In vivo (in vivo) Kwantyfikacja oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Podsumowanie

Wykorzystując spektralnie rozdzielczy dwufotonową mikroskopię obrazowania, uzyskuje się mapy na poziomie pikseli efektywności transferu energii rezonansu Förstera (FRET) dla komórek wyrażających receptory błonowe, co do których przypuszczalnie powstają kompleksy homo-oligomeryczne. Na podstawie map wydajności FRET jesteśmy w stanie oszacować informacje stechiometryczne o badanym kompleksie oligomerów.

Streszczenie

Badanie interakcji białek w żywych komórkach jest ważnym obszarem badań, ponieważ zgromadzone informacje przynoszą korzyści zarówno zastosowaniom przemysłowym, jak i zwiększają podstawową podstawową wiedzę biologiczną. Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) (fluorescencji) między cząsteczką donorową w stanie wzbudzonym elektronicznie a pobliską cząsteczką akceptora był często wykorzystywany do badań interakcji białko-białko w żywych komórkach. Interesujące nas białka są znakowane dwoma różnymi typami sond fluorescencyjnych i ulegają ekspresji w komórkach biologicznych. Sondy fluorescencyjne są następnie wzbudzane, zwykle za pomocą światła laserowego, a właściwości spektralne emisji fluorescencji emanującej z sond fluorescencyjnych są zbierane i analizowane. Informacje dotyczące stopnia oddziaływań białek są osadzone w danych dotyczących emisji spektralnej. Zazwyczaj komórka musi być skanowana wiele razy, aby zgromadzić wystarczającą ilość informacji spektralnych, aby dokładnie określić ilościowo zakres interakcji białkowych dla każdego regionu zainteresowania w komórce. Jednak skład molekularny tych regionów może ulec zmianie w trakcie procesu akwizycji, ograniczając przestrzenne określenie wartości ilościowych pozornej wydajności FRET do średniej dla całych komórek. Za pomocą spektralnie rozdzielczego mikroskopu dwufotonowego jesteśmy w stanie uzyskać pełny zestaw obrazów o rozdzielczości spektralnej już po jednym pełnym skanowaniu wzbudzenia interesującej nas próbki. Na podstawie tych danych spektralnych na poziomie pikseli obliczana jest mapa wydajności FRET w całej komórce. Stosując prostą teorię FRET w kompleksach oligomerycznych do uzyskanego eksperymentalnie rozkładu wydajności FRET w komórce, pojedynczy skan o rozdzielczości spektralnej ujawnia informacje stechiometryczne i strukturalne o badanym kompleksie oligomerowym. W tym miejscu opisujemy procedurę przygotowania komórek biologicznych (drożdży Saccharomyces cerevisiae) eksprymujących receptory błonowe (sterylne receptory 2-czynnikowe α) oznaczone dwoma różnymi typami sond fluorescencyjnych. Ponadto ilustrujemy krytyczne czynniki związane z gromadzeniem danych fluorescencyjnych za pomocą spektralnie rozdzielczego systemu obrazowania mikroskopii dwufotonowej. Stosowanie tego protokołu może zostać rozszerzone na badanie dowolnego rodzaju białka, które może ulegać ekspresji w żywej komórce z dołączonym do niej markerem fluorescencyjnym.

Protokół

1. Konstrukcja plazmidu

Interesujące nas białka są połączone z jednym z dwóch różnych znaczników fluorescencyjnych, jak opisano dalej. Znaczniki fluorescencyjne dostarczają nie tylko informacji o lokalizacji białek w komórce, ale także informacji ilościowych dotyczących homooligomeryzacji białka¹. Technika rezonansu fluorescencyjnego (FRET) ^2-4 służy do gromadzenia informacji o oddziaływaniach białek ^5-10. FRET wykorzystuje zasadę, że transfer energii może nastąpić z cząsteczki wzbudzonej optycznie (zwykle określanej jako donor, D) do cząsteczki niewzbudzonej (zwykle określanej jako akceptor, A) poprzez oddziaływania dipol-dipol ¹¹, jeśli dwie cząsteczki znajdują się blisko siebie. Projektując plazmidy kodujące białka fuzyjne, należy pamiętać o dwóch kluczowych cechach, a mianowicie.

