Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Podsumowanie

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Streszczenie

Powszechnie uważa się, że akumulacja peptydu β-amyloidu (Aβ) odgrywa kluczową rolę w indukcji choroby Alzheimera, jednak odpowiednie mechanizmy toksyczności pozostają niejasne. Aβ odkłada się również w mięśniach w przebiegu zapalenia mięśni z ciałami inkluzyjnymi, ciężkiej ludzkiej miopatii. Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego Aβ. W zależności od tkanki lub czasu ekspresji Aβ, nicienie transgeniczne mogą wykazywać łatwo mierzalne fenotypy, które służą jako wskaźnik toksyczności Aβ. Na przykład nicienie transgeniczne z panneuronalną ekspresją Aβ wykazują deficyty w uczeniu się asocjacyjnym (Dosanjh et al. 2009), podczas gdy nicienie transgeniczne z konstytutywną ekspresją specyficzną dla mięśni wykazują postępujący, zależny od wieku fenotyp paraliżu (Link, 1995; Cohen et al. 2006). Jeden szczególnie użyteczny model C. elegans wykorzystuje mutację wrażliwą na temperaturę w systemie nadzoru mRNA, aby uzyskać indukowaną temperaturą ekspresję transgenu Aβ w mięśniach, co skutkuje powtarzalnym fenotypem paraliżu po podniesieniu temperatury (Link et al. 2003). Metody leczenia przeciwdziałające toksyczności Aβ w tym modelu [np. ekspresja transgenu ochronnego (Hassan et al. 2009) lub ekspozycja na ekstrakty z Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] w powtarzalny sposób zmieniają tempo paraliżu indukowanego wzrostem temperatury u tych transgenicznych nicieni. W niniejszym opracowaniu opisujemy nasz protokół pomiaru tempa paraliżu w tym transgenicznym modelu C. elegans, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych eksperymentalnych, które mogą wpływać na ten pomiar.

Protokół

1) Przygotowanie płytek z pożywką do wzrostu nicieni do testu paraliżu.

Testy paraliżu przeprowadza się na standardowych płytkach z pożywką NGM (Nematode Growth Media), rutynowo stosowanych do hodowli i badań genetycznych C. elegans (Stiernagle, 2006).

1. Roztwór NGM zawierający NaCl, Agar i Pepton w kolbie Erlenmeyera poddać autoklawowaniu, a następnie dodać odpowiednie ilości sterylnego CaCl₂, uracylu, cholesterolu, 1M MgSO₄ oraz 1M KPO₄. Do każdej szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm odmierzyć 10 mL ciekłego NGM. Pozostawić NGM do zastygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.
2. W przypadku badania wpływu związków/ekstraktów, nanieść ekstrakt na każdą płytkę i za pomocą rozwieracza równomiernie rozprowadzić go po powierzchni szalki. Pozostawić ekstrakt do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Objętości przekraczające 1 mL będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.
3. Na każdą płytkę nanieść kroplą 250 μL szczepu E. coli OP5O hodowanego przez noc w pożywce LB do uzyskania gęstości optycznej 0,4–0,6. Pozostawić bakterie do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

Istotne zmienne

Wiek szalek ma istotny wpływ na test paraliżu, ponieważ starsze szalki mają tendencję do wysychania. Należy używać szalek przygotowanych nie wcześniej niż tydzień przed wykonaniem testu paraliżu. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy przygotować szalki na 3-4 dni przed zainicjowaniem synchronicznych populacji nicieni [patrz punkt (2) poniżej]. W każdym eksperymencie należy używać wyłącznie szalek przygotowanych z tej samej partii.

Zmiana wielkości trawnika bakteryjnego (np. punktowy w porównaniu z rozlanym) i/lub rodzaju bakterii wpłynie również na zachowanie nicieni. Testy paraliżu można przeprowadzać, wykorzystując alternatywne szczepy E. coli jako źródło pożywienia (np. szczep HT115 stosowany w eksperymentach RNAi poprzez podawanie w pożywce), jednak może to zmienić kinetykę paraliżu, co wymaga zastosowania odpowiednich kontroli wewnętrznych.

2) Przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku

Szczep CL4176 (smg-1(cc546^ts) I; dvIs27 [myo-3/ minigen Aβ + gen markerowy rol-6(su1006)] X) jest najczęściej stosowany do badania paraliżu indukowanego przez Aβ. Ten szczep oraz inne modele transgeniczne są dostępne dla pracowników naukowych z uczelni za niewielką opłatą z Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Aby zmaksymalizować synchronizację wieku populacji testowej, zaleca się rozpoczęcie od zsynchronizowanego pokolenia rodzicielskiego. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu populacji testowej, za pomocą platynowej igły do przenoszenia nicieni należy przenieść 20-30 dorosłych osobników z jajami (gravid adults) na kilka płytek NGM o średnicy 10 cm z wysianym szczepem OP50, aby umożliwić składanie jaj przez 2 godziny w temperaturze 16°C (temperatura dopuszczalna dla szczepu CL4176). Następnie należy usunąć dorosłe osobniki i pozwolić potomstwu rosnąć przez 7 dni, aż osiągną etap dorosłych osobników z jajami w „drugim dniu”.
2. (Dzień 1) Dorosłe osobniki z jajami w drugim dniu są wykorzystywane do przygotowania zsynchronizowanych pod względem wieku populacji testowych. Celem dla każdego warunku doświadczalnego jest przygotowanie trzech powtórzeń na płytkach, z których każda zawiera 50-75 zsynchronizowanych pod względem wieku nicieni. Za pomocą platynowej igły do przenoszenia nicieni należy przenieść 10-12 dorosłych osobników z jajami z drugiego dnia na płytki NGM o średnicy 60 mm (objętość 10 mL) z naniesionym szczepem OP50. Należy pozwolić nicieniom składać jaja w temperaturze 16°C przez 2 godziny, a następnie usunąć dorosłe osobniki i pozwolić jajom wykluć się oraz rosnąć w temperaturze 16°C. Na tym etapie najlepiej, aby płytki zostały zakodowane przez osobę, która nie będzie przeprowadzać oceny, tak aby oceniający nie znał warunków doświadczalnych.

Istotne zmienne

Stadium rozwoju embrionalnego w momencie składania jaj (~stadium 26 komórek dla nicieni typu dzikiego w optymalnych warunkach) jest funkcją wieku oraz odżywienia osobników dorosłych. Jeśli użyte do przygotowania populacji testowej dorosłe samice ciężarne są starsze lub głodzone, składane będą jaja w późniejszym stadium, co zmniejszy synchronizację wieku populacji oraz powtarzalność kinetyki paraliżu. Niezbędne jest stosowanie kultur monoaksenicznych (tj. zawierających wyłącznie bakterie OP50), ponieważ zanieczyszczenia mikrobiologiczne mogą poważnie wpłynąć na ten test; powtarzalność jest najwyższa, gdy na trzech powtórzonych płytkach znajduje się podobna liczba nicieni.

