In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Podsumowanie

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

Streszczenie

Badanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach jest istotnym obszarem badań, ponieważ zgromadzone informacje przynoszą korzyści zarówno w zastosowaniach przemysłowych, jak i w poszerzaniu podstawowej wiedzy biologicznej. Transfer Energii Rezonansowej Förstera (FRET) pomiędzy cząsteczką donora w stanie wzbudzenia elektronicznego a pobliską cząsteczką akceptora jest często wykorzystywany do badań oddziaływań białko-białko w żywych komórkach. Badane białka są znakowane dwoma różnymi rodzajami sond fluorescencyjnych i eksprymowane w komórkach biologicznych. Następnie sondy fluorescencyjne są wzbudzane, zazwyczaj za pomocą światła laserowego, a właściwości spektralne emisji fluorescencji pochodzącej z sond są zbierane i analizowane. Informacje dotyczące stopnia oddziaływań białkowych są zawarte w danych emisji spektralnej. Zazwyczaj komórka musi zostać przeskanowana wielokrotnie, aby zgromadzić wystarczającą ilość informacji spektralnych do dokładnego ilościowego określenia zakresu oddziaływań białkowych dla każdego obszaru zainteresowania wewnątrz komórki. Jednak skład molekularny tych obszarów może ulec zmianie w trakcie procesu akwizycji, co ogranicza przestrzenną analizę ilościowych wartości pozornej wydajności FRET do średniej z całych komórek. Dzięki zastosowaniu mikroskopu dwufotonowego z rozdzielczością spektralną jesteśmy w stanie uzyskać pełny zestaw obrazów z rozdzielczością spektralną po zaledwie jednym pełnym skanowaniu wzbudzenia badanej próbki. Z tych danych spektralnych na poziomie pikseli obliczana jest mapa wydajności FRET w całej komórce. Poprzez zastosowanie prostej teorii FRET w kompleksach oligomerycznych do eksperymentalnie otrzymanego rozkładu wydajności FRET w całej komórce, pojedynczy skan z rozdzielczością spektralną ujawnia informacje stechiometryczne i strukturalne na temat badanego kompleksu oligomeru. W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowania komórek biologicznych (drożdże Saccharomyces cerevisiae) eksprymujących receptory błonowe (receptory sterylnego czynnika 2 α) znakowane dwoma różnymi rodzajami sond fluorescencyjnych. Ponadto przedstawiamy krytyczne czynniki związane z gromadzeniem danych fluorescencyjnych przy użyciu systemu obrazowania mikroskopii dwufotonowej z rozdzielczością spektralną. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć na badanie każdego rodzaju białka, które może być eksprymowane w żywej komórce z dołączonym markerem fluorescencyjnym.

Protokół

1. Projektowanie plazmidu

Białka będące przedmiotem badania są łączone z jednym z dwóch różnych znaczników fluorescencyjnych, zgodnie z opisem poniżej. Znaczniki fluorescencyjne dostarczają nie tylko informacji o lokalizacji białek w komórce, ale także danych ilościowych dotyczących homo-oligomerizacji białka¹. Do gromadzenia informacji o oddziaływaniach białkowych ^5-10 wykorzystywana jest technika transferu energii między fluoroforami (FRET) ^2-4. FRET opiera się na zasadzie, że transfer energii może nastąpić z optycznie wzbudzonej cząsteczki (zazwyczaj nazywanej donorem, D) do cząsteczki niewzbudzonej (zazwyczaj nazywanej akceptorem, A) poprzez oddziaływania dipol-dipol ¹, jeżeli dwie cząsteczki znajdą się w bliskim sąsiedztwie. Podczas projektowania plazmidów kodujących białka fuzyjne należy wziąć pod uwagę dwie kluczowe kwestie, opisane w następujący sposób.