1. Wybór kompatybilnej pary znaczników fluorescencyjnych ma ogromne znaczenie w badaniach FRET. W idealnej sytuacji kombinacja znaczników fluorescencyjnych musi spełniać dwa kryteria: znaczne nakładanie się długości fal między widmem emisyjnym znacznika donorowego a widmem wzbudzenia znacznika akceptora oraz dużą separacją między środkową długością fali widma impulsu laserowego a widmem wzbudzenia akceptora (tj. duże przesunięcie Stokesa). Dwa warianty białka zielonej fluorescencji^{12, 13} są szczególnie dobrze przystosowane do spełnienia tych kryteriów: GFP₂ jako dawca¹⁴ i żółte białko fluorescencyjne (YFP)¹² lub jego wariant zwany Wenus¹⁵ jako akceptor. Cerulean¹⁶ może być również wykorzystany jako dawca, choć z nieco skromniejszymi wynikami.
2. W ilościowym obrazowaniu FRET najlepiej, jeśli tylko jeden donor w kompleksie molekularnym jest wzbudzany w tym samym czasie (średnio), tak aby nie występowała konkurencja między dawcami o przeniesienie energii do tego samego akceptora w kompleksach zawierających więcej niż jednego donora i jeden akceptor. Prowadzi to do uproszczeń w teorii i procesie analizy danych¹⁷. Z tego powodu poziom sygnału jest zwykle niski. Aby to zrekompensować, poziom ekspresji interesujących nas białek powinien być stosunkowo wysoki. Wysokie poziomy ekspresji osiąga się dzięki zastosowaniu plazmidu o wysokiej kopii do przenoszenia genu białka do komórki.

2. Przemiana drożdży

Korzystne jest maksymalizowanie procentu populacji komórek wyrażających interesujące nas konstrukty białkowe. W tym celu przekształcamy auksotroficzny szczep komórek drożdży (Saccharomyces cerevisiae), niezdolny do wytwarzania tryptofanu lub uracylu, z dwoma różnymi plazmidami, jednym zawierającym selektywny marker tryptofan i drugi marker uracyl. Plazmidy zawierają również geny, które zawierają instrukcje dla komórki dotyczące ekspresji interesującego białka oznaczonego jedną z dwóch sond fluorescencyjnych. Przekształcone komórki są hodowane na stałych płytkach pożywki, w których brakuje również tryptofanu i uracylu. Transformacji powinny ulec co najmniej trzy typy komórek: komórki wykazujące ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania znakowane obydwoma typami sond fluorescencyjnych, komórki wykazujące ekspresję tylko białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi dawcy oraz komórki wyrażające tylko białka znakowane akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.

