Oznaczanie toksyczności β-amyloidu przy użyciu transgenicznego modelu C. elegans

Podsumowanie

Intensywnie badany robak Caenorhabditis elegans może być transgenicznie zmodyfikowany do ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidowego (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który można wykorzystać do monitorowania leczenia modulującego toksyczność Aβ.

Streszczenie

Akumulacja peptydu β-amyloidu (Aβ) jest ogólnie uważana za kluczową dla indukcji choroby Alzheimera, ale odpowiednie mechanizmy toksyczności są nadal niejasne. Aβ jest również odkładany domięśniowo w zapaleniu mięśni ciała inkluzyjnego, ciężkiej ludzkiej miopatii. Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może być transgenicznie zmodyfikowany do ekspresji ludzkiego Aβ. W zależności od tkanki lub czasu ekspresji Aβ, transgeniczne robaki mogą mieć łatwo mierzalne fenotypy, które służą jako odczyt toksyczności Aβ. Na przykład transgeniczne robaki z panneuronalną ekspresją Aβ mają defekty uczenia się asocjacyjnego (Dosanjh i in. 2009), podczas gdy transgeniczne robaki z konstytutywną ekspresją specyficzną dla mięśni wykazują postępujący, zależny od wieku fenotyp paraliżu (Link, 1995; Cohen i in. 2006). Jeden ze szczególnie użytecznych modeli C. elegans wykorzystuje wrażliwą na temperaturę mutację w systemie nadzoru mRNA w celu zaprojektowania indukowanej temperaturą ekspresji mięśniowej transgenu Aβ, co skutkuje powtarzalnym fenotypem paraliżu po zmianie temperatury w górę (Link i in. 2003). Zabiegi, które przeciwdziałają toksyczności Aβ w tym modelu [np. ekspresja ochronnego transgenu (Hassan i in. 2009) lub ekspozycja na ekstrakty z miłorzębu japońskiego (Wu i in. 2006)] powtarzalnie zmieniają tempo paraliżu wywołanego zmianą temperatury w górę tych transgenicznych robaków. Poniżej opisujemy nasz protokół pomiaru szybkości paraliżu w tym transgenicznym modelu C. elegans, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych eksperymentalnych, które mogą wpływać na ten pomiar.

Protokół

1) Przygotowanie pożywek dla nicieni do testu paraliżu.

Testy paraliżu są wykonywane na standardowych płytkach pożywki do wzrostu nicieni (NGM), rutynowo używanych do rozmnażania i genetyki C. elegans (Stiernagle, 2006).

1. Roztwór NGM zawierający NaCl, agar i pepton należy umieścić w autoklawie w kolbie Erlenmeyera i dodać odpowiednie ilości sterylnego CaCl₂, uracylu, cholesterolu, 1M_MgSO4 i 1M KPO₄. Porcję 10 ml ciekłego NGM na każdą szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Pozostaw NGM do zestalenia się przez noc w temperaturze pokojowej.
2. W przypadku badania wpływu związków/ekstraktów, należy podwielokrotnić ekstrakt na każdą płytkę i użyć rozsiewacza, aby równomiernie rozprowadzić ekstrakt na powierzchni płytki. Pozostaw ekstrakt do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Objętości powyżej 1 ml będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.
3. Na każdej płytce należy umieścić 250 μl szczepu E. coli OP5O wyhodowanego w pożywce LB przez noc w celu uzyskania gęstości optycznej 0,4-0,6. Pozostaw bakterie do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

Istotne zmienne

Wiek płytek ma znaczący wpływ na test paraliżu, ponieważ starsze płytki mają tendencję do wysychania. Używaj płytek wylanych w ciągu tygodnia od testu paraliżu. Aby uzyskać idealne wyniki, należy wlać płytki na 3-4 dni przed rozpoczęciem synchronicznych populacji robaków [patrz (2) poniżej]. Do każdego eksperymentu używaj tylko talerzy nalewanych z tej samej partii.