1. Wybór kompatybilnej pary znaczników fluorescencyjnych ma kluczowe znaczenie w badaniach FRET. Idealnie kombinacja znaczników fluorescencyjnych powinna spełniać dwa kryteria: znaczący overlap długości fal pomiędzy widmem emisyjnym znacznika donora a widmem wzbudzenia znacznika akceptora oraz dużą separację między długością fali środkowej widma impulsu laserowego a widmem wzbudzenia akceptora (tj. duży przesunięcie Stokesa). Dwa warianty zielonej białka fluorescencyjnego^{12, 13} są szczególnie odpowiednie do spełnienia tych kryteriów: GFP₂ jako donor¹⁴ oraz żółte białko fluorescencyjne (YFP)¹² lub jego wariant zwany Venus¹⁵ jako akceptor. Jako donor mógłby być również użyty Cerulean¹⁶, choć z nieco mniej zadowalającymi rezultatami.
2. W ilościowym obrazowaniu FRET najlepiej jest, gdy w kompleksie molekularnym w danym czasie (średnio) wzbudzany jest tylko jeden donor, aby w kompleksach zawierających więcej niż jeden donor i jeden akceptor nie dochodziło do konkurencji między donorami o przekazanie energii temu samemu akceptorowi. Pozwala to na uproszczenia w teorii i procesie analizy danych¹⁷. Z tego powodu poziom sygnału jest zazwyczaj niski. Aby to skompensować, poziom ekspresji badanych białek powinien być stosunkowo wysoki. Wysokie poziomy ekspresji osiąga się poprzez zastosowanie plazmidu o wysokiej liczbie kopii do wprowadzenia genu białka do komórki.

2. Transformacja drożdży

Wskazane jest maksymalne zwiększenie odsetka populacji komórek wykazujących ekspresję interesujących nas konstruktów białkowych. W tym celu transformujemy szczep auksotroficzny komórek drożdży (Saccharomyces cerevisiae), niezdolny do syntezy tryptofanu lub uracylu, dwoma różnymi plazmidami – jednym zawierającym marker selekcyjny dla tryptofanu, a drugim marker dla uracylu. Plazmidy zawierają również geny niosące instrukcje dla komórki do ekspresji białka docelowego znakowanego jedną z dwóch sond fluorescencyjnych. Transformowane komórki hoduje się na płytkach z podłożem stałym, w którym również brakuje tryptofanu i uracylu. Należy transformować co najmniej trzy typy komórek: komórki wykazujące ekspresję białek docelowych znakowanych oboma typami sond fluorescencyjnych, komórki wykazujące ekspresję tylko białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi donora oraz komórki wykazujące ekspresję tylko białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi akceptora.