1. Przygotować stałe płytki (1,7 g/l drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 1,6 g/l syntetycznej pożywki drożdżowej bez uracylu i tryptofanu, 2% [w/v] glukozy, 2% [w/v] agaru), które zostaną użyte jako pożywka wzrostowa dla transformowanych komórek co najmniej jeden dzień przed transformacją komórkową. Płytki z twardym podłożem mogą być używane do dwóch miesięcy po przygotowaniu, jeśli pozostają wolne od jakichkolwiek zanieczyszczeń.
2. Dla każdej pary plazmidów, która ma zostać przekształcona, dodać 10 ml YPD (10 g/l ekstraktu drożdżowego Bacto, 20 g/l peptonu baktonowego i 2% [w/v] glukozy) do kolby Erlenmeyera. Włączyć YPD do kolonii auksotroficznego szczepu komórek drożdży, które mają zostać przekształcone.
3. Umieścić kolbę Erlenmeyera zawierającą kulturę drożdży w wytrząsarce laboratoryjnej, która zapewnia orbitalne działanie wirowe na próbki, i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego ranka rozpocznij monitorowanie wzrostu kultury komórkowej, okresowo usuwając niewielką objętość kultury i testując jej gęstość optyczną (OD). Wzrost hodowli komórkowej powinien znajdować się w środkowej fazie logarytmicznej, tj. OD 0,5-1,0, w momencie transformacji.
4. Umieścić 5 μl obu typów plazmidów w sterylnej probówce mikrowirówkowej dla każdej pary plazmidów, która ma zostać przekształcona.
5. Dla każdej pary plazmidów, która ma zostać przekształcona, dodać 5 μl DNA plemników łososia (5 mg/ml) do pustej probówki do mikrowirówki. Zanurz dolną połowę probówki mikrowirówki zawierającej DNA plemników łososia we wrzącej wodzie na pięć minut. Aby zapobiec otwieraniu się nasadki probówki do mikrowirówki, zanurzaj w wodzie tylko dolną połowę probówek do mikrowirówek. Po wyjęciu z wrzącej wody umieścić probówkę mikrowirówki zawierającą DNA plemników łososia w lodzie na co najmniej dwie minuty.
6. Dodać 5 μl DNA plemników łososia do każdej probówki mikrowirówki zawierającej plazmidy.
7. Zmierz OD rosnącej kultury drożdży, aby potwierdzić, że osiągnęła ona środkową fazę logarytmiczną (tj. odczyt OD między 0,5 a 1,0).
8. Odwiruj zawiesinę drożdży o sile 1000 x g przez dwie minuty.
9. Odlewać sklarat osadu i ponownie zawiesić granulki drożdży w wysterylizowanej wodzie dejonizowanej za pomocą mieszalnika wirowego.
10. Ponownie odwirować zawiesinę o wymiarach 1000xg przez dwie minuty.
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze 0,1 M LiOAc w T.E (1,02 g LiAc, 10 ml 1M Tris przy pH 7,4 i 10 ml 0,1 M EDTA przy pH 8,0). Objętość 0,1 M LiOAc w T.E powinna być równa 1/100 pierwotnej objętości kultury drożdży w YPD.
12. Rozprowadzić 100 μl komórek do każdej z probówek mikrowirówek zawierających plazmidy. Delikatnie przesuń każdą probówkę, aby wymieszać komórki z plazmidami.
13. Dodać 400 μl 44% [w/v] roztworu glikolu polietylenowego (PEG₄₀₀₀) do każdej z probówek do mikrowirówek.
14. Delikatnie wymieszaj PEG₄₀₀₀ z komórkami i plazmidami. Aby uniknąć pęknięcia komórek, nie używaj w tym momencie miksera wirowego. Aby delikatnie wymieszać, przytrzymaj nasadkę mikrowirówki i spód probówki mikrowirówki między palcem wskazującym a kciukiem, powoli odwróć probówkę, a następnie powoli przywróć probówkę z powrotem do pozycji pionowej. Obróć rurkę o 90° wokół jej cylindrycznej osi i powoli odwróć ponownie. Powtórz ten proces kilka razy, aby komórki zsunęły się po całej powierzchni ścianek probówki do mikrowirówki.
15. Umieść probówki do mikrowirówek w inkubatorze pod kątem 30° na 45 minut.
16. Po 45 minutach inkubacji wyjąć komórki z inkubatora i powtórzyć procedurę delikatnego mieszania opisaną w pkt 14.
17. Umieścić probówki do mikrowirówek w łaźni wodnej o temperaturze 42° i inkubować przez 15 minut. Ponownie zanurz w wodzie tylko dolną połowę probówek mikrowirówek.
18. Po inkubacji w temperaturze 42° dodać 1 ml wysterylizowanej wody dejonizowanej do probówek mikrowirówek.
19. Odwiruj probówki w stołowym mikrofugowaniu przez 5 sekund. Usunąć supernatant z probówek za pomocą mikropipetera.
20. Dodaj 100 μl wysterylizowanej wody dejonizowanej do każdej z probówek mikrowirówek i wymieszaj wysterylizowaną wodę dejonizowaną z komórkami w procesie inwersji.
21. Dodać zawartość pojedynczej probówki do mikrowirówki na płytkę pożywki wzrostowej, która wybiera konkretne plazmidy dodane do tej probówki do mikrowirówki. Dodaj 4-6 wysterylizowanych szklanych koralików (średnica 1 mm). Wstrząsnąć płytką zawierającą kroplę przekształconych komórek drożdży i szklane kulki, aby komórki zostały rozprowadzone na powierzchni pożywki do wzrostu agaru. Powtórz ten proces dla każdego zestawu przekształconych komórek.
22. Umieść płytki w inkubatorze 30° na 3-5 dni. Po 3-5 dniach na powierzchni podłoża wzrostowego będzie widocznych wiele kolonii drożdży o średnicy 1-3 mm. W tym czasie komórki są gotowe do obrazowania w spektralnie rozdzielczym mikroskopie dwufotonowym.

