Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Streszczenie

Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu uzyskania komórek iPS ^1-3 o właściwościach uderzająco podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenne nowe źródło komórek pluripotencjalnych dla celów odkrywania leków, terapii komórkowej oraz badań podstawowych.

Pożywki i odczynniki GIBCO od lat zajmują czołowe miejsce w badaniach nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Knockout DMEM uzupełniony o Knockout Serum Replacement jest preferowanym medium do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a obecnie także do hodowli komórek iPS ^3-9. Ten standardowy system pożywek może teraz być stosowany do hodowli bezwarstwowej po dodaniu Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają zastosowania warstw karmiących z fibroblastów mysich lub ludzkich lub pożywki warunkowanej przez komórki karmiące. Metody hodowli te są pracochłonne, trudne do skalowania, a utrzymanie komórek hiPS w stanie niedróżnicowanym jest utrudnione ze względu na niedookreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała koktajl czynników wzrostu Knockout SR Growth Factor Cocktail, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórek hiPS i hES na systemy bezwarstwowe (feeder-free) przy jednoczesnym zachowaniu stosowania Knockout SR.

Protokół

Uwaga: Aby zachować sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w niniejszym protokole są wykonywane zgodnie ze sterylnymi zasadami pracy laboratoryjnej i przeprowadzane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszelkie podłoża zostały wyrównane do temperatury 37°C i odpowiednio nasycone gazem.

Przygotowywanie naczyń hodowlanych powlekanych Geltrexem

Uwaga: zapoznaj się z dodatkiem dotyczącym zastosowania naczyń hodowlanych powlekanych CELLstart.

1. Powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex (1 mL) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w 99 mL pożywki Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszać roztwór.
   
   Uwaga: Niektóre linie komórek iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex dla zapewnienia optymalnego wzrostu. Alternatywne rozcieńczenia znajdują się w aneksie.
2. Pokryć całą powierzchnię każdego naczynia hodowlanego roztworem Geltrex (1 mL dla naczynia 35-mm, 1,5 mL dla naczynia 60-mm).
3. Uszczelnić każde naczynie Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i inkubować naczynia przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
   
   Uwaga: Na tym etapie można przechowywać naczynia hodowlane pokryte Geltrex w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. Każde naczynie należy uszczelnić Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrex.
4. Przed użyciem przenieść naczynia pokryte Geltrex do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozwolić im wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (około 1 godziny).

Przygotowanie pożywki bezkomórkowej Complete KnockOut SR

1. Aby przygotować 1 ml roztworu Basic FGF o stężeniu 10 μg/ml, należy w warunkach aseptycznych wymieszać wymienione poniżej składniki. Roztwór należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy.
   

   Podstawowy FGF	10 μg
   D-PBS	990 μL
   10% BSA	10 μL

   
   Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu.
2. Aby przygotować 50 ml roztworu Dispase o stężeniu 2 mg/ml, należy aseptycznie wymieszać wymienione poniżej składniki. Roztwór należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.

   Dyspaza	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. Aby w warunkach aseptycznych przygotować 100 ml pełnego medium KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), należy połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli.
   

   Komponent	Stężenie roztworu zapasu	Stężenie końcowe	Objętość
   Knockout DMEM/F12 (Kat. nr 12660-012)	-	1X	76,8 ml
   GlutaMAX -I (Katalog nr 35050-061)	200 mM	2 mM	1 ml
   KnockOut SR (Katalog nr 10828-028)	-	20%	20 ml
   KnockOut SR-GFC (nr kat. A10580-01)	50x	1X	2 ml
   bFGF (nr kat. PHG0024).	10 μg/mL	20 ng/ml	200 μL

   
   Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2–8°C przez maksymalnie jeden tydzień.
4. Tuż przed doprowadzeniem kompletnego medium do stanu równowagi pod względem temperatury i składu gazowego, w warunkach aseptycznych dodaj wymaganą objętość 2-merkaptoetanolu (stężenie roztworu zapasu 55 mM) dla uzyskania stężenia końcowego 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 ml pożywki KSR-FF, należy dodać 182 μl 2-merkaptoetanolu o stężeniu 55 mM (rozcieńczenie 1:550). Alternatywnie 2-merkaptoetanol można dodać do gotowej pożywki 1X i przechowywać w temperaturze 2–8°C przez maksymalnie jeden tydzień.

