapkowej przez 45 sekund przy 1000 RPM, co pozwala uzyskać membranę aktywacyjną o grubości 60 μm. Warstwa PDMS naniesiona metodą spin-coatingu jest częściowo utwardzana w temperaturze 80 °C przez ok. 20 minut, aż do momentu, gdy PDMS stanie się lepki, ale nie będzie ulegać trwałym odkształceniom po dotknięciu.
5. Szkiełko przedmiotowe i dwustronna taśma klejąca są usuwane z częściowo utwardzonej warstwy PDMS, która następnie zostaje poddana obróbce plazmowej, odwrócona i umieszczona w specjalnie wykonanym ustawiaczu. Ustawiacz składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze (Siskiyou; Mission Viego, CA, USA). Pierwsza warstwa PDMS jest następnie poddawana obróbce plazmowej i umieszczana na stole obrotowym (Newmark, Grants Pass, OR, USA), pod uchwytem próżniowym, a dopasowanie obu warstw jest obserwowane za pomocą systemu wizyjnego Navitar z 12-krotnym zoomem (Navitar; Rochester, NY, USA).
6. Warstwy są dopasowywane za pomocą manipulatora i ostrożnie doprowadzane do kontaktu. Następnie zestaw jest wyjmowany z ustawiacza i utwardzany w piecu w temperaturze 80 °C przez kolejne 30 minut. Folia przezroczysta i silanizowana replika matrycy PDMS mogą być teraz odklejone od urządzenia i usunięte. Następnie urządzenie jest w pełni utwardzane w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny.
7. W zależności od rodzaju prowadzonego eksperymentu ze stymulacją mechaniczną, do tego urządzenia bazowego można następnie dołączyć dodatkowe warstwy PDMS, powtarzając opisany proces. Szczegóły dotyczące poszczególnych typów eksperymentów ze stymulacją mechaniczną znajdują się w sekcjach C i D.

Złącza

1. Po zakończeniu procesu wykonania urządzenia można użyć igły, aby udrożnić warstwę PDMS w punkcie połączenia.
2. Do połączenia z zewnętrznymi rurkami można następnie zastosować komercyjne konektory, takie jak Nanoport (Upchurch Scientific; Oak Harbor, WA, USA). Aby uniknąć ograniczeń związanych z wysokością komercyjnych konektorów i móc tym samym używać standardowych szalek Petriego jako pojemników na urządzenia, wykonujemy własne elementy zgodnie z poniższą procedurą.
3. Około 35 g PDMS odlewa się i utwardza w tacy wielodołkowej omni-well (Nunc; Rochester, NY, USA). Urządzenie jest odklejane i wycinane w małe sekcje uszczelniające, z których za pomocą wycinaka usuwa się otwór o średnicy 1/8".
4. Do wycięcia sekcji z boku uszczelki używa się stępionej igły 18G. Przed wyjęciem igły 18G, mniejsza igła 21G służy do usunięcia rdzenia centralnego.
5. Około 15 g PDMS odlewa się i utwardza w pokrywie tacy wielodołkowej omni-well, po czym odkleja i wycina w sekcję o podobnej wielkości. Sekcję tę oczyszcza się taśmą klejącą, wiąże plazmowo z górną częścią uszczelki, a następnie cały element wiąże plazmowo z urządzeniem, ustawiając stronę z otworem do dołu.
6. Następnie drugą stępioną igłę 18G oddziela się od kolorowego plastikowego złącza Luer, wprowadza do wyciętego otworu i uszczelnia w miejscu osadzenia kilkoma kroplami PDMS. Powstały konektor jest bardzo skuteczny, ekonomiczny i posiada objętość martwą wystarczająco dużą, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanałów podczas etapów napełniania cieczą.