1. Przygotować płytki z podłożem stałym (1,7 g/L bazy azotowej dla drożdży bez aminokwasów, 1,6 g/L syntetycznego podłoża selekcyjnego dla drożdży bez uracylu i tryptofanu, 2% [m/v] glukozy, 2% [m/v] agaru), które posłużą jako podłoże wzrostowe dla transformowanych komórek, co najmniej jeden dzień przed transformacją komórek. Płytki z podłożem stałym można wykorzystywać do dwóch miesięcy po przygotowaniu, pod warunkiem że nie zostaną zanieczyszczone.
2. Dla każdej pary plazmidów przeznaczonych do transformacji do kolby Erlenmeyera należy dodać 10 ml pożywki YPD (10 g/l ekstraktu drożdżowego Bacto Yeast Extract, 20 g/l peptonu Bacto Peptone i 2% [m/v] glukozy). Pożywkę YPD należy zaszczepić kolonią auxotroficznego szczepu komórek drożdży przeznaczonych do transformacji.
3. Umieścić kolbę Erlenmeyera z kulturą drożdży w inkubatorze z wytrząsarką, która zapewnia próbkom ruch obrotowy, i inkubować przez noc w temperaturze 30° CNastępnego ranka należy rozpocząć monitorowanie wzrostu hodowli komórkowej poprzez okresowe pobieranie niewielkiej objętości kultury i pomiar jej gęstości optycznej (OD). W momencie transformacji hodowla komórkowa powinna znajdować się w środkowej fazie logarytmicznej, tj. przy wartości OD wynoszącej 0,5–1,0.
4. Osad 5 μL obu typów plazmidów do sterylnej probówki do mikrowirówki dla każdej pary plazmidów przeznaczonej do transformacji.
5. Do każdej pary plazmidów przeznaczonych do transformacji dodać 5 μL DNA z plemników łososia (5 mg/ml) do pustej probówki do mikrocentryfugi. Dolną połowę probówki do mikrocentryfugi zawierającej DNA z plemników łososia zanurz w wrzącej wodzie na pięć minut. Aby zapobiec przypadkowemu otwarciu nakrętki probówki, zanurz w wodzie jedynie jej dolną połowę. Po wyjęciu z wrzącej wody umieść probówkę z DNA z plemników łososia w lodzie na co najmniej dwie minuty.
6. Dodaj 5 μL DNA z plemników łososia do każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej plazmidy.
7. Zmierz gęstość optyczną (OD) rosnącej kultury drożdży, aby potwierdzić, że osiągnęła ona średnią fazę logarytmiczną (tj. odczyt OD między 0,5 a 1,0).
8. Wirować zawiesinę drożdży przy 100 x g przez dwie minuty.
9. Odlany supernatant i ponownie zawiesić osad drożdżowy w sterylnej wodzie dejonizowanej za pomocą mieszadła wiertniczego (vortexa).
10. Ponownie odwiruj zawiesinę przy 100xg przez dwie minuty.
11. Odlać supernatant i resuspender osad w roztworze 0,1 M LiOAc w buforze T.E (1,02 g LiAc, 10 ml 1 M Tris o pH 7,4 oraz 10 ml 0,1 M EDTA o pH 8,0). Objętość 0,1 M LiOAc w T.E powinna wynosić 1/10^th objętości pierwotnej kultury drożdży w pożywce YPD.
12. Rozdzielić 100 μL komórek do każdej z probówek do mikrowirówki zawierających plazmidy. Delikatnie potrząśnij każdą probówką, aby wymieszać komórki z plazmidami.
13. Dodaj 400 μL 4% [w/v] glikolu polietylenowego (PEG₄₀₀₀) roztworu do każdej z probówek do mikrocentryfugi.
14. Delikatnie wymieszać PEG₄₀₀₀ z komórkami i plazmidami. Aby uniknąć rozbicia komórek, na tym etapie nie należy używać miksera wortexowego. W celu delikatnego wymieszania należy chwycić palcem wskazującym i kciukiem za zakrętkę oraz dno probówki do mikrocentryfugi, powoli odwrócić probówkę, a następnie powoli przywrócić ją do pozycji pionowej. Obrócić probówkę 90° wokół osi cylindrycznej i powoli odwrócić ponownie. Powtarzać ten proces wielokrotnie, aby komórki przemieściły się po całej powierzchni ścianek probówki do mikrowirówki.
15. Umieść probówki do mikrocentryfugi w 30° inkubować przez 45 minut.
16. Po 45 minutach inkubacji wyjmij komórki z inkubatora i powtórz procedurę delikatnego mieszania opisaną w punkcie 14.
17. Umieść probówki do mikrocentryfugi w 42° umieścić w kąpieli wodnej i inkubować przez 15 minut. Ponownie należy zanurzyć w wodzie tylko dolną połowę probówek do mikrowirówki.
18. Po 42° inkubacja, dodać 1 ml sterylnej wody dejonizowanej do probówek do mikrocentryfugi.
19. Odwiruj probówki w mikrowirówce nakładkowej przez 5 sekund. Usuń nadpływ z probówek za pomocą mikropipety.
20. Dodaj 100 μL sterylizowanej wody dejonizowanej do każdej z probówek do mikrocentryfugi, a następnie wymieszać sterylizowaną wodę dejonizowaną z komórkami, stosując metodę odwracania probówek.
21. Przenieś zawartość pojedynczej probówki do mikrowirówki na płytkę z pożywką wzrostową zapewniającą selekcję konkretnych plazmidów dodanych do tej probówki. Dodaj 4–6 sterylnych szklanych kulek (o średnicy 1 mm). Wstrząśnij płytką zawierającą kroplę transformowanych komórek drożdży oraz szklane kulki tak, aby komórki rozprzestrzeniły się po powierzchni agaru. Powtórz tę procedurę dla każdego zestawu transformowanych komórek.
22. Umieść płytki w 30° inkubator przez 3–5 dni. Po 3–5 dniach na powierzchni pożywki widoczne będą liczne kolonie drożdżów o średnicy 1–3 mm. W tym momencie komórki są gotowe do obrazowania w spektroskopowym dwufotonowym mikroskopie.

