W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Możliwość systematycznego badania odpowiedzi komórkowej in vitro na kombinacje bodźców mechanobiologicznych w inżynierii tkankowej, poszukiwaniu nowych leków lub w fundamentalnych badaniach biologii komórki jest ograniczona przez obecne technologie bioreaktorów, które nie pozwalają na jednoczesne przykładanie różnorodnych bodźców mechanicznych do hodowanych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię mikrofabrykowanych platform zaprojektowanych do przesiewowego badania efektów bodźców mechanicznych w formacie wysokoprzepustowym. W niniejszym protokole demonstrujemy wykonanie macierzy mikroaktuatorów z pionowo przemieszczanymi słupkami, na której oparta jest ta technologia, a następnie pokazujemy, w jaki sposób technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodowli komórkowych w paradygmatach hodowli dwu- i trójwymiarowych.
Protokół
A. Opis i zasada działania urządzenia
Urządzenia są wytwarzane z wykorzystaniem wielowarstwowej litografii miękkiej1 w polidimetylosiloksanie (PDMS) i umożliwiają jednoczesne generowanie szeregu warunków mechanicznych w poszczególnych lokalizacjach hodowli komórkowych w obrębie mikrofabrykowanej macierzy. W niniejszym protokole w pierwszej kolejności opisano etapy wytwarzania macierzy pneumatycznie sterowanych mikrosłupków, a następnie kroki modyfikacji urządzenia w celu umożliwienia dynamicznej hodowli mechanicznej zarówno w dwuwymiarowym (2D), jak i trójwymiarowym (3D) paradygmacie hodowli. Przedstawione podejście mikrofabrykacyjne zwiększa przepustowość w porównaniu z istniejącymi systemami w skali makro i najlepiej nadaje się do przesiewania efektów różnorodnych warunków mechanicznych.
Zasada działania urządzenia opiera się na matrycy pionowo aktualizowanych mikrosłupków. Mikrosłupki są wytwarzane na swobodnie zawieszonej membranie i są podnoszone oraz opuszczane poprzez przyłożenie dodatniego i ujemnego ciśnienia pod membraną sterującą (Rycina 1). Kluczową cechą matrycy jest to, że dzięki zmianie rozmiaru membrany sterującej, pojedyncze źródło ciśnienia może zostać wykorzystane do uzyskania zakresu przemieszczeń pionowych w obrębie całej matrycy. Zasada ta jest stosowana do szybkiego przesiewania odpowiedzi komórkowych na dużą liczbę mechanicznych warunków stymulacyjnych w obrębie jednego urządzenia.
W oparciu o analogiczną konstrukcję w skali makro opracowaną przez Schaffera et al.2, nasza konstrukcja zawiera drugą zawieszoną i nasmarowaną błonę hodowli komórkowej nad słupkiem, co pozwala komórkom doświadczać odkształcenia podłoża 2D w momencie, gdy błona hodowlana przesuwa się nad wyniesionym słupkiem obciążającym. Alternatywnie, fotolitograficzne uformowanie matrycy hydrożeli z zawieszonymi komórkami nad słupkami obciążającymi umożliwia stymulację kompresyjną komórek w hodowli 3D. Poniżej znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania tych systemów.
B. Wytwarzanie matrycy pneumatycznych mikroaktuatorów
Wytwarzanie matrycy pneumatycznych mikroaktuatorów wymaga precyzyjnego wyrównania w wielowarstwowych strukturach PDMS. Jest to trudne ze względu na błędy rejestracji wyrównania spowodowane skurczem materiału. Aby rozwiązać ten problem, stosujemy proces wytwarzania określany jako „sandwich mold fabrication”3, który okazał się skuteczny w eliminowaniu tego problemu4.
Przygotowanie materiałów
- W warunkach cleanroomu, zgodnie ze standardowymi procedurami, wytwarza się jedno- lub wielopoziomowe matryce z SU-8 dla każdego z poszczególnych poziomów. W przypadku tych urządzeń grubość matryc wynosi 200-400 μm, w zależności od zastosowania. Przed użyciem matryce są poddawane wygrzewaniu (hardbake) w temperaturze 80 °C przez trzy dni.