Przygotowanie medium do mrożenia / krioteknik

Pożywka do kriokonserwacji składa się z dwóch komponentów: medium zamrażającego A oraz medium zamrażającego B. Są one dodawane do komórek w różnych momentach i muszą pozostać rozdzielone. Każdy z nich stanowi 50% całkowitej objętości wymaganej pożywki do kriokonserwacji. Całkowita objętość pożywki do kriokonserwacji potrzebna dla każdej zamrażanej fiolki wynosi 1 mL. Płytka 60 mm z hESC o 90% konfluencji może zostać wykorzystana do zabezpieczenia 2 fiolek hESC w pożywce do kriokonserwacji.

Przygotować odpowiednią objętość każdego medium do zamrażania, dodając dodatkowe 2-5mL w celu zapewnienia zapasu.

Medium do mrożenia A (50% objętości końcowej):	50% DMEM/F12	50% KSR
Medium do mrożenia B (50% objętości końcowej):	80% DMEM/F12	20% DMSO

Przykład:

Jeśli zamrażasz 20 fiolek komórek, będziesz potrzebować 20mL Medium do Kriokonserwacji. Dodaj 4mL zapasu, co daje łącznie 24mL Medium do Kriokonserwacji. Oznacza to, że będziesz potrzebować 12mL Medium do Zamrażania A (50% z 24mL) oraz 12mL Medium do Zamrażania B (50% z 24mL).

Pożywka do mrożenia A (12 ml):	6 ml DMEM/F12	6 ml KSR
Pożywka do zamrażania B (12 ml):	9,6 ml DMEM/F12	2,4 ml DMSO

Końcowy skład medium do krio konserwacji to 65% DMEM/F12, 25% KSR i 10% DMSO.

Kriokonserwacja iPSC

1. Podgrzać wymaganą objętość Dispase w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
2. Równoważyć wymaganą objętość KSR-FF w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.
3. Odssać zużyte medium z naczynia hodowlanego za pomocą pipety, a następnie dwukrotnie wypłukać komórki za pomocą D-PBS.
4. Delikatnie dodać podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 mL roztworu Dispase na 60-mm płytkę hodowlaną). Obracać naczynie hodowlane, aby pokryć całą powierzchnię komórek.
5. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.
6. Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać roztwór Dispase i delikatnie przemyć komórki za pomocą D-PBS.
7. Delikatnie zebrać komórki z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15mL.
8. Dwukrotnie wypłukać płytkę hodowlaną za pomocą KSR-FF, delikatnie „spłukując” wszelkie nieodłączone komórki. Połączyć medium do płukania z komórkami w probówce 15mL.
9. Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
10. Ostrożnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego, i usunąć go.
11. Przygotować odpowiednią liczbę krioprobówek. Po kontakcie komórek z DMSO należy je podzielić na porcje i zamrozić w ciągu 2-3 minut.
12. Delikatnie potrząsnąć probówką, aby całkowicie oddzielić osad komórkowy od dna probówki, i resuspendować komórki w Medium do Zamrażania A [poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5-mL]. Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny grudek, dodać do niej taką samą objętość Medium do Zamrażania B, dodając je kroplami przy delikatnym mieszaniu zawiesiny komórkowej.
    
    Uwaga: Na tym etapie komórki są w kontakcie z DMSO, dlatego pracę należy wykonywać sprawnie. Po kontakcie komórek z DMSO należy je podzielić na porcje i zamrozić w ciągu 2-3 minut.
13. Przenieść po 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej krioprobówki.
14. Szybko umieścić probówki w urządzeniu Mr. Frosty [w celu szybkiego zamrożenia] i przenieść do temperatury -80°C na noc.
15. Po całonocnym przechowywaniu w -80°C przenieść komórki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.

Rozmrażanie ampułki z iPSC i odzyskiwanie komórek

Uwaga: KSR-FF można zastąpić pożywką warunkowaną przez MEF zawierającą KSR lub pożywką KSR do stosowania z komórkami karmidłowymi. Instrukcje dotyczące przygotowania pożywek znajdują się w dodatku.

Podgrzej wstępnie 10mL pożywki KSR-FF w probówce o pojemności 50 mL.

