Niniejszy protokół opisuje niewirusową metodę dostarczania konstruktów genetycznych do określonego obszaru żywego mózgu gryzonia. Metoda obejmuje przygotowanie plazmidu, wykonanie mikropipety, operację na noworodkach szczura, mikroiniekcję konstruktu oraz elektroporację in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie genów do postnatalnego mózgu szczura poprzez niekomorowe wstrzykiwanie plazmidów i elektroporację
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tworzenie zwierząt transgenicznych jest standardowym podejściem w badaniu funkcji interesującego genu in vivo. Jednakże wiele zwierząt z nokautem lub zwierząt transgenicznych nie jest żywotnych w przypadkach, gdy zmodyfikowany gen jest eksprymowany lub usunięty w całym organizmie. Co więcej, różnorodne mechanizmy kompensacyjne często utrudniają interpretację wyników. Efekty kompensacyjne można złagodzić poprzez odpowiednie zsynchronizowanie czasu ekspresji genu lub ograniczenie liczby przetransfekowanych komórek.
Metoda postnatalnej mikroiniekcji pozakomorowej i elektroporacji in vivo umożliwia ukierunkowane dostarczanie genów, siRNA lub cząsteczek barwnika bezpośrednio do niewielkiego, wybranego obszaru w mózgu noworodka gryzonia. W przeciwieństwie do konwencjonalnej techniki iniekcji dokomorowej, metoda ta pozwala na transfekcję niemigrujących typów komórek. Zwierzęta poddane transfekcji opisaną tutaj metodą mogą być wykorzystane, na przykład, do dwufotonowego obrazowania in vivo lub w eksperymentach elektrofizjologicznych na ostrych skrawkach mózgu.
Protokół
1. Wstęp
Tworzenie zwierząt transgenicznych jest potężną metodą badania funkcji genów w żywych organizmach1 oraz odkrywania mechanizmów chorobowych2,3, a także manipulowania właściwościami komórek4. Procedura ta jest jednak dość żmudna, niezwykle czasochłonna i kosztowna, co uzasadnia stosowanie alternatywnych metod dostarczania genów, takich jak iniekcje wirusowe5, neonatalne iniekcje do komór mózgu z elektroporacją6 oraz elektroporacja in utero7,8. Metoda postnatalnej iniekcji pozakomorowej i elektroporacji posiada unikalny zestaw zalet: wykorzystanie niewirusowych konstruktów genetycznych, możliwość stworzenia lokalnego wzorca ekspresji w obszarze zainteresowania oraz transfekcję in situ niemigrujących typów komórek, np. astrocytów korowych.
W tym filmie przedstawiamy szczegółową procedurę postnatalnego dostarczania genów do mózgu noworodka szczura przy użyciu plazmidu kodującego ulepszone zielone białko fluorescencyjne pod promotorem beta-aktyny kurczaka z enhancerem CMV (pCAG-EGFP)9. Ilustrujemy przygotowanie roztworu do wstrzyknięcia zawierającego plazmid, wykonanie cienkich szklanych pipet oraz montaż mikroinjektora na urządzeniu stereotaktycznym. Następnie omawiamy znieczulanie młodych szczurów izofluranem, przeprowadzenie operacji, procedurę iniekcji oraz elektroporację z użyciem elektrod szczypcowych i poratora in vivo. Na koniec krótko omawiamy oczekiwane wyniki, perspektywy oraz trudności, które mogą wystąpić podczas tych eksperymentów.
2. Przygotowanie plazmidu do elektroporacji
- Zazwyczaj przygotowujemy 10 μl roztworu plazmidu do wstrzyknięcia w probówce cienkościennej o pojemności 20 μl. Taka ilość roztworu jest wystarczająca do przeprowadzenia kilku eksperymentów.
- Mieszamy 8 μl roztworu plazmidu (patrz Materiały i sprzęt) z 1 μl 10X PBS (patrz Materiały i sprzęt) oraz 1 μl 0,1% wodnego roztworu Fast Green (patrz Materiały i sprzęt).
- Końcowe stężenie plazmidu w roztworze do wstrzyknięcia powinno wynosić od 1 do 3 μg/μl. Niższe stężenia plazmidowego DNA obniżą wydajność transfekcji, natomiast wyższe stężenie DNA spowoduje zbyt dużą lepkość roztworu, co uniemożliwi wstrzyknięcie przez cienką końcówkę kapilary szklanej.