- Czyste szkiełka przedmiotowe oraz matryce z SU-8 są silanizowane w komorze próżniowej, aby zapobiec przyleganiu utwardzanego PDMS do materiałów. W dygestorium 60 μL środka silanizującego (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (United Chemical Technologies, Bristol, PA) przenosi się pipetą do szalki Petriego znajdującej się w komorze. Niepowlekane szkło oraz matryce z SU-8 umieszcza się w komorze i pozostawia pod próżnią na całą noc.
- Dwa pady z pianki (dostępne w sklepach z artykułami plastycznymi) oraz folię do drukarki atramentowej wycina się w rozmiarach nieco większych niż matryca z SU-8 wykorzystywana do wykonania formy kanapkowej.
Wykonanie formy warstwowej
- Każda warstwa urządzenia wielowarstwowego wymaga warstwy PDMS uformowanej za pomocą tej metody. Schemat procesu tworzenia formy kanapkowej przedstawiono na Rysunku 1.
- Monomer PDMS i utwardzacz są dokładnie zmieszane w standardowym stosunku 10:1. 3 mL nieutwardzonej mieszaniny PDMS nanosi się na wcześniej przygotowaną matrycę SU-8, a następnie odgazowuje w komorze próżniowej.
- Podkładkę z pianki i matrycę SU-8 umieszcza się na pleksiglasowej płycie podstawy.
- Folię przezroczystą ostrożnie opuszcza się na nieutwardzony PDMS, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Folie do drukarek atramentowych mają stronę chropowatą i gładką; ważne jest, aby to strona gładka stykała się z nieutwardzonym PDMS.
- Zsilanizowane szkiełko przedmiotowe kładzie się na folii przezroczystej, pod drugą podkładką z pianki i pleksiglasową płytą górną. Całość konstrukcji zaciska się następnie za pomocą zacisku śrubowego.
- Kanapkę z PDMS utwardza się w piekarniku w temperaturze 80 °C przez co najmniej 4 godziny.
- Kanapkę wyjmuje się z piekarnika i pozostawia do ostygnięcia przed zdjęciem zacisku.
- Zacisk zostaje zdjęty, a konstrukcja rozłożona, natomiast podkładki z pianki są usuwane. Folię przezroczystą ostrożnie oddziela się od matrycy SU-8, zachowując strukturyzowaną warstwę PDMS.
- Te ustrukturyzowane warstwy PDMS wraz z warstwami folii do manipulacji można następnie przechowywać w środowisku wolnym od kurzu do momentu ich użycia. Z powodzeniem stosowaliśmy warstwy PDMS o wieku do dwóch miesięcy, nie obserwując żadnych zauważalnych szkodliwych efektów.
Budowa urządzenia wielowarstwowego
Schemat wykonania matrycy mikroaktuatorów przedstawiono na Rysunku 2A, a działanie aktuatorów ukazano na Rysunkach 2B i C. Aby wykonać urządzenie:
- Najniższa ustrukturyzowana warstwa PDMS jest przygotowywana metodą formowania kanapkowego. W tych eksperymentach zastosowano wzory okrągłe o średnicach od 600 do 1200μm.
- Następnie warstwa PDMS jest przenoszona na czysty szkiełko przedmiotowe. Do obróbki powierzchni PDMS i szkła plazmą tlenową wykorzystuje się jednostkę wyładowań koronowych, a następnie obie powierzchnie doprowadza się do kontaktu. Stos zostaje umieszczony na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C, aby zakończyć proces wiązania. Folia przezroczysta może zostać następnie odklejona i usunięta. Podczas tego procesu ustrukturyzowana błona PDMS nigdy nie jest oddzielana od sztywnego podłoża, co zapobiega kurczeniu się poszczególnych warstw.
- W zależności od powodzenia etapu formowania kanapkowego, może zajść konieczność usunięcia cienkich warstw PDMS, które nie zostały wyciśnięte spośród struktur SU-8 i folii przezroczystej. Można to wykonać ręcznie za pomocą igły 25G pod stereoskopem.
