Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu kompletnego pożywki do wymiany surowicy KnockOut bez podajnika

Summary

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę kriokonserwacji ludzkich komórek iPS w pożywce kriokonserwacyjnej KnockOut SR i odzyskiwania tych komórek na kompletnym podłożu KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub na pożywce KnockOut SR opartej na pożywce.

Abstract

Odkrycie w 2006 roku, że ludzkie i mysie fibroblasty mogą być przeprogramowane tak, aby generowały komórki iPS ^1-3 o cechach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenne nowe źródło komórek pluripotencjalnych do odkrywania leków, terapii komórkowej i badań podstawowych.

Pożywki i odczynniki GIBCO od lat znajdują się w czołówce badań nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Knockout DMEM uzupełniony o Knockout Serum Replacement jest pożywką z wyboru do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a teraz hodowli komórek iPS ^3-9. Ten złoty standard systemu pożywek może być teraz używany do hodowli bez karmnika z dodatkiem koktajlu Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają użycia mysich lub ludzkich warstw fibroblastów, lub pożywki kondycjonowanej przez pożywkę. Te metody hodowli są pracochłonne, trudne do skalowania i trudno jest utrzymać niezróżnicowane komórki hiPS ze względu na nieokreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała koktajl czynnika wzrostu Knockout SR, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórkowych hiPS i hES do hodowli bez karmowania, przy jednoczesnym zachowaniu stosowania Knockout SR.

Protocol

Uwaga: Aby utrzymać sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w tym protokole są przeprowadzane przy użyciu sterylnych praktyk laboratoryjnych i przeprowadzane pod okapem z przepływem laminarnym.

Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie media są zrównoważone do 37°C i odpowiednio zagazowane.

Przygotowywanie potraw z kultur pokrytych Geltrex

Uwaga: zobacz załącznik, aby dowiedzieć się, jak używać szalek hodowlanych z powłoką CELLstart.

1. Rozmrozić powoli jedną probówkę Geltrex (1 ml) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć ją w proporcji 1:100 w 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszaj roztwór.
   
   Uwaga: Niektóre linie komórkowe iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex w celu uzyskania optymalnego wzrostu. Patrz dodatek, aby zapoznać się z alternatywnymi rozcieńczeniami.
2. Pokryj całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex (1 ml dla szalki 35 mm, 1,5 ml dla szalki 60 mm).
3. Uszczelnij każde naczynie Parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu i inkubuj naczynia przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
   
   Uwaga: W tym momencie można przechowywać szalki hodowlane pokryte Geltrex w temperaturze 4°C przez okres do 1 miesiąca. Uszczelnij każde naczynie Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrexu.
4. Przed użyciem przenieś naczynia pokryte Geltrex do okapu z przepływem laminarnym i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową (około 1 godziny).

Przygotowanie kompletnego podłoża bez feederu KnockOut SR

1. Aby przygotować 1 ml 10 μg/ml roztworu zasadowego FGF, należy w asepcie wymieszać składniki wymienione poniżej. Roztwór należy rozdzielić na porcję i przechowywać w temperaturze -20°C przez okres do 6 miesięcy.
   Podstawowy FGF 10 μg D-PBS (Sieć Demokratyczna) 990 μL 10% BSA 10 μL
   Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu.
2. Aby przygotować 50 ml roztworu do dyspazy o stężeniu 2 mg/ml, należy w asepcie wymieszać składniki wymienione poniżej. Przefiltrować, wysterylizować roztwór i przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do 2 tygodni. Rozpuść 100 mg tabletki powlekania D-PBS (Sieć Demokratyczna) 50 ml
3. Aby przygotować 100 ml kompletnego KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), należy aseptycznie połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli.
   składnik Koncentracja zapasów Stężenie końcowe głośność Knockout DMEM/F12 (Nr kat. 12660-012) - 1X 76,8 ml GlutaMAX -I (Kat. Nr 35050-061) 200 mM 2 mM 1 ml KnockOut SR (Nr kat. 10828-028) - 20% 20 ml KnockOut SR-GFC (Nr kat. A10580-01) 50-krotny wzrost 1X 2 ml bFGF (nr kat. PHG0024). 10 μg/ml 20 ng/ml 200 μL
   Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez okres do jednego tygodnia.
4. Tuż przed wstępnym wyrównaniem całego podłoża z temperaturą i gazami, należy aseptycznie dodać wymaganą objętość 2 merkaptoetanolu (stężenie podstawowe 55 mM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 ml pożywki KSR-FF, dodaj 182 μl 55 mM 2-merkaptoetanolu (rozcieńczenie 1:550) Alternatywnie, 2-merkaptoetanol można dodać do 1X ukończonej pożywki i przechowywać w temperaturze 2-8°C przez okres do jednego tygodnia.