3. Kalibracja mikroskopu dwufotonowego z rozdzielczością spektralną

Mikroskop dwufotonowy z rozdzielczością spektralną wykorzystany w tych badaniach został szczegółowo opisany w innej publikacji^{18, 19}. W skrócie, wysokiej mocy laser ciała stałego w trybie ciągłym służy do pompowania lasera Ti:Szafir z blokadą modów, który generuje femtosekundowe impulsy o długościach fal w zakresie od ~750 do 830 nm. Wiązka laserowa jest ogniskowana przez obiektyw mikroskopu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) w plamkę o ograniczonej dyfrakcją na próbce. Pobudzenie następuje wyłącznie w obszarze bliskim ogniska wiązki ze względu na niskie prawdopodobieństwo wzbudzenia dwufotonowego. Para ortogonalnych, sterowanych komputerowo luster skaningowych służy do przesuwania ogniska wiązki w płaszczyźnie próbki w dwóch różnych kierunkach (określanych w całym protokole jako kierunki x i y). Emisja fluorescencji powracająca z oświetlonego woksela próbki jest rozszczepiana na składowe spektralne przez siatkę transmisyjną umieszczoną na drodze emisji, zanim światło padnie na piksele matrycy EM-CCD. W ten sposób pełny profil spektralny dowolnej cząsteczki lub cząsteczek fluorescencyjnych w obszarze ogniskowania wiązki jest uzyskiwany wzdłuż jednego wymiaru (kierunek y) matrycy CCD. Wykorzystując ruch jednego z dwóch luster skaningowych, położenie ogniska lasera może być skanowane w próbce wzdłuż linii prostopadłej do kierunku y. Pozostawiając migawkę kamery CCD otwartą podczas tego pojedynczego skanowania linii, profile spektralne cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się wzdłuż całej linii skanowania są zbierane w jednym pojedynczym przejściu wiązki lasera przez próbkę. Gromadzenie wielu takich skanowań linii w różnych położeniach y wewnątrz komórki pozwala uzyskać profile spektralne licznej grupy kompleksów fluorescencyjnych znajdujących się w próbce. Obrazy uzyskane z linii skanowania są rekonstruowane w celu uzyskania wielu przestrzennych map intensywności fluorescencji x-y próbki przy różnych długościach fal^{18, 19}. Aby dokładnie zrekonstruować i obliczyć rzeczywistą długość fali odpowiadającą przestrzennym mapom intensywności fluorescencji x-y, protokół skanowania linii musi zostać skalibrowany przy użyciu próbki o dobrze scharakteryzowanym widmie emisji fluorescencji.