- Druga warstwa formowana kanapkowo jest tworzona jako negatywowa forma replikacyjna pożądanej struktury membrany i słupka. Wynika to z faktu, że wykonanie matryc SU-8 o dużej powierzchni jest trudne, jednak zastosowanie alternatywnych procesów wytwarzania mogłoby wyeliminować ten dodatkowy krok. W tej demonstracji zastosowano okrągłe słupki o średnicy 500 μm. Negatywowa forma replikacyjna jest silanizowana i tymczasowo mocowana do szkiełka przedmiotowego za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Nieutwardzony PDMS jest nanoszony, odgazowywany i rozprowadzany metodą spin-coatingu na tę warstwę formy kanapkowej przez 45 sekund przy 1000 RPM, co daje membranę aktywacyjną o grubości 60 μm. Warstwa PDMS naniesiona metodą spin-coatingu jest częściowo utwardzana w temperaturze 80 °C przez ok. 20 minut lub do momentu, gdy PDMS stanie się lepki, ale nie odkształca się trwale pod wpływem dotyku.
- Szkiełko przedmiotowe i dwustronna taśma są usuwane z częściowo utwardzonej warstwy PDMS, która jest następnie poddawana obróbce plazmą, odwracana i umieszczana w specjalnie wykonanym pozycjonerze. Pozycjoner składa się z uchwytu próżniowego zamontowanego na mikromanipulatorze (Siskiyou; Mission Viego, CA, USA). Pierwsza warstwa PDMS jest następnie poddawana obróbce plazmą i umieszczana na stole obrotowym (Newmark, Grants Pass, OR, USA), pod uchwytem próżniowym, a wyrównanie obu warstw jest obserwowane przy użyciu systemu wizyjnego Navitar 12x zoom (Navitar; Rochester, NY, USA).
- Warstwy są wyrównywane za pomocą manipulatora i ostrożnie doprowadzane do kontaktu. Tak przygotowany stos jest następnie usuwany z pozycjonera i utwardzany w piecu w temperaturze 80 °C przez kolejne 30 minut. Folia przezroczysta oraz silanizowana forma replikacyjna z PDMS mogą być następnie odklejone od urządzenia i usunięte. Urządzenie jest następnie w pełni utwardzane w temperaturze 80 °C przez co najmniej cztery godziny.
- W zależności od rodzaju prowadzonego eksperymentu stymulacji mechanicznej, do tego urządzenia bazowego można wówczas dołączyć dodatkowe warstwy PDMS, powtarzając opisany proces. Szczegóły dotyczące różnych rodzajów eksperymentów stymulacji mechanicznej znajdują się w sekcjach C i D.
Złącza
- Po ukończeniu urządzenia można użyć igły, aby udrożnić warstwę PDMS w punkcie połączenia.
- Następnie do połączenia z zewnętrznymi rurkami można użyć komercyjnych złączy, takich jak Nanoport (Upchurch Scientific; Oak Harbor, WA, USA). Aby uniknąć wymagań dotyczących wysokości komercyjnych złączy i tym samym móc stosować standardowe szalki Petriego jako pojemniki dla urządzenia, wykonujemy własne złącza w następujący sposób.
- Około 35 g PDMS jest odlewane i utwardzane w tacy wielodobowej (Nunc; Rochester, NY, USA). Urządzenie jest oddzielane, a następnie wycinane w małe sekcje uszczelek, z których za pomocą dziurkacza wycina się otwór o średnicy 1/8".
- Używa się stępionej igły 18G do wycięcia sekcji z boku uszczelki. Przed wycofaniem igły 18G używa się mniejszej igły 21G do usunięcia centralnego rdzenia.
- Około 15 g PDMS jest odlewanych i utwardzanych w pokrywie tacy wielodobowej, następnie oddzielanych i wycinanych w sekcje o podobnej wielkości. Sekcja ta jest czyszczona taśmą klejącą, wiązana plazmowo z górą uszczelki, a następnie cały moduł jest wiązany plazmowo z urządzeniem, stroną z otworem skierowaną w dół.
- Następnie drugą stępioną igłę 18G oddziela się od kolorowego plastikowego złącza Luer, wprowadza do wyciętego otworu i uszczelnia w tym miejscu kilkoma kroplami PDMS. Powstałe złącze jest bardzo skuteczne, ekonomiczne i posiada objętość przestrzeni martwej wystarczająco dużą, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanałów podczas etapów napełniania cieczą.