3. Kalibracja mikroskopu dwufotonowego o rozdzielczości spektralnej

Mikroskop dwufotonowy o rozdzielczości spektralnej używany w tych badaniach został szczegółowo opisany gdzie indziej^{18, 19}. Krótko mówiąc, laser półprzewodnikowy o dużej mocy z falą ciągłą służy do pompowania lasera Ti: Sapphire z blokadą trybu, który generuje impulsy femtosekundowe o długości fal od ~750 do 830 nm. Wiązka laserowa jest skupiana przez obiektyw mikroskopu o wysokim wskaźniku NA w miejscu na próbce, które jest ograniczone dyfrakcją. Wzbudzenie występuje tylko w bliskim obszarze ogniskowym wiązki ze względu na niskie prawdopodobieństwo wzbudzenia dwufotonowego. Para ortogonalnych, sterowanych komputerowo luster skanujących służy do przesuwania ogniska wiązki w płaszczyźnie próbki w dwóch różnych kierunkach (określanych jako kierunki x i y w całym protokole). Wstecznie rozchodząca się emisja fluorescencji z oświetlonego woksela próbki jest rozpraszana na składowe widmowe przez siatkę transmisyjną umieszczoną na drodze emisji, zanim światło padnie na piksele układu EM-CCD. W ten sposób pełny profil spektralny dowolnej cząsteczki/cząsteczki fluorescencji w obszarze ogniskowym wiązki uzyskuje się wzdłuż jednego wymiaru (kierunku y) matrycy CCD. Wykorzystując ruch jednego z dwóch zwierciadeł skanujących, można zeskanować położenie ogniska lasera w próbce wzdłuż linii prostopadłej do kierunku y. Utrzymując otwartą migawkę kamery CCD podczas tego skanowania jednoliniowego, profile widmowe cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się wzdłuż całej linii skanowania są zbierane w jednym przemiataniu wiązki laserowej po próbce. Akumulacja wielu skanów liniowych tego rodzaju w różnych lokalizacjach y w komórce daje profile spektralne dużej liczby kompleksów fluorescencyjnych znajdujących się w próbce. Obrazy uzyskane ze skanów liniowych są rekonstruowane w celu uzyskania wielu map przestrzennych intensywności fluorescencji x-y próbki na różnych długościach fal^{18, 19}. W celu dokładnej rekonstrukcji i obliczenia rzeczywistej długości fali odpowiadającej mapom przestrzennym intensywności fluorescencji x-y, protokół skanowania liniowego musi być skalibrowany przy użyciu próbki o dobrze scharakteryzowanym widmie emisyjnym fluorescencji.