3. Przygotowanie szklanych igieł
- Do przygotowania szklanej pipety używamy kapilary z borokrzemianowego szkła z włóknem (patrz Materiały i sprzęt) oraz pionowego wyciągacza elektrod szklanych (patrz Materiały i sprzęt) przy maksymalnych parametrach wyciągania i grzania.
- Następnie łamiemy końcówkę pipety za pomocą kawałka papieru, aby uzyskać średnicę końcówki rzędu 10-20 μm.
- Sprawdzamy średnicę i kształt końcówki pod obiektywem mikroskopu.
4. Montaż mikroinjektora
- Za pomocą cienkiej kapilary polimerowej (patrz Materiały i sprzęt) napełniamy około 1/3 objętości strzykawki Hamiltona 10 μl (patrz Materiały i sprzęt) olejem mineralnym (patrz Materiały i sprzęt). Należy unikać pęcherzyków powietrza!
- Następnie napełniamy szklaną pipetę olejem mineralnym i wkładamy pipetę do strzykawki Hamiltona. Należy unikać pęcherzyków powietrza!
- Strzykawkę z szklaną pipetą mocujemy w mikroinjektorze podłączonym do kontrolera (patrz Materiały i sprzęt).
- Układ do mikroiniekcji zamocowany na urządzeniu stereotaktycznym (patrz Materiały i sprzęt) pozwala na bezpieczne zanurzenie końcówki szklanej pipety w probówce z roztworem do iniekcji plazmidu.
- Gdy końcówka dotknie powierzchni roztworu, należy zanurzyć ją głębiej o 1 lub 2 mm i pobrać do pipety około 1 μl mieszaniny do iniekcji za pomocą kontrolera mikroinjektora.
5. Znieczulanie zwierzęcia
Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z przepisami Uniwersytetu w Helsinkach dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
- Do każdego eksperymentu napełniamy strzykawkę gazoszczelną (patrz Materiały i sprzęt) około 2 ml izofluranu (patrz Materiały i sprzęt).
- Następnie strzykawkę mocuje się w aparacie do anestezji (patrz Materiały i sprzęt) podłączonym do źródła przepływu powietrza, komory dla zwierzęcia oraz maski zamocowanej w uchwycie stereotaktycznym.
- W aparacie do anestezji ustawiamy przepływ powietrza na około 250 ml/min, a stężenie izofluranu na 4 %.
- Umieszczamy młode szczura w komorze dla zwierzęcia na 2-5 minut.
- Gdy młode przestanie się poruszać, kładziemy je na podgrzewacz (patrz Materiały i sprzęt) przymocowany do uchwytu stereotaktycznego.
- Przednią część głowy młodego szczura umieszczamy w masce anestezjologicznej.
- Wprowadzenie młodego szczura w stan głębokiej anestezji trwa od 5 do 10 minut.
- Głębokość anestezji sprawdzamy za pomocą ucisku ogona, a następnie zmniejszamy dopływ izofluranu do około 1,5-2,0 %.
6. Operacja, mikroiniekcja i elektroporacja
- Przetrzyj skórę na głowie szczenięcia 70% etanolem.
- Za pomocą małych nożyczek (patrz Materiały i sprzęt) i cienkiej pęsety (patrz Materiały i sprzęt) nacinaj skórę od karku szczenięcia aż do czoła.
- Odchyl płaty skóry na boki i delikatnie wprowadź uchwyty uszne do przewodów słuchowych czaszki, aby unieruchomić głowę i skórę.
- Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zlokalizuj punkt bregma na czaszce.
- Zidentyfikuj obszar zainteresowania, korzystając z współrzędnych stereotaktycznych.
- Umieść pipetę do wstrzykiwania nad tym obszarem i zaznacz go, nakraplając 25-50 nl roztworu wstrzykiwanego na powierzchnię czaszki.
- Ostrożnie i delikatnie wywierć otwór w czaszce w zaznacznym punkcie, używając szybkoobrotowego wiertła chirurgicznego (patrz Materiały i sprzęt) pod mikroskopem, aż w miejscu wiercenia pojawi się płyn.
