Niniejszy protokół opisuje niewirusową metodę dostarczania konstruktów genetycznych do określonego obszaru żywego mózgu gryzonia. Metoda obejmuje przygotowanie plazmidu, wykonanie mikropipety, operację na noworodkach szczura, mikroiniekcję konstruktu oraz elektroporację in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie genów do postnatalnego mózgu szczura poprzez niekomorowe wstrzykiwanie plazmidów i elektroporację
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tworzenie zwierząt transgenicznych jest standardowym podejściem w badaniu funkcji interesującego genu in vivo. Jednakże wiele zwierząt z nokautem lub zwierząt transgenicznych nie jest żywotnych w przypadkach, gdy zmodyfikowany gen jest eksprymowany lub usunięty w całym organizmie. Co więcej, różnorodne mechanizmy kompensacyjne często utrudniają interpretację wyników. Efekty kompensacyjne można złagodzić poprzez odpowiednie zsynchronizowanie czasu ekspresji genu lub ograniczenie liczby przetransfekowanych komórek.
Metoda postnatalnej mikroiniekcji pozakomorowej i elektroporacji in vivo umożliwia ukierunkowane dostarczanie genów, siRNA lub cząsteczek barwnika bezpośrednio do niewielkiego, wybranego obszaru w mózgu noworodka gryzonia. W przeciwieństwie do konwencjonalnej techniki iniekcji dokomorowej, metoda ta pozwala na transfekcję niemigrujących typów komórek. Zwierzęta poddane transfekcji opisaną tutaj metodą mogą być wykorzystane, na przykład, do dwufotonowego obrazowania in vivo lub w eksperymentach elektrofizjologicznych na ostrych skrawkach mózgu.
Protokół
1. Wstęp
Tworzenie zwierząt transgenicznych jest potężną metodą badania funkcji genów w żywych organizmach1 oraz odkrywania mechanizmów chorobowych2,3, a także manipulowania właściwościami komórek4. Procedura ta jest jednak dość żmudna, niezwykle czasochłonna i kosztowna, co uzasadnia stosowanie alternatywnych metod dostarczania genów, takich jak iniekcje wirusowe5, neonatalne iniekcje do komór mózgu z elektroporacją6 oraz elektroporacja in utero7,8. Metoda postnatalnej iniekcji pozakomorowej i elektroporacji posiada unikalny zestaw zalet: wykorzystanie niewirusowych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metody dostarczania genów do żywego mózgu gryzoni są dobrze opracowane dla elektroporacji in utero7,8,11,12 oraz, w ostatnim czasie, dla elektroporacji postnatalnej6. Jednak metody te opierają się na wewnątrzkomorowym wstrzykiwaniu plazmidowego DNA, co może być ograniczające w wielu zastosowaniach. Na przykład metody te nie pozwalają na celowanie w komórki w określonych obszarach mózgu, takich jak hipokamp, ani na transfekcję niemigrujących typów komórek, takich jak astrocyty korowe. Wstrzy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy Ekaterinie Karelinie za pomoc w nagraniu ścieżki dźwiękowej do filmu, Ivanowi Molotkovowi za animację 3D oraz dr. Peterowi Blaesse za przygotowanie plazmidu CAG-EGFP.
Praca była wspierana przez granty z Centrum Mobilności Międzynarodowej w Finlandii, Fińskiej Fundacji Kulturalnej oraz Akademii Finlandii.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Pinceta 2A-sa dumb, 115 mm | wyposażenie | XYtronic | XY-2A-SA | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Biologiczny kontroler temperatury z grzejnikiem ze stali nierdzewnej | wyposażenie | Supertech | TMP-5b | |
| Rurka borokrzemianowa z włóknem | materiał | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Igła szklana |
| Wiertła jednorazowe | materiał | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbecco’10X PBS | odczynnik | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| pinceta Dumont #5, 110 mm | wyposażenie | Fine Science Tools | 91150-20 | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych należy poddać dezynfekcji przy użyciu 70% etanolu. |
| Ealing micr–wyciągacz elektrod | wyposażenie | Ealing | 50-2013 | Pionowy wyciągacz elektrod szklanych |
| Monofilamentowa nić poliamidowa Ethilon 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | materiał | Johnson &i Johnson | EH7177H | Nici chirurgiczne |
| mikrostrzykawka Exmire 10,0 ml | sprzęt | Exmire | MS*GLLX00 | Strzykawka gazoszczelna |
| Fast Green | odczynnik | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Elektrody pęsetowe | wyposażenie | BEX | LF650P3 | Przed użyciem poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Sterowanie wiertarką Foredom | wyposażenie | Foredom | FM3545 | Zasilanie i sterowanie wiertarką chirurgiczną. Obecnie dostępny analog to zestaw mikrosilnika K.1070 (Foredom) |
| mikrosilnik z uchwytem Foredom | wyposażenie | Foredom | MH-145 | Obecnie dostępnym odpowiednikiem jest zestaw mikrosilnika K.1070 (Foredom) |
| Platforma do znieczulenia gazowego myszy | sprzęt | Stoelting Co. | 50264 | Zmontowany na aparacie stereotaksycznym |
| Izofluran | odczynnik | Baxter International Inc. | FDG9623 | |
| Mikropinceta opatrunkowa, 105 mm | wyposażenie | Aesculap | BD302R | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Microfil | materiał | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Napełnianie kapilar za pomocą mikrosyringi |
| Olej mineralny | odczynnik | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Strzykawka NanoFil 10 mikrolitrów | wyposażenie | World Precision Instruments, Inc. | NANOFILTR | strzykawka Hamiltona |
| plazmid CAG-EGFP | odczynnik | Wyekstrahowano i oczyszczono za pomocą zestawu EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen), a następnie rozpuszczono w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 1,5 mg/ml | ||
| Generator impulsów CUY21Vivo-SQ | wyposażenie | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| żel elektrodowy Schiller | odczynnik | Schiller AG | 2.158000 | Żel przewodzący |
| Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt | sprzęt | Instrumenty Davida Kopfa | 900 | |
| St–adaptor dla myszy dorosłych i szczura noworodkowego | wyposażenie | Stoelting Co. | 51625 | Zamontowano na aparacie stereotaksycznym. Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych należy zdezynfekować pręty uszne 70% etanolem. |
| Nożyczki irydologiczne studenckie, proste 11,5 cm | wyposażenie | Fine Science Tools | 91460-11 | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| chłonne tampony Sugi 17 x 8 mm | materiał | Kettenbach | 31602 | Tampony chirurgiczne |
| pompa mikrosstrzykawkowa UMP3 i kontroler pompy mikrosstrzykawkowej Micro 4 | wyposażenie | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Mikroinkektor i kontroler |
| Aparat do znieczulenia Univentor 400 | wyposażenie | Univentor | 8323001 |
Bibliografia
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