C. Mechanicznie aktywne podłoża do hodowli 2D

Układ aktualnych mikrofilarów może być wykorzystany do tworzenia różnych profili odkształcenia w zawieszonej błonie polimerowej, na której hodowane są komórki. Uniesienie filara w głąb nasmarowanej błony powoduje jej poślizg i odkształcenie wokół filara. Zastosowanie okrągłego filara obciążającego skutkuje równomiernym dwuosiowym rozkładem odkształceń, jednak konstrukcja ta jest wszechstronna, ponieważ można używać filarów o różnych kształtach w celu tworzenia różnorodnych pól odkształceń. Aby zmodyfikować układ aktualnych dla eksperymentów z hodowlą 2D (schemat na Rysunku 3):

1. Przyklej trzecią warstwę PDMS do urządzenia, jak pokazano na rysunku 3a. Trzecia warstwa PDMS składa się z dwuwarstwowej struktury. Dolne koło odpowiada rozmiarowi komory napędowej pod napędzanymi mikrosłupkami. Średnica górnego koła jest o 100 μm większa od średnicy słupków ładujących. Mikrokanał o szerokości 200 μm łączy te elementy z obszarem przyłącza i będzie służył do smarowania słupków ładujących oraz błony hodowlanej.
2. Wykonaj i przyklej złącza do urządzenia, zgodnie z wcześniejszym opisem.
3. Nanieś metodą spin-coatingu warstwę PDMS o grubości 10-15 μm na gładką stronę folii przezroczystej (parametry wirowania: 4000 RPM, 120 sekund). Utwardzaj w 80 °C przez co najmniej 4 godziny.
4. Zastosuj niskie podciśnienie (pompa aspiracyjna Barnant Air Cadet) do siłowników, obniżając tym samym macierz słupków.
5. Poddaj obróbce plazmowej i przyklej naniosną warstwę PDMS do napędzanego mikrourzadzenia. Umieść na płycie grzejnej w 80 °C przez 10 minut. Słupki i błona hodowlana pozostaną hydrofilowe przez krótki czas.
6. Wypełnij kanały smarne 90% roztworem glicerolu w wodzie dejonizowanej. Poza smarowaniem, ta formulacja pozwala na nieograniczone utrzymanie hydrofilowości PDMS, co redukuje współczynniki tarcia. Pęcherzyki powietrza pozostaną uwięzione między słupkiem a błoną hodowlaną. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w 40 °C i kontynuuj wstrzykiwanie środka smarnego do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza rozproszą się przez PDMS, a wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.
7. Usuń podciśnienie, uwalniając słupki.
8. Za pomocą skalpela przetnij obszar wokół cienkiej błony PDMS. Ostrożnie odklej folię przezroczystą od urządzenia.
9. Przyklej za pomocą plazmy wyciętą ręcznie uszczelkę z PDMS wokół obszaru hodowli urządzenia.
10. Zesterylizuj urządzenie, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie pod bakteriobójczym światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut.
11. Poddaj powierzchnię obróbce plazmowej i inkubuj z 100 μg/mL kolagenu (lub alternatywnego białka ECM) przez noc w 4 °C.
12. Przemyj urządzenie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i zasiaj komórki w zagęszczeniu 10-15000 komórek/cm², zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych.

Szczegółowa charakterystyka działania mikrourządzenia oraz eksperymenty biologiczne przeprowadzone na tej platformie zostały opublikowane w innym opracowaniu⁷.

D. Mechanicznie aktywne hydrożele 3D

Modyfikacje urządzenia mogą zostać również wykorzystane do umożliwienia kompresji fotowzorowanych, zawierających komórki trójwymiarowych hydrożeli w sposób wysokoprzepustowy. W tym przykładzie tworzymy cylindry z hydrożelu z glikolu polietylenowego (PEG) o średnicy 350 μm, enkapsulując mysie mezenchymalne komórki macierzyste C3H10T1/2, a następnie przykładamy odkształcenia ściskające w zakresie od 5 do 25% w obrębie macierzy. Niniejszy protokół można zastosować z bardziej zaawansowaną chemią fotopolimeryzacji hydrożeli. Aby wykorzystać platformę do eksperymentów w zakresie trójwymiarowej mechanobiologii (schemat na Rysunku 4):

Modyfikacje urządzenia:

1. Powłokę słupków nanosi się w postaci warstwy Parylenu-C o grubości 1 μm, aby zmniejszyć przepuszczalność gazów i poprawić czasy polimeryzacji w systemie hydrożelu PEG. Pozwoli to zredukować cytotoksyczne efekty reakcji fotopolimeryzacji opartej na wolnych rodnikach. Do zamaskowania obszarów wokół słupków używa się kawałków taśmy klejącej, a urządzenie jest powlekane w systemie PDS 2010 LabCoter 2 (Specialty Coating Systems; Indianapolis, IN, USA).
2. Powlekone urządzenie wyjmuje się z systemu do powlekania i usuwa taśmę klejącą, pozostawiając konformalną warstwę Parylenu-C na słupkach.
3. Szklaną lamellkę podkrywkową poddaje się metakrylowaniu⁸ poprzez zanurzenie w 2% v/v roztworze 3-(trimetoksyisopropylo) propylmetakrylanu w 95% etanolu przez 2 minuty.
4. Lamellkę płucze się w 100% etanolu, a następnie wygrzewa w temperaturze 100 °C, pozostawiając grupy metakrylowe na powierzchni.
5. Film dystansowy z PDMS o grubości 200 μm odlewa się w szalce Petriego i tnie na małe fragmenty. Cztery z tych fragmentów są łączone za pomocą plazmy wokół krawędzi zmetakrylowanej lamellki.
6. Dystansowce są następnie łączone za pomocą plazmy z obszarami PDMS urządzenia, zakrywając powlekane Parylenem-C słupki.
7. Urządzenie sterylizuje się poprzez przemycie 70% etanolem oraz naświetlanie bakteriobójczym światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut.

In situ polimeryzacja:

Następnie hydrożele PEG zawierające komórki zostały naniesione na urządzenia za pomocą fotolitografii^8,9 w następujący sposób:

1. Przygotować 10% w/v roztwór PEGDA (3,4 kDa, Laysan Bio; Arab, AL, USA) oraz 10% w/v roztwór PEG (8 kDa, Sigma-Aldrich) w suplementowanej pożywce hodowlanej.
2. Przygotować roztwór zapasowy fotoinicjatora o stężeniu 100 mg/mL Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals; Tarrytown, NY, USA) w 1-winylo-2-pirolidynonie.
3. Dokładnie zmieszać oba przygotowane roztwory, aby uzyskać roztwór o stężeniu fotoinicjatora 0,4% w/v. Przefiltrować mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 μm w celu sterylizacji i usunięcia cząstek.
4. Poddać hodowle komórkowe trypsynizacji i przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej, przy dwukrotności pożądanego końcowego stężenia komórek.
5. Zmieszać zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór prekursora hydrożelu/fotoinicjatora w stosunku 1:1.
6. Wstrzyknąć roztwór do mikro urządzenia za pomocą długiej igły 25G. Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza w urządzeniu.
7. Dopasować wydrukowaną maskę transparentną do znaczników wyrównawczych na powierzchni urządzenia. Skonfigurować system naświetlania UV tak, aby zapewnić dawkę UV o natężeniu 17,5 mW/cm² na powierzchni urządzenia. Naświetlać hydrożel przez maskę przez 195 s. Czas ten został zoptymalizowany dla naszego systemu i może wymagać korekty.
8. Wypłukać niezpolymerizowany roztwór prekursora hydrożelu za pomocą PBS, a następnie zastąpić PBS pożywką hodowlaną. Uruchomić słupki ładujące, aby skompresować konstrukcje hydrożelowe.

Szczegółowa charakterystyka działania mikrourządzenia oraz eksperymenty biologiczne przeprowadzone na tej platformie zostały opublikowane w innym opracowaniu¹⁰.

E. Sprzęt peryferyjny

Zmodyfikowane szalki Petriego są wykorzystywane do zachowania sterylności kultur komórkowych podczas aktywacji urządzeń. Stępiona i odarta z izolacji igła 18G jest mocowana za pomocą żywicy epoksydowej w otworze wywierconym w ściance szalki Petriego. Przewody (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, USA) są mocowane na wcisk do tych złączy i podłączone do sterowanych zaworów elektromagnetycznych oraz źródła ciśnienia.