Przygotowanie podłoża do zamrażania / kriokonserwacji

Pożywka do kriokonserwacji składa się z dwóch pożywek; Zamrażarka A i pożywka zamrażająca B. Są one dodawane do komórek w różnym czasie i muszą pozostać oddzielone. Każdy z nich stanowi 50% całkowitej objętości potrzebnego podłoża do krioprezerwacji. Całkowita potrzebna objętość pożywki do kriokonserwacji wynosi 1 ml na każdą fiolkę do zamrożenia. 90% zlewającą się 60-milimetrową miskę hESC można użyć do umieszczenia 2 fiolek hESC w pożywce do kriokonserwacji.

Przygotuj wystarczającą ilość każdego medium zamrażającego z dodatkowymi 2-5 ml, aby zapewnić nadwyżkę.

Zamrażanie Medium A (50% objętości końcowej): 50% DMEM/F12 50% KSR Zamrażanie Medium B (50% objętości końcowej): 80% DMEM/F12 20% DMSO

Przykład:

Jeśli zamrażasz 20 fiolek komórek, będziesz potrzebował 20 ml pożywki do kriokonserwacji. Dodaj 4 ml na nadwyżkę, aby uzyskać łącznie 24 ml pożywki do kriokonserwacji. Oznacza to, że będziesz potrzebować 12 ml pożywki do zamrażania A (50% z 24 ml) i 12 ml pożywki do zamrażania B (50% z 24 ml).

Zamrażarka A (12 ml): 6 ml DMEM/F12 6 ml KSR Zamrażarka B (12 ml): 9,6 ml DMEM/F12 2,4 ml DMSO

Ostateczny skład pożywki do kriokonserwacji to 65% DMEM/F12, 25% KSR i 10% DMSO.

Kriokonserwacja iPSC

1. Wstępnie podgrzej wymaganą objętość leku Dispase w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zapoznaj się z tabelą 1 poniżej, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wymaganych objętości.
2. Wstępnie zrównoważyć wymaganą objętość KSR-FF w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 15 minut. Szczegółowe informacje na temat wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
3. Odessać zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać komórki D-PBS.
4. Delikatnie dodać wstępnie podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 ml roztworu Dispase na 60-milimetrowe naczynie hodowlane). Zakręć naczyniem hodowlanym, aby pokryć całą powierzchnię komórki.
5. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.
6. Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać roztwór Dispase i delikatnie przemyć komórki D-PBS.
7. Delikatnie zeskrob komórki z powierzchni naczynia hodowlanego za pomocą skrobaka do komórek i przenieś komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
8. Dwukrotnie przepłukać naczynie hodowlane KSR-FF, delikatnie "spryskując" wszelkie komórki, które nie oderwały się. Połącz pożywkę płuczącą z komórkami w probówce o pojemności 15 ml.
9. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować komórki.
10. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego, i wyrzucić go.
11. Przygotuj wystarczającą ilość kriowialiów. Gdy komórki wejdą w kontakt z DMSO, należy je podzielić na porcje i zamrozić w ciągu 2-3 minut.
12. Delikatnie przesuń probówkę, aby całkowicie usunąć osad komórek z dna probówki i ponownie zawiesić komórki w podłożu zamrażającym A. [delikatnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml]. Po równomiernym zawieszeniu grudek dodaj do niego równą objętość pożywki zamrażającej B, kroplami, delikatnie mieszając zawiesinę komórkową, aby wymieszać.
    
    Uwaga: W tym momencie ogniwa są w kontakcie z DMSO, a praca musi być wykonywana wydajnie. Gdy komórki wejdą w kontakt z DMSO, należy je poddzielić i zamrozić w ciągu 2-3 minut.
13. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego kriowialu.
14. Szybko umieść fiolki w Mr. Frosty [aby szybko zamrozić] i przenieś je do -80°C na noc.
15. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze -80°C przenieś komórki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

rozmrażanie fiolki iPSC i odzyskiwanie komórek

Uwaga: KSR-FF może być zastąpiony przez pożywkę kondycjonowaną MEF zawierającą KSR, lub pożywkę KSR do użytku z podajnikami. Instrukcje dotyczące przygotowania pożywki znajdują się w załączniku.