1. Mikroskop dwufotonowy z rozdzielczością spektralną gromadzi informacje spektralne o kompleksach oligomerów w obrazowanej komórce poprzez skanowanie ogniska wiązki wzbudzenia w wielu punktach badanej próbki.
2. Para ortogonalnych luster skanujących służy do przesuwania ogniska wiązki lasera przez próbkę w dwóch różnych kierunkach. Ruch luster skanujących jest sterowany komputerowo i zsynchronizowany z ekstrakcją danych o intensywności fluorescencji z kamery CCD.
3. Na podstawie skanów liniowych można zrekonstruować przestrzenne mapy intensywności fluorescencji odpowiadające konkretnej długości fali światła. Aby dokładnie zrekonstruować x-y mapy przestrzenne intensywności fluorescencji i obliczenie rzeczywistej długości fali odpowiadającej każdej z tych map, protokół skanowania liniowego musi zostać skalibrowany przy użyciu roztworu fluoresceiny.
4. Aby rozpocząć procedurę kalibracji, ustaw centrum widma wzbudzenia na długości fali 80 nm, co stanowi dwukrotność maksymalnej długości fali wzbudzenia znacznika donora, GFP.₂Aby wycentrować widmo wzbudzenia, należy przesunąć pryzmat znajdujący się wewnątrz wnęki lasera w celu zmiany dyspersji prędkości grupowej. Pryzmat jest zamontowany na sterowanym komputerowo liniowym stole motoryzowanym.
5. Za pomocą programu komputerowego sprzężonego z kamerą wyślij polecenie do chipu CCD, aby obniżyć jego temperaturę do najniższej możliwej wartości w celu zredukowania szumów ciemnych.
6. Pipeta 10 μL roztworu fluoresceiny na szkiełko przedmiotowe. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym w taki sposób, aby cienka warstwa próbki była równomiernie rozprowadzona w obszarze między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem przedmiotowym.
7. Nanieś niewielką kroplę olejku imersyjnego na powierzchnię szkiełka nakrywki.
8. Następnie przymocuj szkiełko przedmiotowe do x-y-z przesuń stół przesuwny wzdłuż osi optycznej, ręcznie regulując siłownik liniowy sterujący ruchem stołu w kierunku osi optycznej. Przesuwaj stół/przesuwkę do momentu, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą oleju imersyjnego.
9. Za pomocą programu komputerowego sterującego kamerą przełącz tryb akwizycji danych na tryb wideo, aby światło emitowane i padające na matrycę CCD było wyświetlane na ekranie komputera w czasie rzeczywistym. Powoli reguluj mikrometr sterujący stolikiem translacyjnym wzdłuż osi optycznej, aby wprowadzić próbkę w obszar ogniskowania wiązki lasera.
10. Gdy próbka fluoresceiny znajdzie się w ogniskowej, emisja pojawi się jako ostra linia na matrycy CCD. Za pomocą programu sterującego kamerą pobierz odczyty intensywności pikseli z matrycy CCD do komputera. Zmierz intensywność pikseli w funkcji położenia na matrycy CCD, otwierając pobraną macierz wartości intensywności w programie Image J i kreśląc linię przechodzącą przez obszar fluorescencji. Użyj polecenia Image J Analyze→Plot Profile, aby utworzyć wykres przedstawiający widmo emisji próbki fluoresceiny.
11. Dostosuj parametr przyrostowy lustra sterującego przesunięciem ogniska lasera w y kierunek, tak aby sąsiednie y pozycje wewnątrz próbki skutkują przesunięciem piku widm fluorescencji dokładnie o jeden piksel wzdłuż wymiaru widmowego matrycy CCD. Należy monitorować to zjawisko, pobierając obraz wartości natężenia widm fluoresceiny dla dwóch różnych y pozycje w próbce, otwarcie obrazów intensywności w programie ImageJ oraz wyznaczenie położenia piksela o najwyższej intensywności dla każdego ze spektra fluorescencji przy użyciu kursora programu ImageJ.
12. Pozostawiając migawkę detektora CCD otwartą, przeskanuj ostrość lasera w poprzek próbki w x kierunek. Światło emitowane z każdego woksela wzdłuż linii skanowania powinno padać na matrycę CCD.
13. Zapisz dane z matrycy CCD uzyskane dla tego skanu liniowego, a następnie wyczyść piksele matrycy CCD.
14. Zmień położenie ogniska lasera w y w kierunku o wartości określonej w kroku 1 tej sekcji.
15. Skanuj wiązkę laserową w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w kierunku poprzecznym do próbki, ponownie otwierając migawkę matrycy CCD i zapisując dane.
16. Powtarzaj tę procedurę skanowania liniowego do momentu, aż laserem zostanie oświetlony obszar fizyczny o ok. 50% większy od wymiarów pojedynczej komórki biologicznej.
17. Zależność między numerem wiersza konkretnego obrazu z liniowego skanowania a długością fali powinna zostać wykorzystana do rekonstrukcji obrazów w celu uzyskania wielu x-y przestrzenne mapy intensywności fluorescencji przy różnych długościach fal. Aby uzyskać x-y obraz emisji fluorescencji dla konkretnej długości fali (λ_j), znajdź numer wiersza na obrazie uzyskanym z pierwszego skanu liniowego, który odpowiada tej długości fali. Następnie sąsiedni wiersz obrazu z kolejnego skanu liniowego odpowiada następnemu wierszowi obrazu emisji fluorescencji dla tej konkretnej długości fali. Zestosuj wszystkie wiersze obrazu odpowiadające tej długości fali, aby uzyskać x-y przestrzenne mapy intensywności fluorescencji próbki przy tej długości fali. Powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych dostępnych długości fal.
18. Aby obliczyć długość fali powiązaną z każdym x-y przestrzenna mapa intensywności fluorescencji, wyznaczyć znormalizowaną intensywność fluorescencji po korekcie tła dla każdego zrekonstruowanego obrazu jako funkcję indeksu obrazu (j). Zależność między pozycją piksela kamery w wymiarze widmowym a długością fali emitowanych fotonów jest w przybliżeniu liniowa; w związku z tym zależność między zrekonstruowanym x-y obrazy przestrzenne intensywności fluorescencji oraz odpowiadająca im długość fali są również liniowe i oblicza się je w następujący sposób:
    gdzie wartość m jest reprezentowany przez:
    W powyższym formalizmie symbol λ_j reprezentuje długość fali j^th rekonstruowany obraz. Wartości λ_maksymalny oraz λ_½ wyodrębnia się ze widma emisyjnego próbki fluoresceiny i odpowiadają one kolejno długościom fal, przy których intensywność fluorescencji fluorescującej próbki osiąga wartość maksymalną oraz połowę wartości maksymalnej. Indeksy obrazów j_maksymalny i j_½ odpowiadają odpowiednio zrekonstruowanym obrazom o maksymalnej intensywności fluorescencji oraz o intensywności stanowiącej połowę wartości maksymalnej.