- Zamocuj elektrody pęsety do elektroporacji (patrz Materiały i sprzęt) po bokach czaszki, stosując żel przewodzący prąd (patrz Materiały i sprzęt) w celu uzyskania lepszej przewodności.
- Usuń kroplę płynu z wywierconego otworu za pomocą małego tamponu (patrz Materiały i sprzęt) i wprowadź szklaną igłę do otworu zgodnie ze współrzędnymi miejsca wstrzyknięcia.
- Wprowadź od 25 do 100 nl roztworu wstrzykiwanego z prędkością od 5 do 20 nl/sec.
- Szybko wyjmij pipetę i niezwłocznie przeprowadź elektroporację. Elektroporację wykonuje się poprzez podanie pięciu impulsów prostokątnych o czasie trwania 50 ms i amplitudzie 99 V przy częstotliwości 1 Hz.
- Usuń elektrody i uchwyty uszne.
- Zszyj naciętą skórę, używając kombinacji pęsety tępej (patrz Materiały i sprzęt) oraz ostrej oraz nici chirurgicznych (patrz Materiały i sprzęt).
- Umieść szczenię w ciepłej komorze na 15-30 minut, aby wspomóc jego rekonwalescencję po anestezji.
- Następnie oddaj szczenię do klatki z matką.
7. Reprezentatywne wyniki
Ekspresja transgenu w pomyślnie transfektowanych komórkach pojawi się około 10 godzin po elektroporacji i pozostanie stabilna przez kilka tygodni.
Plazmid wstrzykiwano metodą mikroiniekcji albo do głębokich warstw kory, albo do obszaru prążkowia u noworodków szczurów Wistar w 2. dobie postnatalnej (P2), a następnie przeprowadzono elektroporację in vivo zgodnie z powyższym opisem. Przekroje mózgu (o grubości 40 μm) wycinano po upływie od 2 do 6 dni (P4-P8) za pomocą vibrotomu w zimnym medium do cięcia (buforowany Hepesem zrównoważony roztwór soli Earle'a)10. Akwizycję obrazów przeprowadzono przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal (Zeiss, Niemcy) w medium do cięcia w temperaturze pokojowej.
Miejsca wstrzyknięcia w głębokich warstwach kory i prążkowiu zawierały wiele przetransfekowanych komórek wykazujących ekspresję EGFP, które znajdowały się w zwartym obszarze o średnicy około 20-30 μm (Rysunek 1A, B). Wewnątrz przetransfekowanych komórek poziom ekspresji EGFP jest wystarczająco wysoki, aby umożliwić obrazowanie cienkich wypustek komórkowych (Rysunek 1C), w tym dendrytów z kolcami o różnych kształtach (Rysunek 1D) oraz pęczków aksonów (Rysunek 1E). Wysoka stabilność EGFP, a także żywotność komórek po elektroporacji, pozwoliły na śledzenie dystalnych części aksonów (do 1,5-2 mm od ciał komórkowych), takich jak terminale korowe (Rysunek 1F).
Rycina 1. (A) Pomyślnie przetransfekowane komórki w obszarze prążkowia mózgu szczura w dniu 4. życia (P4), wyznaczające miejsce iniekcji plazmidu. (B) Przetransfekowane komórki w głębokich warstwach kory (około 1000 μm poniżej powierzchni kory) mózgu szczura w dniu P5. (C) Przetransformowana komórka w obszarze prążkowia mózgu szczura w dniu P8. (D) Wyrostki dendrytyczne przetransformowanej komórki w obszarze prążkowia mózgu szczura w dniu P8; strzałki wskazują różne typy kolców dendrytycznych i filopodiów. (E) Aksony przetransformowanych komórek w obrębie drogi kolateralnej. (F) Aksony kończące się na powierzchni pialnej kory mózgu szczura w dniu P8 (grot strzałki). Paski skali wynoszą 100 μm na A, B, E i F; 10 μm na C i D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metody dostarczania genów do żywego mózgu gryzoni są dobrze opracowane dla elektroporacji in utero7,8,11,12 oraz, w ostatnim czasie, dla elektroporacji postnatalnej6. Jednak metody te opierają się na wewnątrzkomorowym wstrzykiwaniu plazmidowego DNA, co może być ograniczające w wielu zastosowaniach. Na przykład metody te nie pozwalają na celowanie w komórki w określonych obszarach mózgu, takich jak hipokamp, ani na transfekcję niemigrujących typów komórek, takich jak astrocyty korowe. Wstrzy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy Ekaterinie Karelinie za pomoc w nagraniu ścieżki dźwiękowej do filmu, Ivanowi Molotkovowi za animację 3D oraz dr. Peterowi Blaesse za przygotowanie plazmidu CAG-EGFP.