C. Mechanicznie aktywne podłoża do hodowli 2D
Układ aktualnych mikrosłupków może być wykorzystany do tworzenia różnych profili odkształceń w zawieszonej błonie polimerowej, na której hodowane są komórki. Podniesienie słupka w obszar nasmarowanej błony powoduje jej poślizg i odkształcenie wokół słupka. Zastosowanie okrągłego słupka obciążającego skutkuje równomiernym rozkładem odkształceń dwuosiowych, jednak konstrukcja ta jest wszechstronna, ponieważ można użyć słupków o różnych kształtach w celu stworzenia zróżnicowanych pól odkształceń. Aby zmodyfikować układ aktuatorów do eksperymentów z hodowlą 2D (schemat na Rysunku 3):
- Przyklej trzecią warstwę PDMS do urządzenia, jak pokazano na rysunku 3a. Trzecia warstwa PDMS składa się z dwuwarstwowej struktury. Dolne koło odpowiada rozmiarowi wnęki sterującej znajdującej się pod sterowanymi mikrosłupkami. Średnica górnego koła jest o 100 μm większa od średnicy słupków ładujących. Mikrokanał o szerokości 200 μm łączy te elementy z obszarem przyłącza i będzie służył do smarowania słupków ładujących oraz filmu hodowlanego.
- Wytwórz i przyklej złącza do urządzenia, zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Nanieś metodą spin coatingu warstwę PDMS o grubości 10-15 μm na gładką stronę folii przezroczystej (parametry wirowania: 4000 RPM, 120 sekund). Utwardzaj w temperaturze 80 °C przez co najmniej 4 godziny.
- Zastosuj niskie podciśnienie (pompa aspiracyjna Barnant Air Cadet) do elementów sterujących, obniżając tym samym układ słupków.
- Poddaj obróbce plazmą i przyklej naniesioną metodą spin coatingu folię PDMS do sterowanego mikrourządzenia. Umieść na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 10 minut. Słupki i film hodowlany pozostaną hydrofilowe przez krótki czas.
- Wypełnij kanały smarne 90% roztworem glicerolu w wodzie dejonizowanej. Oprócz smarowania, ta formulacja utrzymuje hydrofilowość PDMS w nieskończoność, redukując współczynniki tarcia. Pęcherzyki powietrza pozostaną uwięzione między słupkami a filmem hodowlanym. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 40 °C i kontynuuj wtryskiwanie środka smarnego do kanału, powodując niewielki wzrost ciśnienia. Po kilku minutach pęcherzyki powietrza rozprzestrzenią się przez PDMS, a wszystkie powierzchnie zostaną nasmarowane.
- Usuń podciśnienie, uwalniając słupki.
- Za pomocą skalpela przetnij obszar wokół cienkiej folii PDMS. Ostrożnie oddziel podkład z folii przezroczystej od urządzenia.
- Przyklej za pomocą plazmy ręcznie wyciętą uszczelkę z PDMS wokół obszaru hodowlanego urządzenia.
- Zsterylizuj urządzenie, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie pod bakteriobójczym światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut.
- Poddaj powierzchnię obróbce plazmą i inkubuj z 100 μg/mL kolagenu (lub alternatywnego białka ECM) przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przepłucz urządzenie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i wysiej komórki w zagęszczeniu 10-15000 komórek/cm2, zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych.
Szczegółowa charakterystyka działania mikrourządzenia oraz eksperymenty biologiczne przeprowadzone na tej platformie zostały opublikowane w innym miejscu7.
D. Mechanicznie aktywne hydrożele 3D
Modyfikacje urządzenia mogą zostać również wykorzystane do umożliwienia kompresji fotowzorowanych, trójwymiarowych hydrożeli zawierających komórki w sposób wysokoprzepustowy. W tym przykładzie tworzymy cylindry z hydrożelu z glikolu polietylenowego (PEG) o średnicy 350 μm, w których zamknięte są mysie mezenchymalne komórki macierzyste C3H10T1/2, a następnie przykładamy odkształcenia kompresyjne w zakresie od 5 do 25% w obrębie całej matrycy. Protokół ten można zastosować z bardziej zaawansowaną chemią fotopolimeryzacji hydrożeli. Aby wykorzystać platformę do eksperymentów w zakresie trójwymiarowej mechanobiologii (schemat na rysunku 4):
Modyfikacje urządzenia:
- Pokryć słupki warstwą Parylenu-C o grubości 1 μm, aby zmniejszyć przepuszczalność gazów i poprawić czas polimeryzacji w systemie hydrożelu PEG. Pozwoli to ograniczyć działanie cytotoksyczne reakcji fotopolimeryzacji opartej na wolnych rodnikach. Do zamaskowania obszarów wokół słupków należy użyć kawałków taśmy klejącej, a urządzenie pokryć w systemie PDS 2010 LabCoter 2 (Specialty Coating Systems; Indianapolis, IN, USA).
