Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Podsumowanie

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Streszczenie

Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu wygenerowania komórek iPS ^1-3 o właściwościach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenny nowy zasób komórek pluripotencjalnych do celów poszukiwania nowych leków, terapii komórkowej oraz badań podstawowych.

Pożywki i odczynniki GIBCO od lat znajdują się w centrum badań nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Pożywka Knockout DMEM uzupełniona o Knockout Serum Replacement jest preferowanym medium do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a obecnie także do hodowli komórek iPS ^3-9. Ten złoty standard systemów pożywek może być teraz stosowany w hodowlach bez użycia komórek karmionek dzięki dodatkowi Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają zastosowania warstw wspierających (feeder layers) z fibroblastów mysich lub ludzkich, bądź pożywki warunkowanej przez komórki wspierające. Metody te są pracochłonne, trudne do skalowania, a utrzymanie komórek hiPS w stanie niezróżnicowanym jest utrudnione ze względu na nieokreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała Knockout SR Growth Factor Cocktail, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórek hiPS na systemy bezwarstwowe (feeder-free), przy jednoczesnym zachowaniu możliwości stosowania Knockout SR.

Protokół

Uwaga: Aby zachować sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w niniejszym protokole są wykonywane zgodnie z zasadami sterylności laboratoryjnej i przeprowadzane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie podłoża są wyrównane do temperatury 37°C i odpowiednio napowietrzone.

Przygotowanie naczyń hodowlanych powlekanych Geltrexem

Uwaga: w kwestii stosowania naczyń hodowlanych pokrytych CELLstart należy zapoznać się z załącznikiem

1. Powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex (1 mL) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w 99 mL Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszać roztwór.
   
   Uwaga: Niektóre linie komórek iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex dla optymalnego wzrostu. Alternatywne rozcieńczenia znajdują się w załączniku.
2. Pokryć całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex (1 mL dla szalki 35-mm, 1,5 mL dla szalki 60-mm).
3. Uszczelnić każdą szalkę Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
   
   Uwaga: Na tym etapie szalki hodowlane pokryte Geltrex można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. Każdą szalkę należy uszczelnić Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrex.
4. Przed użyciem przenieść szalki pokryte Geltrex do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozostawić do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej (około 1 godziny).

Przygotowanie pożywki KnockOut SR Medium do hodowli bezkarmiących

1. Aby przygotować 1 mL roztworu Basic FGF o stężeniu 10 μg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy.
   
   

   Basic FGF	10 μg
   D-PBS	990 μL
   10% BSA	10 μL

   
   
   Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu.
2. Aby przygotować 50 mL roztworu Dispase o stężeniu 2 mg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór poddać sterylizacji przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
   
   

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 mL

3. Aby przygotować 100 mL kompletnego pożywki KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), aseptycznie połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli.
   
   

   Składnik	Stężenie roztworu stokowego	Stężenie końcowe	Objętość
   Knockout DMEM/F12 (Kat. nr 12660-012)	-	1X	76.8 mL
   GlutaMAX -I (Kat. nr 35050-061)	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut SR (Kat. nr 10828-028)	-	20%	20 mL
   KnockOut SR-GFC (Kat. nr A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (Kat. nr PHG0024)	10 μg/mL	20 ng/mL	200 μL

   Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.
4. Bezpośrednio przed wyrównaniem temperatury i składu gazowego kompletnej pożywki, aseptycznie dodać wymaganą objętość 2-merkaptoetanolu (stężenie stokowe 55 mM), aby uzyskać stężenie końcowe 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 mL pożywki KSR-FF, należy dodać 182 μL 2-merkaptoetanolu o stężeniu 55 mM (rozcieńczenie 1:550). Alternatywnie, 2-merkaptoetanol można dodać do kompletnej pożywki 1X i przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.

Adaptacja iPSC do pożywki KSR-FF

1. Przed rozpoczęciem pracy doprowadzić naczynia pokryte Geltrexem do temperatury pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Kulturować iPSC na komórkach karmicielskich MEF do momentu osiągnięcia 70-80% konfluencji. Protokoły hodowli na MEF znajdują się w podręczniku GIBCO Mouse Embryonic Fibroblast.
3. Podgrzać wymaganą objętość Dyspazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
4. Podgrzać wymaganą objętość KSR-FF w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
5. Odssać medium z naczyń hodowlanych i dodać odpowiednią ilość roztworu Dyspazy. Inkubować naczynia w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.
6. Odssać roztwór Dyspazy z każdego naczynia hodowlanego i delikatnie wypłukać komórki karmicielskie MEF za pomocą D-PBS (2 do 3 razy).
7. Dodać do każdego naczynia hodowlanego odpowiednią ilość kompletnego medium KnockOut SR. Użyć skrobaczki do komórek lub pipety 5 mL, aby delikatnie zdrapać komórki z powierzchni naczynia hodowlanego.
   
   Uwaga: alternatywne protokoły adaptacji dla linii komórkowych iPS trudnych do adaptacji znajdują się w aneksie.
8. Zebrać zawiesinę komórkową z każdego naczynia hodowlanego do oddzielnych stożkowych probówek 15 mL. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością kompletnego medium KnockOut SR, a medium z płukania D-PBS dodać do probówek stożkowych 15 mL zawierających zawiesinę komórkową. Należy uważać, aby nie rozbić agregatów komórkowych na pojedyncze komórki.
9. Wirować probówki stożkowe 15 mL przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia iPSC.
10. Odssać nadsącz z osadu iPSC. Resuspendować osad w odpowiedniej ilości medium KSR-FF zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia (Tabela 1). Nie rozbijać agregatów komórkowych na mniejsze fragmenty, ponieważ mniejsze agregaty słabo przylegają do powierzchni.
    