Praca była wspierana przez granty z Centrum Mobilności Międzynarodowej w Finlandii, Fińskiej Fundacji Kulturalnej oraz Akademii Finlandii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Pinceta 2A-sa dumb, 115 mm | wyposażenie | XYtronic | XY-2A-SA | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Biologiczny kontroler temperatury z grzejnikiem ze stali nierdzewnej | wyposażenie | Supertech | TMP-5b | |
| Rurka borokrzemianowa z włóknem | materiał | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Igła szklana |
| Wiertła jednorazowe | materiał | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbecco’10X PBS | odczynnik | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| pinceta Dumont #5, 110 mm | wyposażenie | Fine Science Tools | 91150-20 | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych należy poddać dezynfekcji przy użyciu 70% etanolu. |
| Ealing micr–wyciągacz elektrod | wyposażenie | Ealing | 50-2013 | Pionowy wyciągacz elektrod szklanych |
| Monofilamentowa nić poliamidowa Ethilon 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | materiał | Johnson &i Johnson | EH7177H | Nici chirurgiczne |
| mikrostrzykawka Exmire 10,0 ml | sprzęt | Exmire | MS*GLLX00 | Strzykawka gazoszczelna |
| Fast Green | odczynnik | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Elektrody pęsetowe | wyposażenie | BEX | LF650P3 | Przed użyciem poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Sterowanie wiertarką Foredom | wyposażenie | Foredom | FM3545 | Zasilanie i sterowanie wiertarką chirurgiczną. Obecnie dostępny analog to zestaw mikrosilnika K.1070 (Foredom) |
| mikrosilnik z uchwytem Foredom | wyposażenie | Foredom | MH-145 | Obecnie dostępnym odpowiednikiem jest zestaw mikrosilnika K.1070 (Foredom) |
| Platforma do znieczulenia gazowego myszy | sprzęt | Stoelting Co. | 50264 | Zmontowany na aparacie stereotaksycznym |
| Izofluran | odczynnik | Baxter International Inc. | FDG9623 | |
| Mikropinceta opatrunkowa, 105 mm | wyposażenie | Aesculap | BD302R | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| Microfil | materiał | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Napełnianie kapilar za pomocą mikrosyringi |
| Olej mineralny | odczynnik | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Strzykawka NanoFil 10 mikrolitrów | wyposażenie | World Precision Instruments, Inc. | NANOFILTR | strzykawka Hamiltona |
| plazmid CAG-EGFP | odczynnik | Wyekstrahowano i oczyszczono za pomocą zestawu EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen), a następnie rozpuszczono w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 1,5 mg/ml | ||
| Generator impulsów CUY21Vivo-SQ | wyposażenie | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| żel elektrodowy Schiller | odczynnik | Schiller AG | 2.158000 | Żel przewodzący |
| Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt | sprzęt | Instrumenty Davida Kopfa | 900 | |
| St–adaptor dla myszy dorosłych i szczura noworodkowego | wyposażenie | Stoelting Co. | 51625 | Zamontowano na aparacie stereotaksycznym. Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych należy zdezynfekować pręty uszne 70% etanolem. |
| Nożyczki irydologiczne studenckie, proste 11,5 cm | wyposażenie | Fine Science Tools | 91460-11 | Przed użyciem w manipulacjach chirurgicznych poddać dezynfekcji 70% etanolem |
| chłonne tampony Sugi 17 x 8 mm | materiał | Kettenbach | 31602 | Tampony chirurgiczne |
| pompa mikrosstrzykawkowa UMP3 i kontroler pompy mikrosstrzykawkowej Micro 4 | wyposażenie | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Mikroinkektor i kontroler |
| Aparat do znieczulenia Univentor 400 | wyposażenie | Univentor | 8323001 |
Bibliografia
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. , 3rd edition, Academic Press. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
