Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE

Podsumowanie

Wiele infekcji wywołuje silną odpowiedź CTL, jednak sporadycznie liczba komórek odpowiadających nie koreluje z kontrolą patogenu¹. Jedną z miar jakości CTL jest ich zdolność do specyficznego zabijania². Oznakowanie komórek docelowych za pomocą CFSE może być wykorzystane do zbadania jakości tej odpowiedzi CTL in vivo^3,4.

Streszczenie

estrym sukcynimidylowym diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) można wykorzystać do łatwego i szybkiego znakowania populacji komórek interesujących badacza w celu przeprowadzenia badań in vivo. Znakowanie to klasycznie stosowano do badania proliferacji i migracji. W prezentowanej tutaj metodzie skrócono czas po transferze adopcyjnym, aby zbadać przeżywalność i eliminację specyficznych dla epitopu komórek docelowych znakowanych CFSE^4-6. Poziom specyficznej eliminacji klonu limfocytów T CD8+ może wskazywać na jakość odpowiedzi, ponieważ ich liczba może być myląca. Specyficzne limfocyty T CD8+ mogą z czasem ulec funkcjonalnemu wyczerpaniu, co objawia się spadkiem produkcji cytokin i zdolności do eliminacji komórek^7,8. Ponadto niektóre klony limfocytów T CD8+ mogą nie eliminować komórek tak skutecznie jak inne o odmiennej specyficzności TCR⁹. Aby zapewnić skuteczną odporność komórkową (CMI), należy zidentyfikować antygeny, które indukują nie tylko odpowiednią liczbę reagujących limfocytów T, ale także limfocyty T reagujące w sposób funkcjonalnie wydajny. W niniejszej pracy oceniamy procent specyficznej eliminacji komórek przez dwa klony limfocytów T specyficznych dla peptydów u myszy BALB/c.

Protokół

1. Indukowanie specyficznych dla celu efektorowych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) poprzez immunizację (dzień 0)

1. Przed rozpoczęciem należy wybrać konkretny układ efektor:cel. W tym przykładzie klasycznego testu CTL in vivo wykorzystamy immunizację oczyszczonym peptydem w celu wywołania specyficznych limfocytów T CD8 +. Ten sam peptyd zostanie użyty do pulsowania syngenicznych komórek docelowych, tworząc specyficzny układ efektor:cel. Alternatywnie można zdecydować się na użycie całego patogenu lub białka w celu uzyskania specyficznych efektorów i celów.
2. Zdezynfekować powierzchnię roboczą wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC), aby zapewnić sterylność wstrzykiwań. Przygotować immunizację peptydową, umieszczając najpierw 50 μg oczyszczonego peptydu w 10 μL 10% DMSO w PBS/mysim w probówce o pojemności 2 mL. Następnie dodać taką samą ilość bardzo schłodzonego niepełnego adjuwantu Freunda i uzupełnić do poziomu 0,2 mL, dodając kuleczki o średnicy 1 mm do mieszania. Od tego momentu przechowywać immunogen na lodzie aż do momentu wstrzyknięcia. Zamknąć pokrywkę Parafilmem.
3. Użyć homogenizatora kulowego (bead beater) ustawionego na maksymalne RPM, aby mieszać emulsję przez 3 minuty, a następnie niezwłocznie umieścić emulsję z powrotem na lodzie. Otrzymana emulsja powinna mieć konsystencję zbliżoną do majonezu. Jeśli czas na to pozwala, pozostawić emulsję w temperaturze 4° C na noc (do tygodnia), mieszając ponownie w przypadku zauważenia rozwarstwienia.
4. Użyć strzykawki 1 mL i igły o rozmiarze 20 lub 20,5 G, aby pobrać emulsję, uważając, by nie pobrać żadnych kuleczek (kuleczki powinny być większe niż światło igły, niemniej należy zachować ostrożność).
5. Utrzymać mysz w celu wykonania wstrzyknięcia podskórnego u nasady ogona. Używamy zmodyfikowanej plastikowej probówki stożkowej 50 mL, aby bezpiecznie i delikatnie unieruchomić mysz do iniekcji. Wstrzyknąć myszy 0,2 mL emulsji.