3) Indukcja transgenu i test paraliżu

1. (Dzień 3) Przenieś płytki do temperatury 25°C 48 godzin po zakończeniu synchronicznego znoszenia jaj; nicienie powinny znajdować się w trzecim stadium larwalnym (L3). Płytki należy ułożyć w inkubatorze w 25°C bez nakładania ich na siebie, aby wszystkie osiągnęły temperaturę 25°C w tym samym czasie.
2. (Dzień 4) Rozpocznij ocenę paraliżu nicieni (szczep CL4176) od 18 do 20 godzin po rozpoczęciu wzrostu temperatury. W tym momencie wszystkie nicienie w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne (L4). Kontynuuj ocenę w odstępach dwugodzinnych, aż wszystkie nicienie na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie postępuje równomiernie wzdłuż ciała: region głowy jest ostatnią częścią nicienia, która przestaje się poruszać. W związku z tym nicienie, u których niedawno rozpoczął się paraliż, nie mogą przemieszczać się po płytce, ale mogą poruszać głowami, oczyszczając w ten sposób bakterie wokół przedniej części ciała i pozostawiając „halo” oczyszczonych bakterii. Nicienie te nieuchronnie ulegną całkowitemu paraliżowi, dlatego nicienie z halo są klasyfikowane jako sparaliżowane. Niektóre nicienie nie będą miały halo, ale również nie wykażą spontanicznego ruchu; są one sprawdzane poprzez dotknięcie zgłębnikiem do nicieni. Jeśli dotknięty nicień nie jest w stanie wykonać pełnej fali skurczu ciała, jest on również oceniany jako sparaliżowany. Aby usprawnić ocenę, najłatwiej jest przenieść sparaliżowane nicienie do nieoznaczonego sektora płytki, tak aby nie zostały one nieumyślnie ponownie ocenione w następnym okresie. (Pozwala to również błędnie sklasyfikowanym nicieniom wykazać ruch, co umożliwia korektę oceny).
3. Aby wygenerować krzywą paraliżu, w każdym punkcie czasowym frakcja nicieni na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczana na procent, a średni procent „niesparaliżowanych” jest nanoszony na wykres w funkcji czasu od momentu rozpoczęcia wzrostu temperatury. (Uzasadnieniem dla takiego sposobu przedstawienia danych jest fakt, że wynikowa krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżywalności, a zatem może być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżywalności).

Istotne zmienne

Podwyższenie temperatury u transgenicznych nicieni myo-3/Aβ musi nastąpić przed osiągnięciem przez nie połowy stadium L4, aby zainicjować paraliż, ponieważ promotor myo-3 jest regulowany rozwojowo i wykazuje znacząco obniżoną ekspresję w późnym stadium L4 lub u osobników dorosłych. Podobnie, ekspresja tego transgenu jest blokowana w przypadku zagłodzenia nicieni, dlatego niezbędne jest, aby zwierzęta były dobrze karmione przez cały czas trwania eksperymentu. Nigdy nie zaobserwowano, aby sparaliżowany nicień powrócił do sprawności w żadnych warunkach, a po 12-16 hr podwyższenia temperatury wszystkie nicienie szczepu CL4176 ulegną paraliżowi, nawet jeśli zostaną przeniesione z powrotem do 16°C. W szczepie CL4176 wystarczająca nadekspresja transgenu prowadząca do paraliżu może wystąpić w niższych temperaturach (tj. 20-25°C), choć czas wystąpienia paraliżu ulegnie zmianie. Tempo paraliżu zależy od konkretnego użytego szczepu transgenicznego (stworzyliśmy szczepy myo-3/Aβ o tempie paraliżu zarówno szybszym, jak i wolniejszym niż w przypadku CL4176), zatem w przypadku alternatywnych szczepów może być konieczna korekta okna oceny.

4) Reprezentatywne wyniki

Na Rysunku 1 przedstawiono wykres krzywej paraliżu dla szczepu CL4176, zarówno nieleczonego, jak i eksponowanego na 6,27 mM kofeiny (stężenie końcowe na płytce NGM). Zabieg ten skutkuje wysoce istotnym statystycznie opóźnieniem paraliżu o około 4 h, co interpretujemy jako dowód na supresję toksyczności Aβ w tym modelu. Na Rysunku 2 przedstawiono niezależny eksperyment badający efekty kafestolu, innego związku występującego w kawie. Wykres ten jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność Aβ. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL4176 jest sparaliżowana w 24 h, a paraliż jest całkowity do 28 h. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu kontrolnych populacji CL4176. Znaczne odchylenia od tego czasu świadczą o zmienionych warunkach środowiskowych lub spontanicznej delecji kopii transgenu. (CL4176 zawiera zintegrowaną z chromosomem macierz transgeniczną z wieloma kopiami transgenu myo-3/Aβ. Chociaż ta macierz transgeniczna jest zazwyczaj dość stabilna, każda propagacja szczepu w temperaturach >16°C spowoduje selekcję rzadkich osobników, u których doszło do spontanicznej delecji transgenów, co prowadzi do powstania wariantów o obniżonej ekspresji Aβ i wolniejszym przebiegu paraliżu).