1. Mikroskop dwufotonowy o rozdzielczości spektralnej gromadzi informacje spektralne o kompleksach oligomerowych w obrazowanej komórce, skanując ognisko wiązki wzbudzenia w próbce będącej przedmiotem zainteresowania w wielu miejscach.
2. Para ortogonalnych luster skanujących służy do przesuwania ogniska wiązki laserowej na próbkę w dwóch różnych kierunkach. Ruch luster skanujących jest sterowany komputerowo i zsynchronizowany z ekstrakcją danych o intensywności fluorescencji z kamery CCD.
3. Na podstawie skanów liniowych można zrekonstruować mapy przestrzenne natężenia fluorescencji odpowiadające określonej długości fali światła. W celu dokładnej rekonstrukcji map przestrzennych intensywności fluorescencji x-y i obliczenia rzeczywistej długości fali odpowiadającej każdej z tych map, protokół skanowania linii musi zostać skalibrowany przy użyciu roztworu fluoresceiny.
4. Aby rozpocząć procedurę kalibracji, należy wyśrodkować widmo wzbudzenia na długości fali 800 nm, co stanowi 2 razy większą długość fali wzbudzenia znacznika dawcy, GFP₂. Aby wyśrodkować widmo wzbudzenia, przesuń pryzmat znajdujący się we wnęce lasera, aby zmodyfikować dyspersję prędkości grupy. Pryzmat jest zamontowany na sterowanym komputerowo liniowym stoliku z napędem silnikowym.
5. Korzystając z programu komputerowego, do którego podłączona jest kamera, wyślij polecenie do układu CCD, aby obniżyć temperaturę chipa CCD do najniższej osiągalnej temperatury w celu zmniejszenia ciemnego szumu.
6. Pobrać pipetą 10 μl roztworu fluoresceiny na szkiełko mikroskopowe. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym tak, aby cienka warstwa próbki była równomiernie rozproszona w obszarze między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym.
7. Umieść małą kroplę olejku immersyjnego na powierzchni szkiełka nakrywkowego
8. Teraz przymocuj szkiełko mikroskopu do stolika translacyjnego x-y-z i przesuń szkiełko/stolik w kierunku osi optycznej, ręcznie regulując siłownik liniowy, który steruje ruchem stolika w kierunku osi optycznej. Przesuwaj szkiełko/stolik do momentu, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku immersyjnego.
9. Za pomocą programu komputerowego sterującego kamerą należy przełączyć się w tryb wizyjnej akwizycji danych, dzięki czemu emitowane światło padające na matrycę CCD jest wyświetlane na ekranie komputera w czasie rzeczywistym. Powoli wyreguluj mikrometr kontrolujący etap translacji w kierunku osi optycznej, aby wprowadzić próbkę do ogniska wiązki laserowej.
10. Gdy próbka fluoresceiny jest ostra, emisja pojawi się jako ostra linia na matrycy CCD. Pobierz odczyt intensywności pikseli z matrycy CCD do komputera za pomocą programu komputerowego sterującego kamerą. Zmierz intensywność pikseli w funkcji położenia na matrycy CCD, otwierając pobraną matrycę wartości intensywności na obrazie J i rysując linię przechodzącą przez obszar fluorescencyjny. Użyj polecenia Obraz J Analizuj→Profil wykresu, aby utworzyć wykres ilustrujący widmo emisyjne próbki fluoresceiny.
11. Wyregulować parametr przyrostowy zwierciadła, który steruje ruchem ogniska lasera w kierunku y, tak aby sąsiednie pozycje y w próbce powodowały ruch piku widm fluorescencyjnych o dokładnie jeden piksel wzdłuż wymiaru widmowego na matrycy CCD. Monitoruj to, pobierając obraz wartości intensywności widm fluoresceiny dla dwóch różnych pozycji y w próbce, otwierając obrazy intensywności za pomocą obrazu J i znajdując pozycję piku pikseli dla każdego z widm fluorescencji za pomocą kursora Obraz J.
12. Pozostawiając otwartą migawkę matrycy CCD, zeskanuj ostrość lasera w poprzek próbki w kierunku x. Światło emitowane z każdego woksela wzdłuż linii skanowania powinno padać na matrycę CCD.
13. Zapisz dane z macierzy CCD uzyskane dla tego skanowania liniowego, a następnie wyczyść piksele tablicy CCD.
14. Przesuń położenie ostrości lasera w kierunku y o wartość określoną w kroku 11 tej sekcji.
15. Zeskanuj wiązkę laserową w kierunku x w poprzek próbki, ponownie pozostawiając otwartą migawkę matrycy CCD i zapisz dane.
16. Powtarzaj tę procedurę skanowania linii, aż obszar fizyczny ~50% większy niż wymiary pojedynczej komórki biologicznej zostanie oświetlony światłem laserowym.
17. Zależność między numerem wiersza określonego obrazu skanowania liniowego a długością fali powinna być wykorzystana do rekonstrukcji obrazów w celu uzyskania wielu map przestrzennych intensywności fluorescencji x-y na różnych długościach fal. Aby uzyskać obraz emisji fluorescencji x-y dla określonej długości fali (λ_j), znajdź numer wiersza na obrazie uzyskanym z pierwszego skanowania linii, który odpowiada tej długości fali. Następnie sąsiedni wiersz kolejnego obrazu skanowania liniowego odpowiada następnemu wierszowi obrazu emisji fluorescencji dla tej konkretnej długości fali. Ułóż wszystkie wiersze obrazu, które odpowiadają tej długości fali, aby uzyskać mapy przestrzenne intensywności fluorescencji x-y próbki o tej długości fali. Powtórz tę procedurę dla wszystkich innych możliwych do uzyskania długości fal.
18. Aby obliczyć długość fali skojarzoną z każdą mapą przestrzenną intensywności fluorescencji x-y, należy określić znormalizowaną intensywność fluorescencji skorygowaną o tło każdego zrekonstruowanego obrazu w funkcji indeksu obrazu (j). Zależność między położeniem pikseli kamery w wymiarze widmowym a długością fali emitowanych fotonów jest w przybliżeniu liniowa; W związku z tym zależność między zrekonstruowanymi obrazami mapy przestrzennej intensywności fluorescencji X-Y a odpowiadającą im długością fali jest również liniowa i obliczana w następujący sposób:
    gdzie wartość m jest reprezentowana przez:
    W powyższym formalizmie symbol λ_j reprezentuje długość fali zrekonstruowanego obrazu. Wartości λ_max i λ_1/2 są ekstrahowane z widma emisyjnego próbki fluoresceiny i odpowiadają długościom fal, przy których intensywność fluorescencji próbki fluorescencyjnej wynosi odpowiednio maksimum i połowę maksimum. Indeksy obrazu j_max i j_1/2 odpowiadają zrekonstruowanym obrazom o maksymalnej intensywności fluorescencji i połowie maksymalnej.