Ciśnienie w urządzeniach jest dostarczane przez zewnętrzne mikropompy. W eksperymentach 2D wartości ciśnienia dodatniego w zakresie 30-55 kPa generowano za pomocą pompy membranowej z mimośrodem sterowanej napięciem (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Niemcy). Do zmiany przyłożonego napięcia w celu kontrolowania ciśnienia wyjściowego zastosowano kontroler napięcia oparty na modulacji szerokości impulsu. Zawory elektromagnetyczne i rozdzielacze (S10MM-30-12-3 oraz MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) służą do tworzenia cyklicznego przebiegu ciśnienia. Zawory są aktywowane sygnałem 12 V, sterowanym przez generator funkcji z przebiegiem prostokątnym.

F. Charakterystyka i zastosowanie urządzenia

Obrazowanie na urządzeniu

Częstym problemem podczas obrazowania komórek lub cząsteczek na urządzeniu jest słaba rozdzielczość optyczna spowodowana kondensacją kropelek pod błoną PDMS wspierającą słupek do ładowania. Kondensacja ta wynika z różnic temperatury i wilgotności wewnątrz inkubatora, po fiksacji lub na stole mikroskopu. Aby rozwiązać ten problem:

1. Podłącz otwarty zbiornik do wlotu ciśnienia i napełnij go wodą dejonizowaną. Dla ułatwienia stosujemy otwartą strzykawkę z łącznikiem Luer-Lock.
2. Umieść urządzenie oraz napełniony zbiornik w komorze próżniowej i wytworzy próżnię.
3. Odczekaj 5 minut, a następnie przywróć w komorze ciśnienie atmosferyczne. Powtórz tę procedurę dwa lub trzy razy. W miarę usuwania powietrza z kanałów urządzenia, zostaje ono zastąpione wodą ze zbiornika, co eliminuje kondensaty kropelkowe i zapewnia przejrzystą drogę optyczną dla mikroskopii.
4. Wykonaj obrazowanie obszarów hodowli, korzystając z mikroskopii w polu jasnym lub fluorescencyjnej.

W przypadku obrazowania żywych komórek procedurę tę można przeprowadzić przed wysianiem komórek na urządzeniach. Kanały muszą być jednak zaprojektowane na tyle duże, aby zapobiec wszelkim lepkim stratom ciśnienia między jednostkami na urządzeniu.

Charakterystyka szczepu za pomocą śledzenia kulek

W odniesieniu do dwuwymiarowych (2D) systemów hodowli:

1. Rozcieńczyć fluorescencyjne kuleczki o średnicy 1 μm (Bangs Laboratories; Fisher, IN) w metanolu do pożądanego stężenia. Dla naszych potrzeb odpowiednie okazały się rozcieńczenia 1:150 z oryginalnych stężeń (1% ciał stałych w buforze do kuleczek).
2. Poddać powierzchnię urządzenia działaniu plazmy, a następnie nanieść 5-10 μL zawiesiny kuleczek.
3. Odczekać do odparowania metanolu. Powtórzyć czynność, jeśli stężenie kuleczek jest zbyt niskie.
4. Wykonać obrazy obszarów hodowli komórkowej w stanie spoczynku oraz pod obciążeniem.
5. Do śledzenia przemieszczeń kuleczek można następnie wykorzystać otwartoźródłowe zautomatyzowane algorytmy śledzenia cząstek w programie ImageJ (NIH).
6. Parametry wielkości, kierunku i lokalizacji przemieszczenia można następnie wykorzystać w modelu matematycznym do charakterystyki pól odkształceń na powierzchni urządzenia.

Podobną procedurę można zastosować do charakterystyki odkształceń w systemach 3D. Do roztworu prekursora hydrożelu należy dodać odpowiednią ilość fluorescencyjnych kuleczek. W przypadku systemu hydrożelu PEG rozmiary porów są znacznie mniejsze niż średnica kuleczek wynosząca 1 μm. Kuleczki zostają zamknięte w hydrożelu, a system można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie można śledzić przemieszczenia kuleczek, analizować je i dopasowywać do modelu deformacji.

G. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne wyniki dotyczące wytwarzania, charakteryzacji i działania urządzenia przedstawiono na rycina 5 i 6.