- Wyjąć pokryte urządzenie z systemu napylania i odkleić taśmę, pozostawiając konformalną warstwę Parylenu-C na słupkach.
- Szklaną lamellkę podkrywkową zmetykrylować8 poprzez zanurzenie w 2% v/v roztworze 3-(trimetoksysilylo)propylometakrylanu w 95% etanolu przez 2 minuty.
- Przepłukać lamellkę w 100% etanolu i wyprać w temperaturze 100 °C, aby na powierzchni pozostały grupy metakrylanowe.
- W szalce Petriego odlać folię dystansową z PDMS o grubości 200 μm i pociąć ją na małe fragmenty. Cztery z tych fragmentów należy przykleić za pomocą plazmy wokół krawędzi zmetykrylowanej lamellki.
- Dystansowicze należy następnie przykleić za pomocą plazmy do obszarów PDMS urządzenia, zakrywając słupki pokryte Parylenem-C.
- Urządzenie wysterylizować poprzez mycie w 70% etanolu oraz naświetlanie bakteriobójczym światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut.
In situ polimeryzacja:
Następnie hydrożele PEG z zatopionymi komórkami zostały naniesione na urządzenia za pomocą fotolitografii8,9 w następujący sposób:
- Przygotować 10% w/v roztwór PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio; Arab, AL, USA) oraz 10% w/v roztwór PEG (8kDa, Sigma-Aldrich) w nieuzupełnionej pożywce do hodowli komórkowej.
- Przygotować roztwór zapasowy fotoinicjatora o stężeniu 100 mg/mL Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals; Tarrytown, NY, USA) w 1-winylo-2-pirolidynonie.
- Dokładnie zmieszać oba przygotowane roztwory, aby uzyskać roztwór o stężeniu 0,4% w/v fotoinicjatora. Przefiltrować mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 μm w celu sterylizacji i usunięcia cząstek stałych.
- Poddać hodowle komórkowe trypsynizacji i przygotować zawiesinę komórkową w pożywce hodowlanej o dwukrotnie większym stężeniu komórek niż docelowe stężenie końcowe.
- Zmieszać zawiesinę komórkową i przefiltrowany roztwór prekursora hydrożelu/fotoinicjatora w stosunku 1:1.
- Wstrzyknąć roztwór do mikrourządzenia za pomocą długiej igły 25G. Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza w urządzeniu.
- Dopasować wydrukowaną maskę z folii przezroczystej do znaczników wyrównawczych na powierzchni urządzenia. Skonfigurować system naświetlania UV tak, aby zapewnić dawkę UV rzędu 17,5 mW/cm2 na powierzchni urządzenia. Naświetlać hydrożel przez maskę przez 195 s. Czas ten został zoptymalizowany dla naszego systemu i może wymagać dostosowania.
- Wypłukać niepolimeryzowany roztwór prekursora hydrożelu za pomocą PBS, a następnie zastąpić PBS pożywką hodowlaną. Aktywować słupki dociskowe, aby skompresować konstrukty hydrożelowe.
Szczegółowa charakterystyka działania mikrourządzenia oraz przeprowadzonych na tej platformie eksperymentów biologicznych została opublikowana w innym opracowaniu10.
E. Urządzenia peryferyjne
Zmodyfikowane szalki Petriego są wykorzystywane do utrzymania sterylności kultur komórkowych podczas uruchamiania urządzeń. Stępiona i pozbawiona ścięcia igła 18G jest mocowana żywicą epoksydową w otworze wywierconym w ściance szalki Petriego. Przewody (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, USA) są mocowane na wcisk do tych złączy, a następnie podłączone do sterowanych elektrozaworów oraz źródła ciśnienia.