4. Gromadzenie danych dotyczących wybranych próbek biologicznych

1. Aby zebrać dane z próbek, należy najpierw wyjąć z inkubatora płytki z transformowanymi koloniami drożdży. Powinny być dostępne co najmniej trzy typy transformowanych komórek o określonej szerokości połówkowej maksymalnej (FWHM):
   1. komórki wykazujące ekspresję białek zainteresowania znakowanych obydwoma typami sond fluorescencyjnych
   2. komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych fluorescencyjnymi sondami donora oraz
   3. komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych fluorescencyjnymi sondami akceptora.
2. Do probówki do mikrocentryfugi należy dodać 10 μL 10 mM KCl. Za pomocą końcówki mikropipety należy zeskrobać 3-5 kolonii drożdży z płytki z komórkami wykazującymi ekspresję białek znakowanych zarówno sondami donora, jak i akceptora, a następnie zaszczepić te komórki do 100 mM KCl.
3. Należy pobrać 10 μL zawiesiny komórkowej i nanieść ją na świeże szkiełko przedmiotowe, przykryć kroplę szkiełkiem nakrywką, a na powierzchnię szkiełka nakrywką nanieść kroplę oleju.
4. Należy ręcznie zamknąć migawkę na drodze wiązki lasera, aby zablokować dopływ światła laserowego do obiektywu mikroskopu.
5. Szkiełko przedmiotowe należy przymocować do stolika translacyjnego x-y-z i przesuwać szkiełko/stolik w kierunku osi optycznej, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą oleju imersyjnego.
6. Obraz szerokopolowy próbki będzie silnie rozmyty ze względu na obecność kratki dyfrakcyjnej w ścieżce emisji. Należy zatem umieścić w drodze optycznej przed kratką dyfrakcyjną filtr pasmowy o małej FWHM. Należy włączyć oświetlenie szerokopolowe i przejść do trybu wideo kamery podczas zbierania danych. Należy powoli przesuwać stolik translacyjny w kierunku osi optycznej, obserwując obraz komórek na ekranie kamery, aż komórki zostaną ustawione w ostrości.
7. Należy przesunąć stolik w kierunku x lub y, aby doprowadzić pojedynczą komórkę do punktu ogniskowania wiązki lasera.
8. Należy wyłączyć źródło oświetlenia szerokopolowego i usunąć filtr pasmowy ze ścieżki emisji.
9. Należy odblokować wiązkę lasera na krótki czas (< 1 s), jednocześnie obserwując sygnał odbierany przez matrycę CCD. Jeśli w czasie padania wiązki lasera na komórkę na matrycy CCD zostanie wykryty sygnał fluorescencyjny, należy przeprowadzić pełny skan akwizycji danych fluorescencyjnych tej komórki. Kluczowe jest zastosowanie tych samych parametrów skanowania, a konkretnie liczby linii i przyrostu y, które określono w wcześniej zaprezentowanej procedurze kalibracji.
10. Proces lokalizacji komórek i akwizycji danych fluorescencyjnych należy powtórzyć dla dużej liczby komórek wykazujących ekspresję białek z przyczepionymi znacznikami donora i akceptora.
11. Po zgromadzeniu obrazów fluorescencyjnych komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych obydwoma receptorami, należy powtórzyć cały proces zarówno dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych fluorescencyjnymi sondami donora, jak i komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych fluorescencyjnymi sondami akceptora.
12. Stosując procedurę opisaną w sekcji 3, należy zrekonstruować wszystkie skany, aby uzyskać spektralnie rozdzielcze przestrzenne mapy natężenia fluorescencji x-y dla każdego zestawu danych.

5. Analiza obrazu

Każdy piksel map przestrzennych fluorescencyjnej intensywności x-y, uzyskanych z pojedynczego skanowania fluorescencyjnej komórki biologicznej, zawiera pełny profil widmowy kompleksu molekularnego znajdującego się w wokselu wzbudzenia odpowiadającym temu konkretnemu pikselowi. Jeśli białka będące przedmiotem badania wchodzą ze sobą w interakcje, profil widmowy ten będzie zawierał mieszaninę sygnałów pochodzących zarówno z donora, jak i akceptora sond fluorescencyjnych. Aby określić naturę oddziaływań między badanymi białkami, należy pobrać profile widmowe z dużej liczby takich kompleksów białkowych w komórce i obliczyć dla każdego piksela pozorną wydajność FRET (E_app), zdefiniowaną jako proporcja stanów wzbudzonych donora sondy fluorescencyjnej, które zostają przekazane do akceptora sondy fluorescencyjnej poprzez FRET.