Rysunek 1. Krzywa paraliżu dla nicieni szczepu CL4176 nieleczonych lub eksponowanych na 6.27 mM kofeiny (Sigma). Wskazane czasy liczone są od momentu rozpoczęcia podwyższenia temperatury. Słupki błędów = S.E.M.

Rysunek 2. Krzywa paraliżu dla nicieni CL4176 poddanych działaniu 0.48 mM kafestolu (Sigma). Słupki błędów = S.E.M.

Dyskusja

Opisany przez nas protokół może być skutecznie wykorzystany do badania wpływu związków na toksyczność Aβ. Opublikowane przykłady obejmują wpływ składników ekstraktu z Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) oraz rezerpiny (Arya et al. 2009). Wykazano również, że związki, które działały ochronnie przeciwko toksyczności Aβ w innych układach, wykazują działanie ochronne także w tym modelu (np. memantyna, nasze niepublikowane wyniki). Istotnym uzasadnieniem dla opracowania tego modelu jest fakt, że dobrze rozwinięte narzędzia genetyczne i molekularne dostępne dla C. elegans mogą być wykorzystane do badania mechanizmów toksyczności Aβ. W związku z tym można badać wpływ specyficznych mutacji na toksyczność Aβ (np. efekt redukcji sygnalizacji insulinopodobnej poprzez wprowadzenie mutacji utraty funkcji daf-2, Florez-McClure et al. 2007), a model ten może służyć również do badania efektów nadekspresji transgenów (Fonte et al. 2008). Ostatnio w szerokim zakresie wykorzystaliśmy ten model do zbadania wpływu pojedynczych podstawień aminokwasowych w Aβ na toksyczność (dane niepublikowane).

Opisany tutaj model transgeniczny służy do badania wpływu ostrej ekspresji Aβ na funkcje komórek mięśniowych. W momencie wystąpienia paraliżu komórki mięśniowe i ich sarkomery pozostają nienaruszone; fenotyp paraliżu nie jest wynikiem śmierci komórek mięśniowych. Jednak po wystąpieniu paraliżu (~48 hr po początkowym podniesieniu temperatury) dochodzi do utraty integralności mięśni i ostatecznie do śmierci nicieni. Nie badaliśmy tego wtórnego efektu ekspresji Aβ i nie wykorzystywaliśmy go jako markera toksyczności.

Opisany tutaj model indukowalnej ekspresji Aβ nie jest odpowiedni do badania terapii modulujących samo tworzenie się β-amyloidu. Chociaż robaki transgeniczne z konstytutywną ekspresją Aβ tworzą łatwo wykrywalne złogi amyloidowe (Fay et al. 1998; Link et al. 2001), robaki transgeniczne z indukowalną ekspresją Aβ rzadko wykazują złogi amyloidu, a fenotyp paraliżu wydaje się niezależny od odkładania się amyloidu (Drake et al. 2003). Nasze wyniki są zgodne z poglądem, że ostra toksyczność indukowalnej ekspresji Aβ wynika z akumulacji rozpuszczalnych oligomerów Aβ, a nie z odkładania się amyloidu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl (6g)	Sigma-Aldrich	S9888
Agar (40g)	Sigma-Aldrich	A7002
Pepton (5g)	Sigma-Aldrich	P0556
ddH2O (2L)
1M CaCl2 (2mL)			147,02mg/mL w ddH2O
Uracyl (2mL)			2mg/mL w ddH2O
Cholesterol (2mL)			5mg/mL w etanolu (nie autoklawować)
1M MgSO4 (2mL)			246,5mg/mL w ddH2O
1M KPO4 (50mL)			98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL w ddH2O, pH
Kolba Erlenmeyera	VWR international