2. Pozyskiwanie komórek docelowych (Dzień 8)

1. Do uzyskania komórek docelowych będą potrzebne naiwne myszy syngeniczne. Eutanazję naiwnych myszy należy przeprowadzić zgodnie ze standardami AAALAC.
2. Zdezynfekuj mysz, rozpylając 70% etanol, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia włosami myszy lub innymi zanieczyszczeniami zewnętrznymi.
3. Za pomocą nożyczek do sekcji wykonaj niewielkie nacięcie skóry po lewej stronie myszy. Odchyl płat skóry, aby odsłonić jamę otrzewną i organy wewnętrzne.
4. Przetnij otrzewną, uważając, aby nie uszkodzić żadnego z leżących poniżej organów. Śledziona znajduje się blisko powierzchni i ma kolor podobny do wątroby (ciemnoczerwony), ale jest mniejsza i ma kształt fasoli. Myszy zainfekowane zazwyczaj mają znacznie większe śledziony niż niezinfekowane kontrolne.
5. Ostrożnie wyjmij śledzionę, dbając o delikatność, aby nie rozbić jej na kilka części, w celu odzyskania maksymalnej liczby komórek. Natychmiast umieść śledzionę w probówce stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL przygotowanego medium na lodzie. Powtórz czynność dla pozostałych myszy.
6. Przelej zawartość probówki stożkowej 15 mL (medium i śledzionę) do szklanego homogenizatora tkankowego. Rozetrzyj śledzionę, używając znacznej siły ramienia. Gdy cała tkanka straci swój kolor, można założyć, że wszystkie komórki zostały wydzielone z tkanki łącznej.
7. Przelej zawartość homogenizatora przez filtr komórkowy 70 μm do probówki stożkowej 50 mL. Przepłucz homogenizator świeżym medium i przelej przez sito komórkowe.
8. Wiruj przy 4° C, 130 RPM przez 7 minut. Odlej nadsącz.
9. Resuspenduj w 10 mL przygotowanego odczynnika lizującego i inkubuj przy 37° przez 7 minut.
10. Uzupełnij objętość do 50 mL świeżym medium i wiruj w tych samych warunkach, co powyżej.
11. Resuspenduj w 50 mL świeżego medium i wiruj w tych samych warunkach, co powyżej (etap płukania). *Uwaga: Na tym etapie można przeprowadzić magnetyczną separację komórek w celu wyizolowania konkretnego typu komórek (np. makrofagów), jeśli do transferu do myszy biorców wymagana jest czysta populacja komórek docelowych. Ponadto na tym etapie można wprowadzić do hodowli czynnik eksperymentalny, aby zbadać wpływ tego działania na specyficzne zabijanie komórek.
12. Policz komórki i nanieś 1 x 10⁷ na studzienkę w 10μL na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z okrągłym dnem. *Jest to wysoka koncentracja komórek na studzienkę, ale ponieważ test jest krótki, nie zaobserwowano spadku żywotności komórek przy tej koncentracji.

3. Traktowanie i znakowanie komórek docelowych

1. Hulkuj odpowiednie komórki i powtórzenia peptydem specyficznym dla patogenu lub kontrolnym peptydem nieistotnym: dodaj 1 μg/mL peptydu. Inkubuj w temperaturze 4° C przez 1,5 godziny. Przenieś do inkubatora 37° C na ostatnie 30 minut. W tym czasie przygotuj odczynnik CFSE.
2. Przygotuj CFSE zgodnie ze specyfikacjami producenta i rozcieńcz do stężenia roboczego między 0,5 a 25 μM. Przygotuj stężenie „niskie” 10x mniejsze niż stężenie „wysokie” CFSE. Na przykład, dla [niskiego] dodaj 0,5 μL CFSE do 10 mL PBS, a dla [wysokiego] dodaj 5 μL CFSE do 10 mL PBS. Podgrzej przygotowany CFSE do 37° C przed znakowaniem.
3. Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i odwiruj w wirówce do wysokich prędkości w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.
4. Resuspenduj komórki w CFSE o stężeniu [niskim] lub [wysokim], dodając 20 μL odpowiedniego odczynnika do odpowiadających im studzienek i inkubuj przez 15 minut w 37° C.
5. Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i ponownie odwiruj w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.
6. Resuspenduj komórki w 20 μL/studzienkę podgrzanej świeżej pożywki i inkubuj przez 30 minut w 37°C.
7. Wyjmij płytkę z komórkami z inkubatora i odwiruj w temperaturze pokojowej, 130 RPM przez 7 minut. Odchyl płytkę, aby usunąć nadsącz.
8. Resuspenduj komórki w 10 μL/studzienkę PBS.
9. Dla transferu adoptywnego dodaj komórki oznakowane stężeniem [niskim] z jednej studzienki do komórek oznakowanych stężeniem [wysokim] z jednej studzienki na mysz. Wynikowa iniekcja powinna zawierać 50% specyficznych celów i 50% komórek nieistotnych w objętości .2 mLs.
10. Pamiętaj, aby odłożyć część oznakowanych komórek, które będą służyć jako kontrole nietransferowane podczas analizy danych i pomiarów w cytometrze przepływowym (patrz Rysunek 1).

