Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.
Artykuł metodologiczny
Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu wygenerowania komórek iPS 1-3 o właściwościach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenny nowy zasób komórek pluripotencjalnych do celów poszukiwania nowych leków, terapii komórkowej oraz badań podstawowych.
Pożywki i odczynniki GIBCO od lat znajdują się w centrum badań nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Pożywka Knockout DMEM uzupełniona o Knockout Serum Replacement jest preferowanym medium do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a obecnie także do hodowli komórek iPS 3-9. Ten złoty standard systemów pożywek może być teraz stosowany w hodowlach bez użycia komórek karmionek dzięki dodatkowi Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają zastosowania warstw wspierających (feeder layers) z fibroblastów mysich lub ludzkich, bądź pożywki warunkowanej przez komórki wspierające. Metody te są pracochłonne, trudne do skalowania, a utrzymanie komórek hiPS w stanie niezróżnicowanym jest utrudnione ze względu na nieokreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała Knockout SR Growth Factor Cocktail, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórek hiPS na systemy bezwarstwowe (feeder-free), przy jednoczesnym zachowaniu możliwości stosowania Knockout SR.
Protokół
Uwaga: Aby zachować sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w niniejszym protokole są wykonywane zgodnie z zasadami sterylności laboratoryjnej i przeprowadzane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie podłoża są wyrównane do temperatury 37°C i odpowiednio napowietrzone.
Przygotowanie naczyń hodowlanych powlekanych Geltrexem
Uwaga: w kwestii stosowania naczyń hodowlanych pokrytych CELLstart należy zapoznać się z załącznikiem
- Powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex (1 mL) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w 99 mL Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszać roztwór.
Uwaga: Niektóre linie komórek iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex dla optymalnego wzrostu. Alternatywne rozcieńczenia znajdują się w załączniku. - Pokryć całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex (1 mL dla szalki 35-mm, 1,5 mL dla szalki 60-mm).
- Uszczelnić każdą szalkę Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
Uwaga: Na tym etapie szalki hodowlane pokryte Geltrex można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. Każdą szalkę należy uszczelnić Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrex. - Przed użyciem przenieść szalki pokryte Geltrex do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozostawić do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej (około 1 godziny).
Przygotowanie pożywki KnockOut SR Medium do hodowli bezkarmiących
- Aby przygotować 1 mL roztworu Basic FGF o stężeniu 10 μg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy.
Basic FGF 10 μg D-PBS 990 μL 10% BSA 10 μL
Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu. - Aby przygotować 50 mL roztworu Dispase o stężeniu 2 mg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór poddać sterylizacji przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
Dispase 100 mg D-PBS 50 mL - Aby przygotować 100 mL kompletnego pożywki KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), aseptycznie połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli.
Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.Składnik Stężenie roztworu stokowego Stężenie końcowe Objętość Knockout DMEM/F12 (Kat. nr 12660-012) - 1X 76.8 mL GlutaMAX -I (Kat. nr 35050-061) 200 mM 2 mM 1 mL KnockOut SR (Kat. nr 10828-028) - 20% 20 mL KnockOut SR-GFC (Kat. nr A10580-01) 50X 1X 2 mL bFGF (Kat. nr PHG0024) 10 μg/mL 20 ng/mL 200 μL - Bezpośrednio przed wyrównaniem temperatury i składu gazowego kompletnej pożywki, aseptycznie dodać wymaganą objętość 2-merkaptoetanolu (stężenie stokowe 55 mM), aby uzyskać stężenie końcowe 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 mL pożywki KSR-FF, należy dodać 182 μL 2-merkaptoetanolu o stężeniu 55 mM (rozcieńczenie 1:550). Alternatywnie, 2-merkaptoetanol można dodać do kompletnej pożywki 1X i przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.