Ciśnienie w urządzeniach jest dostarczane przez zewnętrzne mikropompy. W eksperymentach 2D wartości nadciśnienia w zakresie 30-55 kPa generowano za pomocą pompy membranowej z mimośrodem sterowanej napięciem (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Niemcy). Do zmiany przyłożonego napięcia w celu kontroli ciśnienia wyjściowego zastosowano kontroler napięcia oparty na modulacji szerokości impulsu. Zawory elektromagnetyczne i rozdzielacze (S10MM-30-12-3 oraz MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) służą do tworzenia cyklicznego przebiegu ciśnienia. Zawory są uruchamiane sygnałem 12 V, sterowanym przez generator funkcji prostokątnych.
F. Charakterystyka i zastosowanie urządzenia
Obrazowanie na urządzeniu
Częstym problemem podczas obrazowania komórek lub cząsteczek na urządzeniu jest słaba rozdzielczość optyczna spowodowana kondensacją kropelek pod błoną PDMS wspierającą słupek ładujący. Kondensacja ta wynika z różnic temperatury i wilgotności wewnątrz inkubatora, a także po utrwaleniu lub na stoliku mikroskopu. Aby rozwiązać ten problem:
- Podłącz otwarty zbiornik do portu wlotowego ciśnienia i napełnij go wodą dejonizowaną. Dla wygody stosujemy otwartą strzykawkę z łącznikiem Luer-lock.
- Umieść urządzenie oraz napełniony zbiornik w komorze próżniowej i odessaj powietrze.
- Odczekaj 5 minut, a następnie przywróć w komorze ciśnienie atmosferyczne. Powtórz tę czynność dwa lub trzy razy. W miarę usuwania powietrza z kanałów urządzenia, jest ono zastępowane wodą ze zbiornika, co eliminuje kondensację kropel i zapewnia przejrzystą drogę optyczną dla mikroskopii.
- Wykonaj obrazowanie obszarów hodowli za pomocą mikroskopii w jasnym polu lub mikroskopii fluorescencyjnej.
W przypadku obrazowania żywych komórek procedurę tę można przeprowadzić przed wysianiem komórek na urządzenia. Kanały muszą być jednak zaprojektowane na tyle duże, aby zapobiec wszelkim lepkim stratom ciśnienia między jednostkami na urządzeniu.
Charakterystyka szczepów za pomocą śledzenia kulek
W odniesieniu do dwuwymiarowych (2D) systemów hodowli:
- Rozcieńczyć fluorescencyjne kulki o średnicy 1 μm (Bangs Laboratories; Fisher, IN) w metanolu do pożądanego stężenia. Stwierdzono, że rozcieńczenia 1:150 z oryginalnych stężeń (1% ciał stałych w roztworze buforowym do kulek) są odpowiednie dla naszych potrzeb.
- Poddać powierzchnię urządzenia działaniu plazmy, a następnie nanieść 5-10 μL zawiesiny kulek.
- Odczekać do odparowania metanolu. Powtórzyć czynność, jeśli stężenie kulek jest zbyt niskie.
- Wykonać obrazy obszarów hodowli komórkowej w stanie spoczynku oraz pod obciążeniem.
- W programie ImageJ (NIH) można następnie wykorzystać otwartoźródłowe zautomatyzowane algorytmy śledzenia cząstek do monitorowania przemieszczeń kulek.
- Parametry wartości, kierunku i lokalizacji przemieszczenia można następnie wykorzystać w modelu matematycznym do charakterystyki pól odkształceń na powierzchni urządzenia.
Podobną procedurę można zastosować do charakterystyki odkształceń w systemach 3D. Do roztworu prekursora hydrożelu należy dodać odpowiednią ilość fluorescencyjnych kulek. W przypadku systemu hydrożelu PEG rozmiary porów są znacznie mniejsze niż średnica kulek wynosząca 1 μm. Kulki zostają zamknięte w hydrożelu, a system można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie można śledzić przemieszczenia kulek, analizować je i dopasować do modelu odkształceń.
G. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne wyniki wytwarzania, charakterystyki i działania urządzenia przedstawiono na rysunkach 5 i 6.
Rycina 1. Proces wytwarzania formy kanapkowej. (A) Przezroczystą folię nakłada się ostrożnie na nieutwardzony PDMS na matrycy SU-8. (B) Kanapkę umieszcza się w stosie z pianki, szkła i metalu, a następnie utwardza w piecu pod naciskiem. (C) Stos zostaje rozmontowany, a folia odklejona, co pozwala na zachowanie ustrukturyzowanej warstwy PDMS3. Powielono za zgodą Institute of Physics.
