Wiele infekcji wywołuje silną odpowiedź CTL, jednak sporadycznie liczba komórek odpowiadających nie koreluje z kontrolą patogenu1. Jedną z miar jakości CTL jest ich zdolność do specyficznego zabijania2. Oznakowanie komórek docelowych za pomocą CFSE może być wykorzystane do zbadania jakości tej odpowiedzi CTL in vivo3,4.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Swoisty dla antygenu In vivo Test zabijania z użyciem komórek docelowych znakowanych CFSE
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
estrym sukcynimidylowym diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) można wykorzystać do łatwego i szybkiego znakowania populacji komórek interesujących badacza w celu przeprowadzenia badań in vivo. Znakowanie to klasycznie stosowano do badania proliferacji i migracji. W prezentowanej tutaj metodzie skrócono czas po transferze adopcyjnym, aby zbadać przeżywalność i eliminację specyficznych dla epitopu komórek docelowych znakowanych CFSE4-6. Poziom specyficznej eliminacji klonu limfocytów T CD8+ może wskazywać na jakość odpowiedzi, ponieważ ich liczba może być myląca. Specyficzne limfocyty T CD8+ mogą z czasem ulec funkcjonalnemu wyczerpaniu, co objawia się spadkiem produkcji cytokin i zdolności do eliminacji komórek7,8. Ponadto niektóre klony limfocytów T CD8+ mogą nie eliminować komórek tak skutecznie jak inne o odmiennej specyficzności TCR9. Aby zapewnić skuteczną odporność komórkową (CMI), należy zidentyfikować antygeny, które indukują nie tylko odpowiednią liczbę reagujących limfocytów T, ale także limfocyty T reagujące w sposób funkcjonalnie wydajny. W niniejszej pracy oceniamy procent specyficznej eliminacji komórek przez dwa klony limfocytów T specyficznych dla peptydów u myszy BALB/c.
Protokół
1. Indukowanie specyficznych dla celu efektorowych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) poprzez immunizację (dzień 0)
- Przed rozpoczęciem należy wybrać konkretny układ efektor:cel. W tym przykładzie klasycznego testu CTL in vivo wykorzystamy immunizację oczyszczonym peptydem w celu wywołania specyficznych limfocytów T CD8 +. Ten sam peptyd zostanie użyty do pulsowania syngenicznych komórek docelowych, tworząc specyficzny układ efektor:cel. Alternatywnie można zdecydować się na użycie całego patogenu lub białka w celu uzyskania specyficznych efektorów i celów.
- Zdezynfekować powierzchnię roboczą wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metodę tę można zmodyfikować w celu zbadania zdolności komórek do proliferacji, w tym ekspansji klonalnej, ponieważ CFSE dzieli się stosunkowo równomiernie pomiędzy komórki potomne10,11. Możliwe jest również wykorzystanie znakowania CFSE do badania migracji komórek6,12, choć w zależności od postawionej hipotezy mogą istnieć inne, bardziej odpowiednie metody śledzenia komórek, na przykład tetramery i bioluminescencja13, które mogą być również łączone ze znakowaniem CFSE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów. Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na The University of Wisconsin-Madison.
Podziękowania
Chciałbym podziękować Biance Mothé, Carli Oseroff oraz Marie-France DelGuercio za wprowadzenie mnie w zakres testów immunologicznych i obsługi myszy. Prace w laboratorium G. A. Splittera są finansowane z grantu NIH 1-RO1-AI-073558, grantu GLRCE 1-U54-AI-057153 oraz BARD US-3829-06.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kuleczki szklane 1 mm | Biospec Products | 11079110 | |
| Sito do komórek 70 μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Płytka 96-dołkowa | Costar | 3799 | |
| Niepełny adjuwant Freunda Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| Cytometr przepływowy FC 500 | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Szklany homogenizator do tkanek Kontes | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Igła | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| Odczynnik lizujący PharmLyse | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Strzykawka | BD Biosciences | 309602 | |
| Zestaw Vybrant CFSE | Invitrogen | V12883 |
Bibliografia
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