4. Zbieranie danych o próbkach biologicznych będących przedmiotem zainteresowania

1. Aby zebrać dane o próbkach, najpierw wyjmij z inkubatora płytki z przekształconymi koloniami drożdży. Powinny istnieć co najmniej trzy typy transformowanych komórek o pełnej szerokości i połowie maksimum (FWHM):
   1. Komórki wyrażające interesujące białka oznaczone obydwoma typami sond fluorescencyjnych
   2. komórki wykazujące ekspresję tylko białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi dawcy, oraz
   3. komórki wykazujące ekspresję tylko białek oznaczonych akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.
2. Dodać 100 μl ze 100 mM KCl do probówki mikrowirówkowej. Za pomocą końcówki do mikropipet zeskrob 3-5 kolonii drożdży z płytki komórek wyrażających białka oznaczone zarówno sondami fluorescencyjnymi dawcy, jak i akceptora, a następnie zaszczepij 100 mM KCl tymi komórkami.
3. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i napełnić ją świeżym szkiełkiem mikroskopowym, przykryć kroplę szkiełkiem nakrywkowym i umieścić kroplę oleju na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
4. Ręcznie zamknij migawkę na drodze wiązki laserowej, aby zablokować światło lasera przed dotarciem do obiektywu mikroskopu.
5. Przymocuj szkiełko mikroskopu do stolika translacyjnego x-y-z i przesuwaj szkiełko/stolik w kierunku osi optycznej, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku immersyjnego.
6. Obraz o szerokim polu widzenia próbki będzie mocno rozmyty ze względu na obecność siatki transmisyjnej na ścieżce emisji. Dlatego umieść filtr pasmowo-przepustowy z małym FWHM w torze optycznym poprzedzającym siatkę transmisyjną. Włącz oświetlenie światłem o szerokim polu i przejdź do trybu zbierania danych wideo z kamery. Powoli przesuwaj etap translacji w kierunku osi optycznej, oglądając obraz komórek na ekranie aparatu, aż komórki zostaną ustawione w ostrości
7. Przesuń stolik w kierunku x lub y, aby przesunąć pojedynczą komórkę w miejsce, w którym skupia się wiązka laserowa.
8. Wyłącz źródło oświetlenia o szerokim polu widzenia. Usuń filtr pasmowo-przepustowy ze ścieżki emisji.
9. Odblokuj wiązkę laserową na krótki czas (< 1 sekundę), jednocześnie oglądając sygnał odbierany na matrycy CCD. Jeśli sygnał fluorescencyjny zostanie wykryty na matrycy CCD w czasie, gdy wiązka laserowa pada na komórkę, wykonaj pełne skanowanie tej komórki w celu uzyskania danych fluorescencyjnych. Istotne jest, aby używać tych samych parametrów skanowania, w szczególności liczby linii i przyrostu y, jak określono w procedurze kalibracji przedstawionej wcześniej.
10. Powtórz proces lokalizacji komórki i pozyskiwania danych fluorescencyjnych dla dużej liczby komórek wykazujących ekspresję białek przyłączonych zarówno do znaczników dawcy, jak i znaczników akceptorowych.
11. Po zgromadzeniu obrazów fluorescencyjnych komórek wyrażających białka oznaczone obydwoma receptorami, powtórz cały proces dla obu komórek wyrażających tylko białka znakowane sondami fluorescencyjnymi dawcy i komórek wyrażających tylko białka oznaczone akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.
12. Korzystając z procedury opisanej w sekcji 3, zrekonstruuj wszystkie skany, aby uzyskać mapy przestrzenne o rozdzielczości spektralnej x-y fluorescencji dla każdego zestawu danych.

5. Analiza obrazu

Każdy piksel map przestrzennych intensywności fluorescencji x-y, które wynikają z pojedynczego skanu fluorescencyjnej komórki biologicznej, zawiera pełny profil spektralny kompleksu molekularnego znajdującego się w wokselu wzbudzenia odpowiadającym temu konkretnemu pikselowi. Jeśli interesujące nas białka oddziałują ze sobą, ten profil spektralny będzie zawierał mieszaninę sygnałów zarówno z sondy fluorescencyjnej donorowej, jak i akceptorowej. W celu określenia charakteru oddziaływań między białkami będącymi przedmiotem zainteresowania, należy pobrać próbki profili spektralnych z dużej liczby tych kompleksów białkowych w komórce, a pozorną skuteczność FRET (E_app ) zdefiniować jako proporcję stanów wzbudzonych sondy fluorescencyjnej donora, które są przenoszone do akceptorowej sondy fluorescencyjnej za pośrednictwem FRET, każdego piksela musi zostać obliczona.