    Uwaga: Zaleca się współczynnik rozcieńczenia 1:2 przez pierwsze 3 pasażowania po przeniesieniu iPSC bezpośrednio z medium hodowlanego iPSC MEF do medium KSR-FF. Zazwyczaj odpowiedni jest współczynnik rozcieńczenia od 1:3 do 1:5, jednak pasażowanie w stosunku 1:2 zapewnia wyższą gęstość komórek niezbędną podczas adaptacji do hodowli bezkomórkowej (feeder-free).
11. Przed wysianiem iPSC na naczynia pokryte Geltrexem, odessać pozostały roztwór Geltrexu z uprzednio pokrytego naczynia i powoli dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdego naczynia hodowlanego. Uwaga: nie płukać naczyń przed wysianiem.
12. Przesuwać naczynie hodowlane przód-tył i na boki kilka razy, aby rozprowadzić komórki po całej powierzchni naczynia. Ostrożnie umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze 37°C w atmosferze uwilgotnionej z dodatkiem 4 do 6% CO₂ w powietrzu. Wymieniać zużyte medium na KSR-FF każdego dnia.

Pasażowanie ludzkich komórek iPS z użyciem KSR-FF

13. Obserwuj ludzkie iPSC rosnące w pełnym KSR-FF pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki osiągnęły 70-80% konfluencji i są gotowe do pasażowania. Zob. Rysunek 1.
    
    Uwaga: Jeśli kolonie staną się zbyt gęste lub zbyt duże, dojdzie do zwiększonej różnicowania.
14. Przed pasażowaniem hodowli wytnij i usuń wszelkie zróżnicowane kolonie iPSC.
15. Podgrzej wymaganą objętość Dispase w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
16. Wstępnie wyrównaj temperaturę wymaganej objętości KSR-FF w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
17. Odssij zużyte medium z naczynia hodowlanego za pomocą pipety i przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą D-PBS.
18. Ostrożnie dodaj podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 mL roztworu Dispase na 60-mm płytkę hodowlaną). Zakręć naczyniem, aby pokryć całą powierzchnię komórek.
19. Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.
20. Wyjmij naczynie z inkubatora, odssij roztwór Dispase i delikatnie przemyj komórki za pomocą D-PBS.
21. Delikatnie zeskrob komórki z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mL.
22. Przepłucz płytkę hodowlaną dwukrotnie KSR-FF, delikatnie "spłukując" wszelkie nieodczepione komórki. Połącz medium płuczące z komórkami w probówce 15 mL.
23. Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pellet komórkowy.
24. Ostrożnie odssij supernatant, nie naruszając pelletu komórkowego, i usuń go.
25. Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić pellet komórkowy od dna probówki.
26. Delikatnie resuspenduj komórki w wyrównanym temperaturowo KSR-FF za pomocą pipety serologicznej 5 mL. Nie trituruj. Uwaga: na tym etapie kluczowe jest delikatne resuspendowanie komórek bez użycia siły, aby uniknąć ich uszkodzenia.
27. Przenieś komórki do nowej 60-mm płytki pokrytej Geltrex w żądanym stosunku rozcieńczenia i przesuń płytkę przód-tył oraz na boki kilka razy, aby rozprzestrzenić komórki po jej powierzchni.
28. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze 37°C z nawilżoną atmosferą zawierającą od 4 do 6% CO₂ w powietrzu.
29. Następnego dnia delikatnie wymień zużyte medium na KSR-FF, aby usunąć szczątki komórkowe. Wymieniaj zużyte medium codziennie w kolejnych dniach. Obserwuj komórki iPS codziennie i pasażuj je w razie potrzeby (mniej więcej co 4-5 dni). Pasażowanie jest zalecane, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji. W celu kriokonserwacji i rozmrażania komórek iPS zapoznaj się z naszym protokołem pt. "Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium".

Oczekiwane wyniki

Rysunek 1. Poniższe zdjęcie w kontraście fazowym przedstawia iPSC hodowane na szalkach pokrytych Geltrex z użyciem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free. iPSC wykazują morfologię podobną do hESC, charakteryzującą się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. (powiększenie 40x)

Komponent	Szalka 35 mm	Płytka 60 mm	Szalka 100 mm
pożywka Complete KnockOut SR	2 mL	4 ml	10 ml
Roztwór Geltrex	1 ml	1,5 ml	4-5 ml
Dispase	0,5 ml	1 ml	3-4 mL
D-PBS do płukania	2 mL	4 mL	10 ml

Tabela 1. Zalecane objętości

Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić appendix.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Knockout DMEM/F12		Nr kat. 12660-012	Uwaga: patrz w załączniku w kwestii stosowania alternatywnych produktów DMEM
GlutaMAX-I		Nr kat. 35050-061
Zamiennik surowicy KnockOut		KnockOut SR, Nr kat. 10828-028
Koktajl czynników wzrostu zamiennika surowicy KnockOut		KnockOut SR-GFC, Nr kat. A10580-01
FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 μg		bFGF, Nr kat. PHG0024	Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych wielkości opakowań bFGF.
2-Mercapto–etanol		Nr kat. 21985-023
Dyspaza		Nr kat. 17105-041	Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych metod pasażowania.
Macierzy piwniczna Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor, 1 mL		Nr kat. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) bez wapnia i magnezu		Nr kat. 14190-144
Sterylna komora do hodowli tkanek
Inkubator ustawiony na 37°C
Kontroler pipet (Pipette-Aid)
Kąpiel wodna ustawiona na 37°C
Sterylne pipety serologiczne (5 mL, 10 mL)
Wirówka
Probówki do wirowania 15 mL
Szalki hodowlane 60 mm traktowane do hodowli tkanek