4. Transfer adopcyjny

1. Zanurzyć w narkozie myszy uprzednio immunizowane peptydem (z części nr 1 niniejszego protokołu) zgodnie ze standardami AAALAC.
2. Wstrzyknąć .2 mL oznakowanych komórek docelowych drogą zakrwawno-orbitarną myszom biorcom.
3. Odczekać 6 godzin lub inny ustalony optymalny czas przed uśmierceniem myszy biorców.

5. Pozyskiwanie znakowanych komórek

*Uwaga: Kroki od 5.1 do 5.1 są takie same jak kroki od 2.1 do 2.1

12. Policz komórki i wysiej w ilości 1 x 10⁶ na studnię w 100 μL do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z okrągłym dnem.
13. Utrwal odzyskane i nieprzeniesione komórki, dodając 100 μL 2% paraformaldehydu do wszystkich studni, aby uzyskać końcowe stężenie 1% paraformaldehydu.

6. Cytometria przepływowa i analiza danych

1. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego i dokonaj analizy danych.

7. Reprezentatywne wyniki

Zmniejszający się pik specyficzny dla epitopu na otrzymanym histogramie jest wskaźnikiem specyficznego zabijania komórek (Rycina 1). Należy zastosować następujące równania (wykorzystane w Tabeli 1) w celu określenia rzeczywistej wartości specyficznej lizy komórek:
Stosunek = Procent nieistotny : Procent specyficzny dla epitopu (pik [niski]:pik [wysoki]),
Procent specyficznej lizy = [1-(Stosunek kontroli bez transferu/Stosunek eksperymentalny)] x 100

Rysunek 1. Profil CFSE odzyskanych splenocytów myszy szczepu BALB/c. Liczby wskazują procent komórek o wysokim lub niskim fenotypie CFSE. A) Kontrola bez transferu. Wszystkie piki CFSE [high] reprezentują komórki docelowe specyficzne dla epitopu, natomiast piki CFSE [low] reprezentują komórki docelowe stymulowane nieistotnym peptydem. B) Komórki znakowane CFSE odzyskane z myszy biorcy immunizowanej PBS (kontrola). C) Komórki znakowane CFSE odzyskane z dwóch różnych myszy biorców specyficznych dla peptydu; zwróć uwagę na zmniejszenie pików specyficznych dla epitopu.

Rysunek 2. Graficzna prezentacja analizowanych danych. Dla każdej grupy myszy (PBS, Peptyd A i Peptyd B) przedstawiono trzy punkty danych.

Próbka	CFSE HIGH % po stymulacji epitopem	% CFSE LOW Nieistotne	Stosunek niskiego do wysokiego	Procent specyficznej cytotoksyczności wobec epitopu
PBS	42.8	57.2	1.34	16.97
PBS	43.1	56.9	1.32	15.94
PBS	44.3	55.7	1.26	11.74
Peptyd A	39.7	60.3	1.52	32.56
Peptyd A	38.6	61.4	1.59	35.61
Peptyd A	40.6	59.4	1.46	29.99
Peptyd B	38.7	61.3	1.58	24.68
Peptyd B	38.5	61.5	1.60	25.32
Peptyd B	39.3	60.7	1.54	22.76
Kontrola PBS NT	47.4	52.6	1.11
Kontrola Pep A NT	49.4	50.6	1.02
Kontrola Pep B NT	45.6	54.4	1.19

Tabela 1. Analiza reprezentatywnych danych. "NT" oznacza brak transferu (non-transferred).

Dyskusja

Metodę tę można zmodyfikować w celu zbadania zdolności komórek do proliferacji, w tym ekspansji klonalnej, ponieważ CFSE dzieli się stosunkowo równomiernie pomiędzy komórki potomne^10,11. Możliwe jest również wykorzystanie znakowania CFSE do badania migracji komórek^6,12, choć w zależności od postawionej hipotezy mogą istnieć inne, bardziej odpowiednie metody śledzenia komórek, na przykład tetramery i bioluminescencja¹³, które mogą być również łączone ze znakowaniem CFSE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kuleczki szklane 1 mm	Biospec Products	11079110
Sito do komórek 70 μm	BD Biosciences	352350
Płytka 96-dołkowa	Costar	3799
Niepełny adjuwant Freunda Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant	Pacific Immunology	n/a
DMSO	Sigma-Aldrich	D-5879
FBS	GIBCO, by Life Technologies	16000-077
Cytometr przepływowy FC 500	Beckman Coulter Inc.	n/a
Szklany homogenizator do tkanek Kontes	Kontes Corp	885300-0015
Mini Beadbeater	Biospec Products	n/a
Igła	BD Biosciences	305175
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM992
Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	157-8
PBS	GIBCO, by Life Technologies	10010-023
Odczynnik lizujący PharmLyse	BD Biosciences	555899
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875-093
Strzykawka	BD Biosciences	309602
Zestaw Vybrant CFSE	Invitrogen	V12883