1. Określ intensywność fluorescencji z korekcją tła dla każdego ze zrekonstruowanych obrazów opisanych w sekcji 4 dla komórek wyrażających białka oznaczone tylko sondami fluorescencyjnymi dawcy i znormalizuj do wartości maksymalnej. Ponieważ każdy z tych zrekonstruowanych obrazów odpowiada oddzielnej długości fali (λ_j), ten zbiór znormalizowanych wartości intensywności fluorescencji odpowiada zmierzonemu widmu emisji sond donorowych, i^D (λ_j).
2. Powtórz krok 1 dla komórek wykazujących ekspresję białek znakowanych tylko akceptorowymi znacznikami fluorescencyjnymi, aby uzyskać zmierzone widmo emisyjne sond akceptorowych, ^{i A} (λ_j). Ponieważ sonda akceptorowa jest wybierana w taki sposób, że rzadko jest bezpośrednio wzbudzana za pomocą źródła laserowego, sygnał emitowany z próbek tylko akceptora będzie niski i prawdopodobnie tego samego rzędu wielkości, co sygnał autofluorescencji nieodłącznie związany z komórkami. W związku z tym zmierzone widmo fluorescencji akceptora obliczone w ten sposób może wymagać korekty w celu usunięcia udziału autofluorescencji przed kontynuowaniem.
3. Korzystając ze znormalizowanego widma uzyskanego w kroku 1 i w kroku 2, rozłożyć spektralnie każdy piksel widma emisji fluorescencji komórek wyrażających zarówno białka znakowane sondami fluorescencyjnymi donorowymi, jak i białka znakowane akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi przy użyciu relacji I(λ_j)= k^DAi^D (λ_j) + k^ADi^A (λ_j), gdzie I(λ_j) reprezentuje każdy konkretny piksel mierzone widmo fluorescencji. Wartości k^DA i k^AD są proporcjonalne do emisji fluorescencji od donorów w obecności akceptorów i od akceptorów w obecności dawców, odpowiednio ⁵.
4. Oblicz pozorną wydajność FRET, która odwzorowuje interakcję białek w komórce w każdym pikselu, korzystając ze wzoru . Tutaj Q^D i Q^A są wydajnością kwantową odpowiednio donorowej sondy fluorescencyjnej i akceptorowej sondy fluorescencyjnej, a w^D i w^A są całkami znormalizowanego widma emisyjnego donorowego i akceptorowego, odpowiednio^{19, 20}.
5. Na koniec utwórz histogram przy użyciu obliczonych wartości _aplikacji E dla każdego piksela, gdzie liczba wystąpień określonej wartości aplikacji E jest wykreślana w stosunku do tej konkretnej wartości _aplikacji E.

6. Analiza histogramu

Aby wyodrębnić informacje ilościowe z histogramów _aplikacji E, każdy histogram jest teoretycznie dopasowany do sumy funkcji Gaussa, zgodnie z następującym wzorem:
,
gdzie A_i jest amplitudą, σ_i odchyleniem standardowym, a E_0i najbardziej prawdopodobną wydajnością FRET funkcji Gaussa ^i-tym. Różne rozmiary i konfiguracje oligomerów prowadzą do różnych liczb (n) E_{0i i różnych korelacji} między nimi ^{1, 17}. Na przykład dla tetrameru w kształcie rombu przewiduje się pięć pików, określonych przez wyrażenia wymienione w tabeli 1.

Tabela 1.Zależność między każdą z pięciu wartości środka piku Gaussa a wydajnością FRET parami przewidzianą dla tetrameru w kształcie rombu.

Oznacza to, że tylko jedna wartość E_0i musi być dostosowana w procesie dopasowywania danych - ta odpowiadająca E_p - podczas gdy pozostałe cztery są obliczane na podstawie wartości E_p.

1. Załóżmy, że przyjęliśmy model oligomerowy i określimy liczbę gaussianów, które mają być użyte do dopasowania histogramów _aplikacji E ¹. Dopasuj histogram, dostosowując E_p, A_i oraz σ_i. Należy pamiętać, że względne rozmieszczenie histogramów jest ustalane przez model. Zminimalizuj kwadrat chi dopasowania lub innej funkcji dobroci dopasowania.
2. Załóżmy inny prawdopodobny model oligomerowy i powtórz krok numer 1.
3. Wybierz model, który najlepiej pasuje do danych dla liczby używanych parametrów. Może to wymagać zastosowania testu statystycznego (takiego jak chikwadrat na liczbę stopni swobody).