Rycina 2. Schemat mikrosłupka z napędem pionowym w stanie (A) spoczynku oraz (B) podczas aktywacji. (C) Schemat wielowarstwowego procesu fabrykacji niezbędnego do wytworzenia macierzy mikrosłupków3. Adaptacja za zgodą Institute of Physics.
Rysunek 3. Proces modyfikacji macierzy mikroaktuatorów w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych na odkształcalnym podłożu dwuwymiarowym7. Reprodukowano za zgodą Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A.
Rycina 4. Proces modyfikacji macierzy mikroaktuatorów w celu przeprowadzenia eksperymentów na komórkach hodowanych w trójwymiarowych, fotowzorowanych konstrukcjach hydrożelowych10. Reprodukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Rycina 5. (A) Przykładowe urządzenie do dwuwymiarowej (2D) hodowli mechanostymulacyjnej. Czerwony barwnik został użyty do oznaczenia kanałów dostarczania ciśnienia aktywującego, a niebieski barwnik do oznaczenia kanałów smarujących. (B) Przykładowy obraz z eksperymentu charakteryzacji odkształcenia. Czerwone kropki reprezentują niedeformowane położenie kulek, natomiast zielone kropki reprezentują położenia zdeformowane7. Powielone za zgodą Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A.
Rysunek 6. (A) Przykładowe urządzenie do eksperymentów z kompresją 3D. Zielony barwnik użyty do oznaczenia kanałów ciśnienia aktywującego. (B) Widok z góry na macierz mikrofilarów z (C) konstruktem hydrożelowym ukształtowanym na szczycie filaru. (D, E) Zrekonstruowane obrazy boczne fluorescencyjnych kulek w konstrukcie hydrożelowym przy (D) spoczynku i (E) ciśnieniu aktywującym 55 kPa, demonstrujące proces charakteryzacji odkształcenia w systemie hodowli 3D10. Reprodukowano za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mimo że koncepcyjnie jest to proste, wytwarzanie urządzeń wymaga pewnych umiejętności eksperymentalnych i praktyki. Szczególnie w przypadku dwuwymiarowej hodowli komórkowej, dopasowanie wielu warstw w urządzeniu może być trudne, zwłaszcza w przypadku matryc o dużej powierzchni. W praktyce możemy niezawodnie osiągnąć 100% skuteczności dopasowania, stosując urządzenia z tolerancją 50 μm w odstępach między sąsiadującymi elementami w wielu warstwach. Pomyślnie zademonstrowaliśmy również dopasowanie przy tolerancjach tak nisk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Przyznajemy, że otrzymaliśmy wsparcie finansowe z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Canadian Institutes of Health Research (CHRPJ 323533-06), z programu Ontario Graduate Scholarship dla CM, a także z programu Canada Research Chairs w zakresie Micro and Nano Engineering Systems dla YS oraz w zakresie Mechanobiology dla CAS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw monomeru i sieciowania PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| matryce SU-8 | |||
| Odczynnik do silanizacji: (tridekafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan | United Chemical Technologies | ||
| Podkładki piankowe | Sklepy z artykułami plastycznymi, grubość 1–2 mm | ||
| Przezroczystości do drukarek atramentowych | Duża zabawka | ||
| Płytki z pleksiglasu | |||
| Ścisk C | sklep z narzędziami | ||
| System mikromanipulacyjny | Siskiyou, Inc. | ||
| Dedykowany uchwyt próżniowy | |||
| System wizyjny, zoom Navitar 12x | Navitar | ||
| Łączenie rurek | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Tępe igły 18G | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Ekscentryczna mikropompa membranowa | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4,5V DC | |
| Zawory elektromagnetyczne | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Kolektor elektrozaworów | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Generator funkcji | |||
| 3-(trimetoksyisilylo) propylmetakrylan | Sigma-Aldrich | ||
| Diglakrylan glikolu polietylenowego 3,4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Glikol polietylenowy 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-winylo-2-pirolidynon | Sigma-Aldrich | ||
| Standardowe odczynniki do hodowli komórkowych |
Bibliografia
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
- Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
- Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
- Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
- Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
- Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