Podgrzej 10 ml pożywki KSR-FF w probówce o pojemności 50 ml.

1. Zrównoważ odpowiednią ilość naczyń pokrytych Geltrex do temperatury pokojowej i odessaj płyn z naczyń tuż przed posianiem komórek.
2. Ostrożnie wyjąć fiolkę z hESC (lub iPSC) ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu.
3. Szybko rozmrozić zamrożoną fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż w fiolce pozostanie tylko mały zamrożony kawałek.
4. Spryskaj fiolkę 70% izopropanolem, aby ją odkazić i przenieść do sterylnego kaptura do hodowli tkankowej.
5. Przeprowadzić w warunkach aseptycznych całą zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
6. Przepłukać fiolkę 1 ml KSR-FF i dodać go do 15 ml probówki wirówkowej.
7. Powoli dodawaj kroplami 4 ml KSR-FF do komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodając pożywkę, delikatnie przesuwaj probówkę do przodu i do tyłu, aby wymieszać komórki. (Zmniejsza to wstrząs osmotyczny w komórkach).
8. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml z zawiesiną komórek przy 1000 obr./min (200 x g) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
10. Ponownie zawiesić osad komórek we wstępnie podgrzanym KSR-FF (np. naczyniu 4 ml/60 mm) za pomocą pipety 5 ml i delikatnie pipetować komórki w górę iw dół, aż osad komórkowy zostanie całkowicie zdyspergowany. Oczekuje się, że żywotność będzie większa niż 70%, jednak jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, osiągnięcie konfluencji komórek może zająć więcej czasu.
11. Za pomocą tej samej pipety przenieś zawiesinę komórek kroplami do naczynia hodowlanego pokrytego Geltrex, wstępnie zrównoważonego do temperatury pokojowej.
12. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37°C, w atmosferze nawilżonej od 4 do 6% CO₂ w powietrzu. Ostrożnie obracaj naczynie w układzie z północy na południe, ze wschodu na zachód, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
13. Delikatnie zmieniaj płyn w naczyniu hodowlanym 24 godziny po rozmrożeniu, a następnie codziennie, aby usunąć resztki komórek i dostarczyć świeże składniki odżywcze, aż naczynie będzie zlewać się w około 70-80%. Aby kontynuować hodowlę i pasażowanie komórek iPS, zapoznaj się z naszym protokołem zatytułowanym "Hodowla bez podawania i pasażowanie ludzkich komórek iPS przy użyciu kompletnej pożywki zastępującej surowicę KnockOut bez pożywki"

Oczekiwane wyniki

Komórki powinny być mniej więcej w 70-80% zlewające się przed krioprezerwacją. Trawienie dispase powoduje zwijanie się i fałdowanie kolonii wzdłuż brzegów kolonii. Po zebraniu komórek są one zamrażane jako małe grudki w pożywce do kriokonserwacji. Po rozmrożeniu fiolki komórki regenerują się i przyczepiają do wstępnie pokrytego naczynia w postaci małych grudek. Rosną szybko, prowadząc do zlewającego się dania w ciągu 5-6 dni.

Tabela 1 - Zalecane objętości

składnik Talerz 35mm Talerz 60mm Talerz 100 mm Kompletny KnockOut SR średni 2 ml 4 ml 10 ml Roztwór Geltrex 1 ml 1,5 ml 4-5 ml Rozpuść 0,5 ml 1 ml 3-4 ml D-PBS do płukania 2 ml 4 ml 10 ml

Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć dodatek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Uwaga: patrz załącznik dotyczący stosowania alternatywnych produktów DMEM GlutaMAX-I (Kat. Nr 35050-061)
	surowicy KnockOut	10828-028
	czynnika wzrostu zastępującego surowicę KnockOut	A10580-01
FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 μ g		PHG0024	Uwaga: alternatywne wielkości opakowań bFGF znajdują się w załączniku.
2-Mercapt– tanol		21985-023
Dypaza		17105-041	Uwaga: patrz załącznik, aby zapoznać się z alternatywnymi metodami pasażowania
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (D-PBS) bez wapnia i magnezu		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterylny
ustawiony na 37° C
Zestaw do kąpieli wodnej z pipetą-pomocą
w 37° C
Sterylne pipety serologiczne (5 mL, 10 mL)
Wirówka
15 ml probówki
60 mm Naczynia
Zbiornik
Pojemniki			do zamrażania izopropanolu
1,5 ml kriofiali