Reprezentatywne wyniki

Na rysunku 1 zilustrowano wynikowe mapy przestrzenne aplikacji k^DA, k^AD i E, obliczone na podstawie spektralnie rozdzielczych pomiarów mikroskopii dwufotonowej wykonanych na komórce drożdży wyrażającej sterylny czynnik 2 α (Ste2p)^{21, 22}.

Rysunek 1. Komórka drożdży wykazująca ekspresję sterylnego receptora 2 czynników α. Dwuwymiarowe mapy sygnałów donorowych (k^DA) i akceptorowych (k^AD) uzyskano z procedury dekonwolucji spektralnej zastosowanej do każdej lokalizacji piksela obrazów wykonanych za pomocą spektralnie rozdzielczego mikroskopu dwufotonowego komórki drożdży wykazującej ekspresję sterylnego receptora 2 czynników α (Ste2p). Intensywności fluorescencji są przypisywane fałszywe kolory zgodnie z ich wartościami, a skala jest pokazana jako wstawka. Dwuwymiarową mapę pozornej sprawności progów obliczono przy użyciu obrazów k^DA i k^AD.

Wykres histogramu został przygotowany przy użyciu wartości wyodrębnionych z mapy _aplikacji E komórki pokazanej na rysunku 1. Na rysunku 2 przedstawiono dopasowany wykres histogramu odpowiadający zmierzonym wartościom E_app (okręgom) komórki przedstawionej na rysunku 1. Czerwona linia ciągła reprezentuje najlepsze dopasowanie do mierzonych danych przy użyciu sumy poszczególnych funkcji Gaussa (zielone linie ciągłe).

Rysunek 2. Wykres histogramu wartości _{E app} dla komórki drożdży wyrażającej sterylny receptor czynnika α 2. Pokazano wykres histogramu, który odpowiada zmierzonym wartościom (okręgom) _aplikacji E dla komórki przedstawionej na rysunku 1. Poszczególne funkcje Gaussa (ciągłe zielone linie) są sumowane w celu symulacji (ciągła czerwona linia) zmierzonych wartości. Parametry funkcji Gaussa to: E₀₁=16,7; A₁=118,9; σ₁=3,2; E₀₂=25,1; A₂=100,0; σ₂=4,6; E₀₃=32,6; A₃=202,6; σ₃=4,6; E₀₄=40,1; A₄=92,6; σ₄=3,7; E₀₅=50,1; A₅=16,0; σ₅=7,9.

Relacje między średnimi Gaussa potrzebne do dopasowania danych przedstawionych na histogramie rysunku 2 są podane w Tabeli 1. Liczba i korelacja między funkcjami Gaussa odpowiada liczbie i korelacjom między oczekiwanymi wartościami E_app dla kompleksów tetramerowych oligomerów w kształcie rombu. W związku z tym z pomiarów dwufotonowych w rozdzielczości spektralnej wynika, że kompleks oligomerów Ste2p przyjmuje postać tetrameru w kształcie rombu in vivo¹⁹.

Dyskusja

W tej prezentacji zilustrowaliśmy, w jaki sposób określić wielkość i informacje strukturalne o kompleksie oligomerów białkowych in vivo. Chociaż przedstawione dane uzyskano ze specyficznego receptora błonowego (tj. Ste2p) ulegającego ekspresji w komórkach drożdży, metoda jest wszechstronna, ponieważ można ją zastosować do dowolnego rodzaju białka ulegającego ekspresji w dowolnym typie komórki, z jedynym zastrzeżeniem jest to, że białka są znakowane odpowiednimi markerami fluorescencyjnymi. Przyszłe modyfikacje ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422
Glikol polietylenowy 4000	Hampton Research	HR2-605
Drożdżowa baza azotowa w/o (NH4)2SO4 i aminokwasy	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Drożdże Syntetyczne pożywki typu drop-out Suplementy	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glukoza	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Siarczan amonu	Fisher Scientific	A702-500
Chlorek potasu	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan achromat Nieskończoność Skorygowany obiektyw 100x zanurzeniowy w oleju NA=1.43	Instrumenty
Spektralnie rozdzielczy mikroskop dwufotonowy