Adaptacja iPSC do pożywki KSR-FF
- Przed rozpoczęciem pracy doprowadzić naczynia pokryte Geltrexem do temperatury pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Kulturować iPSC na komórkach karmicielskich MEF do momentu osiągnięcia 70-80% konfluencji. Protokoły hodowli na MEF znajdują się w podręczniku GIBCO Mouse Embryonic Fibroblast.
- Podgrzać wymaganą objętość Dyspazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
- Podgrzać wymaganą objętość KSR-FF w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
- Odssać medium z naczyń hodowlanych i dodać odpowiednią ilość roztworu Dyspazy. Inkubować naczynia w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.
- Odssać roztwór Dyspazy z każdego naczynia hodowlanego i delikatnie wypłukać komórki karmicielskie MEF za pomocą D-PBS (2 do 3 razy).
- Dodać do każdego naczynia hodowlanego odpowiednią ilość kompletnego medium KnockOut SR. Użyć skrobaczki do komórek lub pipety 5 mL, aby delikatnie zdrapać komórki z powierzchni naczynia hodowlanego.
Uwaga: alternatywne protokoły adaptacji dla linii komórkowych iPS trudnych do adaptacji znajdują się w aneksie. - Zebrać zawiesinę komórkową z każdego naczynia hodowlanego do oddzielnych stożkowych probówek 15 mL. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością kompletnego medium KnockOut SR, a medium z płukania D-PBS dodać do probówek stożkowych 15 mL zawierających zawiesinę komórkową. Należy uważać, aby nie rozbić agregatów komórkowych na pojedyncze komórki.
- Wirować probówki stożkowe 15 mL przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia iPSC.
- Odssać nadsącz z osadu iPSC. Resuspendować osad w odpowiedniej ilości medium KSR-FF zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia (Tabela 1). Nie rozbijać agregatów komórkowych na mniejsze fragmenty, ponieważ mniejsze agregaty słabo przylegają do powierzchni.
Uwaga: Zaleca się współczynnik rozcieńczenia 1:2 przez pierwsze 3 pasażowania po przeniesieniu iPSC bezpośrednio z medium hodowlanego iPSC MEF do medium KSR-FF. Zazwyczaj odpowiedni jest współczynnik rozcieńczenia od 1:3 do 1:5, jednak pasażowanie w stosunku 1:2 zapewnia wyższą gęstość komórek niezbędną podczas adaptacji do hodowli bezkomórkowej (feeder-free). - Przed wysianiem iPSC na naczynia pokryte Geltrexem, odessać pozostały roztwór Geltrexu z uprzednio pokrytego naczynia i powoli dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdego naczynia hodowlanego. Uwaga: nie płukać naczyń przed wysianiem.
- Przesuwać naczynie hodowlane przód-tył i na boki kilka razy, aby rozprowadzić komórki po całej powierzchni naczynia. Ostrożnie umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze 37°C w atmosferze uwilgotnionej z dodatkiem 4 do 6% CO2 w powietrzu. Wymieniać zużyte medium na KSR-FF każdego dnia.
Pasażowanie ludzkich komórek iPS z użyciem KSR-FF
- Obserwuj ludzkie iPSC rosnące w pełnym KSR-FF pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki osiągnęły 70-80% konfluencji i są gotowe do pasażowania. Zob. Rysunek 1.
Uwaga: Jeśli kolonie staną się zbyt gęste lub zbyt duże, dojdzie do zwiększonej różnicowania. - Przed pasażowaniem hodowli wytnij i usuń wszelkie zróżnicowane kolonie iPSC.
- Podgrzej wymaganą objętość Dispase w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
- Wstępnie wyrównaj temperaturę wymaganej objętości KSR-FF w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
- Odssij zużyte medium z naczynia hodowlanego za pomocą pipety i przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą D-PBS.
- Ostrożnie dodaj podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 mL roztworu Dispase na 60-mm płytkę hodowlaną). Zakręć naczyniem, aby pokryć całą powierzchnię komórek.
- Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.
- Wyjmij naczynie z inkubatora, odssij roztwór Dispase i delikatnie przemyj komórki za pomocą D-PBS.