1. Dostosować odpowiednią liczbę naczyń pokrytych Geltrexem do temperatury pokojowej i odessać z nich cały płyn bezpośrednio przed wysiewaniem komórek.
2. Ostrożnie wyjąć fiolkę z hESC (lub iPSC) z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.
3. Szybko rozmrozić zamrożoną fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż w fiolce pozostanie jedynie niewielka zamrożona grudka.
4. Spryskać fiolkę 70% izopropanolem w celu jej dekontaminacji, a następnie przenieść ją do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
5. Aseptycznie przenieść całą zawartość fiolki do 15 mL probówki stożkowej za pomocą pipety 5 mL.
6. Przepłukać fiolkę 1 mL KSR-FF i dodać ten płyn do 15 mL probówki wirówkowej.
7. Powoli, kroplami dodać 4 mL KSR-FF do komórek w 15 mL probówce stożkowej. Podczas dodawania medium delikatnie poruszać probówką w przód i w tył, aby wymieszać komórki (redukuje to szok osmotyczny komórek).
8. Wiwrować 15 mL probówkę z zawiesiną komórkową przy 1000rpm (200 x g) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Ostrożnie odessać i usunąć supernatan, nie naruszając granulatu komórkowego.
10. Resuspender granulat komórkowy w uprzednio ogrzanym KSR-FF (np. 4mL/naczynie 60 mm) za pomocą pipety 5 mL i delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aż granulat zostanie całkowicie rozproszony. Oczekiwana żywotność powinna wynosić powyżej 70%; jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, komórki mogą potrzebować więcej czasu na osiągnięcie konfluencji.
11. Za pomocą tej samej pipety przenieść zawiesinę komórkową kroplami do pokrytego Geltrexem naczynia hodowlanego, uprzednio dostosowanego do temperatury pokojowej.
12. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37°C, w nawilżonej atmosferze z 4 do 6% CO₂ w powietrzu. Ostrożnie poruszać naczyniem w płaszczyźnie północ-południe i wschód-zachód, aby równomiernie rozłożyć komórki.
13. Delikatnie wymieniać medium w naczyniu hodowlanym 24 godziny po rozmrożeniu, a następnie codziennie w celu usunięcia szczątków komórkowych i dostarczenia świeżych składników odżywczych, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 70-80%. W celu dalszej hodowli i pasażowania komórek iPS należy zapoznać się z naszym protokołem pt. „Feeder-Free Culture and Passaging of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium”

Oczekiwane wyniki

Przed kriokonserwacją komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie około 70-80%. Trawienie dyspazą powoduje zwijanie się i składanie kolonii wzdłuż ich marginesów. Po zebraniu komórki są zamrażane w postaci małych skupisk w medium do kriokonserwacji. Po rozmrożeniu fiolki komórki regenerują się i przywierają do wcześniej pokrytej płytki w formie małych skupisk. Rosną one szybko, prowadząc do uzyskania pełnej konfluencji płytki w ciągu 5-6 dni.

Tabela 1 - Zalecane objętości

Komponent	Szkiełko 35mm	Szkiełko 60mm	Szkiełko 100mm
Pełna pożywka KnockOut SR	2 mL	4 mL	10 mL
Roztwór Geltrex	1 mL	1.5 mL	4-5 mL
Dispaza	0.5 mL	1 mL	3-4 mL
D-PBS do płukania	2 mL	4 mL	10 mL

Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć załącznik.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12 Knockout		12660-012	Uwaga: w kwestii stosowania alternatywnych produktów DMEM GlutaMAX-I (nr kat. 35050-061) należy zapoznać się z załącznikiem
Zamiennik surowicy KnockOut		10828-028
Koktajl czynników wzrostu KnockOut Serum Replacement		A10580-01
FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 μg		PHG0024	Uwaga: alternatywne rozmiary opakowań bFGF znajdują się w aneksie.
2-merkapto–etanol		21985-023
Dyspaza		17105-041	Uwaga: alternatywne metody pasażowania znajdują się w załączniku
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 ml		A10480-01
Dulbecco’bufor fosforanowy (D-PBS) bez jonów wapnia i magnezu		14190-144
DMSO, 500 ml	JT Baker	JT9224-1
Sterylna komora do hodowli tkanek
Inkubator ustawiony na 37°C°C
kontroler pipetowy
Kąpiel wodna ustawiona na 37°C°C
Sterylne pipety serologiczne (5 ml, 10 ml)
Wirówka
probówki wirówkowe 15 ml
szalki hodowlane 60 mm traktowane do hodowli tkanek
Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu
Containers do mrożenia w izopropanolu
Krioprobówki 1,5 ml