Rycina 1. Proces wytwarzania formy kanapkowej. (A) Przezroczysta folia narzutowa jest ostrożnie nakładana na nieutwardzony PDMS na matrycy SU-8. (B) Kanapka jest umieszczana w stosie z pianki, szkła i metalu, a następnie utwardzana w piekarniku pod naciskiem. (C) Stos jest rozbierany, a folia odklejana, co pozwala na zachowanie ustrukturyzowanej warstwy PDMS³. Przedrukowano za zgodą Institute of Physics.

Rysunek 2. Schemat mikrofilara z napędem pionowym w stanie (A) spoczynku i (B) podczas aktywacji. (C) Schemat wielowarstwowego procesu fabrykacji wymaganego do stworzenia matrycy mikrofilarów³. Dostosowano za zgodą Institute of Physics.

Rysunek 3. Proces modyfikacji macierzy mikroaktuatorów w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych na odkształcalnym podłożu dwuwymiarowym⁷. Reprodukowano za zgodą Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A.

Rysunek 4. Proces modyfikacji macierzy mikroaktuatorów w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych w trójwymiarowych, fotowzorowanych konstrukcjach hydrożelowych¹⁰. Reprodukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier.

Rycina 5. (A) Przykładowe urządzenie do dwuwymiarowej hodowli mechanostymulowanej. Czerwony barwnik użyty do oznaczenia kanałów dostarczania ciśnienia roboczego, a niebieski barwnik do oznaczenia kanałów smarowania. (B) Przykładowy obraz z eksperymentu charakteryzacji odkształcenia. Czerwone punkty reprezentują niezdeformowane położenie kulek, natomiast zielone punkty reprezentują położenia zdeformowane⁷. Reprodukowano za zgodą Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A.

Rysunek 6. (A) Przykładowe urządzenie do eksperymentów ze ściskaniem 3D. Zielony barwnik użyty do oznaczenia kanałów ciśnienia sterującego. (B) Widok z góry matrycy mikrofilarów z (C) strukturą hydrożelową uformowaną na szczycie filara. (D, E) Zrekonstruowane obrazy boczne fluorescencyjnych kulek w strukturze hydrożelowej przy (D) braku ciśnienia i (E) ciśnieniu sterującym 55 kPa, demonstrujące proces charakterystyki odkształceń w trójwymiarowym systemie hodowli¹⁰. Reprodukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier.

Dyskusja

Mimo że koncepcyjnie jest to proste, wytwarzanie urządzeń wymaga pewnych umiejętności eksperymentalnych i praktyki. Szczególnie w przypadku dwuwymiarowej hodowli komórkowej, dopasowanie wielu warstw w urządzeniu może być trudne, zwłaszcza w przypadku matryc o dużej powierzchni. W praktyce możemy niezawodnie osiągnąć 100% skuteczności dopasowania, stosując urządzenia z tolerancją 50 μm w odstępach między sąsiadującymi elementami w wielu warstwach. Pomyślnie zademonstrowaliśmy również dopasowanie przy tolerancjach tak nisk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw monomeru i sieciowania PDMS Sylgard 184	Dow Corning
matryce SU-8
Odczynnik do silanizacji: (tridekafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan	United Chemical Technologies
Podkładki piankowe			Sklepy z artykułami plastycznymi, grubość 1–2 mm
Przezroczystości do drukarek atramentowych	Duża zabawka
Płytki z pleksiglasu
Ścisk C			sklep z narzędziami
System mikromanipulacyjny	Siskiyou, Inc.
Dedykowany uchwyt próżniowy
System wizyjny, zoom Navitar 12x	Navitar
Łączenie rurek	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
Tępe igły 18G	Small Parts (www.smallparts.com)
Ekscentryczna mikropompa membranowa	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC4,5V DC
Zawory elektromagnetyczne	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
Kolektor elektrozaworów	Pneumadyne	MSV10-1
Generator funkcji
3-(trimetoksyisilylo) propylmetakrylan	Sigma-Aldrich
Diglakrylan glikolu polietylenowego 3,4 kDa	Laysan Bio Inc.
Glikol polietylenowy 8 kDa	Sigma-Aldrich
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-winylo-2-pirolidynon	Sigma-Aldrich
Standardowe odczynniki do hodowli komórkowych