- Delikatnie zeskrob komórki z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mL.
- Przepłucz płytkę hodowlaną dwukrotnie KSR-FF, delikatnie "spłukując" wszelkie nieodczepione komórki. Połącz medium płuczące z komórkami w probówce 15 mL.
- Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pellet komórkowy.
- Ostrożnie odssij supernatant, nie naruszając pelletu komórkowego, i usuń go.
- Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić pellet komórkowy od dna probówki.
- Delikatnie resuspenduj komórki w wyrównanym temperaturowo KSR-FF za pomocą pipety serologicznej 5 mL. Nie trituruj. Uwaga: na tym etapie kluczowe jest delikatne resuspendowanie komórek bez użycia siły, aby uniknąć ich uszkodzenia.
- Przenieś komórki do nowej 60-mm płytki pokrytej Geltrex w żądanym stosunku rozcieńczenia i przesuń płytkę przód-tył oraz na boki kilka razy, aby rozprzestrzenić komórki po jej powierzchni.
- Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze 37°C z nawilżoną atmosferą zawierającą od 4 do 6% CO2 w powietrzu.
- Następnego dnia delikatnie wymień zużyte medium na KSR-FF, aby usunąć szczątki komórkowe. Wymieniaj zużyte medium codziennie w kolejnych dniach. Obserwuj komórki iPS codziennie i pasażuj je w razie potrzeby (mniej więcej co 4-5 dni). Pasażowanie jest zalecane, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji. W celu kriokonserwacji i rozmrażania komórek iPS zapoznaj się z naszym protokołem pt. "Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium".
Oczekiwane wyniki
Rysunek 1. Poniższe zdjęcie w kontraście fazowym przedstawia iPSC hodowane na szalkach pokrytych Geltrex z użyciem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free. iPSC wykazują morfologię podobną do hESC, charakteryzującą się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. (powiększenie 40x)
| Komponent | Szalka 35 mm | Płytka 60 mm | Szalka 100 mm |
| pożywka Complete KnockOut SR | 2 mL | 4 ml | 10 ml |
| Roztwór Geltrex | 1 ml | 1,5 ml | 4-5 ml |
| Dispase | 0,5 ml | 1 ml | 3-4 mL |
| D-PBS do płukania | 2 mL | 4 mL | 10 ml |
Tabela 1. Zalecane objętości
Oświadczenia
Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Life Technologies, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM/F12 | Nr kat. 12660-012 | Uwaga: patrz w załączniku w kwestii stosowania alternatywnych produktów DMEM | |
| GlutaMAX-I | Nr kat. 35050-061 | ||
| Zamiennik surowicy KnockOut | KnockOut SR, Nr kat. 10828-028 | ||
| Koktajl czynników wzrostu zamiennika surowicy KnockOut | KnockOut SR-GFC, Nr kat. A10580-01 | ||
| FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 μg | bFGF, Nr kat. PHG0024 | Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych wielkości opakowań bFGF. | |
| 2-Mercapto–etanol | Nr kat. 21985-023 | ||
| Dyspaza | Nr kat. 17105-041 | Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych metod pasażowania. | |
| Macierzy piwniczna Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor, 1 mL | Nr kat. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) bez wapnia i magnezu | Nr kat. 14190-144 | ||
| Sterylna komora do hodowli tkanek | |||
| Inkubator ustawiony na 37°C | |||
| Kontroler pipet (Pipette-Aid) | |||
| Kąpiel wodna ustawiona na 37°C | |||
| Sterylne pipety serologiczne (5 mL, 10 mL) | |||
| Wirówka | |||
| Probówki do wirowania 15 mL | |||
| Szalki hodowlane 60 mm traktowane do hodowli tkanek |
Bibliografia
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Maherali, N. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Li, W. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Liao, J. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).
- Dimos, J. T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Aasen, T. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).
- Park, I. H. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).
Przedruki i uprawnienia