1. Wyznacz skorygowaną o tło intensywność fluorescencji dla każdego z obrazów zrekonstruowanych opisanych w sekcji 4 dla komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych wyłącznie sondami fluorescencyjnymi donora i znormalizuj ją do wartości maksymalnej. Ponieważ każdy z tych zrekonstruowanych obrazów odpowiada oddzielnej długości fali (λ_jten zbiór znormalizowanych wartości intensywności fluorescencji odpowiada zmierzonemu widmu emisji sond donora, i^D (λ_j).
2. Powtórz krok 1 dla komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych wyłącznie znacznikami fluorescencyjnymi akceptora, aby uzyskać pomiar widma emisji sond akceptora. i^A (λ_j). Ponieważ sondę akceptora dobiera się w taki sposób, aby rzadko dochodziło do jej bezpośredniego wzbudzenia za pomocą źródła laserowego, sygnał pochodzący z samych próbek akceptora będzie niski i być może zbliżony do poziomu sygnału autofluorescencji komórek. W związku z tym zmierzone widmo fluorescencji akceptora obliczone w ten sposób może wymagać korekty w celu usunięcia wpływu autofluorescencji przed przejściem do kolejnych etapów.
3. Wykorzystując znormalizowane widma uzyskane w kroku 1 i w kroku 2, należy przeprowadzić dekompozycję spektralną każdego piksela widma emisji fluorescencji komórek wykazujących ekspresję zarówno białek znakowanych donorowymi sondami fluorescencyjnymi, jak i białek znakowanych akcepturowymi sondami fluorescencyjnymi, stosując zależność I(λ_j)= k^DAi^D (λ_j) + k^ADi^A (λ_j) gdzie I(λ_j) reprezentuje widmo fluorescencji zmierzone dla każdego konkretnego piksela. Wartości k^DA i k^{Choroba Alzheimera} są odpowiednio proporcjonalne do emisji fluorescencji donatorów w obecności akceptorów oraz akceptorów w obecności donatorów ⁵.
4. Oblicz pozorną wydajność FRET, która obrazuje oddziaływanie białek w komórce dla każdego piksela, korzystając z wzoru: Tutaj, Q^D i Q^A są odpowiednio wydajnościami kwantowymi sondy fluorescencyjnej donora i sondy fluorescencyjnej akceptora, a W^D i w^A są odpowiednio całkami zunifikowanych widm emisji donora i akceptora^{19, 20}.
5. Na koniec należy stworzyć histogram z obliczonych wartości E_aplikacja dla każdego piksela, w którym liczba powtórzeń konkretnego E_aplikacja wartość występowania jest naniesiona w funkcji tej konkretnej wartości E_aplikacja.

6. Analiza histogramu

Aby uzyskać informacje ilościowe z E_aplikacja histogramy, z których każdy został teoretycznie dopasowany do sumy funkcji Gaussa zgodnie z następującym wzorem:
,
gdzie A_i jest amplitudą, σ_i odchylenie standardowe oraz E_0i najbardziej prawdopodobna wydajność FRET dla i^{Z kwasem (lub z dodatkiem czegoś)} Funkcja Gaussa. Różne rozmiary i konfiguracje oligomerów prowadzą do różnych liczb (n) E_0i oraz różne korelacje między nimi ^{1, 17}Na przykład dla tetrameru o kształcie rombu przewiduje się pięć pików, określonych przez wyrażenia wymienione w Tabeli 1.

Tabela 1.Zależność pomiędzy każdą z pięciu wartości centrów piku Gaussa a przewidywaną parzystą wydajnością FRET dla tetrameru o kształcie rombu.

Oznacza to, że podczas dopasowywania danych należy skorygować tylko jedną wartość E_0i – tę odpowiadającą E_p – podczas gdy pozostałe cztery są obliczane na podstawie wartości E_p.

1. Przyjąć model oligomeru i określić liczbę funkcji Gaussa do dopasowania do histogramów E_app¹. Dopasować histogram, dostosowując parametry E_p, A_i oraz σ_i. Należy zauważyć, że względne rozmieszczenie histogramów jest określone przez model. Zminimalizować wartość chi kwadrat dopasowania lub inną funkcję jakości dopasowania.
2. Przyjąć inny prawdopodobny model oligomeru i powtórzyć krok nr 1.
3. Wybrać model, który najlepiej pasuje do danych w stosunku do liczby użytych parametrów. Może to wymagać zastosowania testu statystycznego (takiego jak chi kwadrat na liczbę stopni swobody).

Reprezentatywne wyniki

Na rysunku 1 przedstawiono wynikowe mapy przestrzenne k^DA, k^AD oraz E_app, obliczone na podstawie pomiarów z mikroskopii dwufotonowej z rozdzielczością spektralną, przeprowadzonych na komórce drożdży wykazującej ekspresję czynnika α Sterile 2 (Ste2p)^{21, 2}.

Rycina 1. Komórka drożdżowa wykazująca ekspresję sterylnego receptora czynnika α2. Dwuwymiarowe mapy donora (k^DA) oraz akceptora (k^{choroba Alzheimera}Sygnały uzyskano w procedurze dekonwolucji widmowej zastosowanej do każdego piksela obrazów wykonanych za pomocą mikroskopu dwufotonowego z rozdzielczością widmową komórki drożdżowej wykazującej ekspresję receptora czynnika $\alpha$ sterylnego 2 (Ste2p). Intensywności fluorescencji zostały oznaczone kolorami sztucznymi zgodnie z ich wartościami, a skala została przedstawiona jako wstawka. Dwuwymiarową mapę pozornych wydajności FRET obliczono przy użyciu k^DA i k^{Choroba Alzheimera} obrazy

Przygotowano wykres histogramu przy użyciu wartości wyekstrahowanych z mapy E_app komórki przedstawionej na rysunku 1. Na rysunku 2 przedstawiono dopasowany wykres histogramu odpowiadający zmierzonym wartościom E_app (kółka) komórki ukazanej na rysunku 1. Czerwona linia ciągła reprezentuje najlepsze dopasowanie do zmierzonych danych z wykorzystaniem sumy poszczególnych funkcji Gaussa (zielone linie ciągłe).

Rysunek 2. Wykres histogramowy E_aplikacja wartości dla komórki drożdżowej wykazującej ekspresję receptora czynnika α Sterile 2. Wykres histogramu odpowiadający zmierzonym wartościom (okręgi) dla E_aplikacja dla komórki przedstawionej na Ryc. 1. Pojedyncze funkcje Gaussa (ciągłe zielone linie) są sumowane w celu symulacji (ciągła czerwona linia) zmierzonych wartości. Parametry funkcji Gaussa wynoszą: E₀₁=16.7; A₁=18,9; σ₁=3.2; E₀₂=25.1; A₂=10,0; σ₂=4.6; E₀₃=32.6; A₃=202,6; σ₃=4.6; E₀₄=40.1; A₄=92,6; σ₄=3.7; E₀₅=50.1; A₅=16,0; σ₅=7.9.

Zależności między średnimi rozkładów Gaussa, niezbędne do dopasowania danych przedstawionych na histogramie na Rysunku 2, podano w Tabeli 1. Liczba i korelacja funkcji Gaussa odpowiadają liczbie i korelacjom między oczekiwanymi wartościami E_app dla kompleksów oligomerów tetramerycznych o kształcie rombu. Zatem z pomiarów dwufotonowych z rozdzielczością spektralną wynika, że kompleks oligomeru Ste2p przyjmuje formę tetrameru o kształcie rombu in vivo¹⁹.

Dyskusja

W niniejszej prezentacji przedstawiliśmy sposób określania wielkości oraz informacji strukturalnych dotyczących kompleksu oligomeru białkowego in vivo. Choć zaprezentowane dane uzyskano dla konkretnego receptora błonowego (tj. Ste2p) ekspresowanego w komórkach drożdży, metoda ta jest uniwersalna i może być zastosowana do każdego rodzaju białka ekspresowanego w dowolnym typie komórek, pod warunkiem, że białka te są znakowane odpowiednimi markerami fluorescencyjnymi. Przyszłe modyfikacje tego protokołu będą obejmo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pepton	Fisher Scientific	BP1420
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422
Glikol polietylenowy 4000	Hampton Research	HR2-605
Podłoże azotowe dla drożdży bez (NH4)2SO4 i aminokwasami	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Suplementy do syntetycznego podłoża selekcyjnego dla drożdży (Drop-out Medium)	Sigma-Aldrich	Y2001
D-glukoza	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Siarczan amonu	Fisher Scientific	A702-500
Chlorek potasu	Acros Organics	424090010
Leucyna	Fisher Scientific	BP385
Histydyna	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Mikroskop dwufotonowy z rozdzielczością spektralną