Zmiana wielkości trawnika (np. plamistość vs. rozprzestrzenianie się) i/lub rodzaju bakterii również zmieni zachowanie robaków. Testy paraliżu można przeprowadzić przy użyciu alternatywnych szczepów E. coli jako źródła pożywienia (np. szczepu HT115 używanego w eksperymentach z podawaniem RNAi), ale może to zmienić kinetykę paraliżu, co wymaga odpowiednich kontroli wewnętrznych.

2) Przygotowanie populacji robaków synchronicznych z wiekiem

Szczep CL4176 (smg-1(cc546^ts) I; dvIs27 [myo-3/ Aβ minigen + gen markerowy rol-6(su1006)] X jest najczęściej używany do oznaczania paraliżu wywołanego przez Aβ. Ten szczep i inne modele transgeniczne są dostępne dla badaczy akademickich za symboliczną opłatą w Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Aby zmaksymalizować synchronizację wieku badanej populacji, lepiej jest zacząć od zsynchronizowanego pokolenia rodziców. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu badanej populacji, użyj platynowego zbieracza robaków, aby przenieść 20-30 ciężarnych dorosłych osobników na kilka 10-centymetrowych płytek NGM rozsmarowanych OP50 na 2-godzinne składanie jaj w temperaturze 16°C (dopuszczalna temperatura dla CL4176). Usuń ciężarne dorosłe osobniki i pozwól potomstwu rosnąć przez 7 dni, do tego czasu będą one ciężarnymi dorosłymi osobnikami "drugiego dnia".
2. (Dzień 1) Drugiego dnia ciężarne dorosłe osobniki są wykorzystywane do przygotowania populacji testowych synchronicznych pod względem wieku. Dla każdego warunku eksperymentalnego celem jest wygenerowanie potrójnych płytek zawierających 50-75 ślimaków synchronicznych z wiekiem. Za pomocą zbieracza robaków platynowych przenieś 10-12 ciężarnych dorosłych osobników dnia 2 na 60-milimetrowe (objętość 10 ml) płytki NGM nakrapiane OP50. Pozwól robakom złożyć jaja w temperaturze 16°C przez 2 godziny, a następnie oderwij dorosłe osobniki i pozwól jajom wykluć się i rosnąć w temperaturze 16°C. W tym momencie najlepiej jest mieć kogoś, kto nie będzie oceniał płytek, aby je zakodował, więc oceniający będzie ślepy na warunki eksperymentalne.

Istotne zmienne

Etap rozwoju embrionalnego, kiedy składane są jaja (~ etap 26 komórek dla dzikich robaków w optymalnych warunkach) jest funkcją wieku dorosłego i odżywiania. Jeśli grawitacyjne dorosłe osobniki użyte do przygotowania badanej populacji są starsze lub wygłodzone, jaja w późniejszym stadium zostaną złożone, co zmniejszy synchronizację wieku populacji i odtwarzalność kinetyki paraliżu. Jest to niezbędne niż stosowanie kultur jednoosiowych (tj. tylko bakterii OP50) (zanieczyszczenia mikrobiologiczne mogą poważnie wpłynąć na ten test), a odtwarzalność jest największa, jeśli potrójne płytki mają podobną liczbę robaków.

3) Test indukcji transgenu i paraliżu

1. (Dzień 3) Przesunąć szalki w górę do 25°C 48 godzin po zakończeniu synchronicznego składania jaj; robaki powinny znajdować się w trzecim stadium larwalnym (L3). Płytki należy układać bez układania w stosy w inkubatorze o temperaturze 25°C, aby wszystkie płytki osiągnęły temperaturę 25°C w tym samym czasie.
2. (Dzień 4) Rozpocznij ocenianie paraliżu robaków (szczep CL4176) po 18-20 godzinach od rozpoczęcia zmiany biegu na wyższy. W tym momencie wszystkie robaki w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne (L4). Kontynuuj nacinanie w dwugodzinnych odstępach, aż wszystkie robaki na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie występuje nawet na całej długości ciała: obszar głowy jest ostatnią częścią robaka, która przestaje się poruszać. W ten sposób robaki, które niedawno zainicjowały paraliż, nie mogą przemieszczać się po płytce, ale mogą poruszać głowami, usuwając w ten sposób bakterie wokół przodu i pozostawiając "aureolę" oczyszczonych bakterii. Robaki te niezmiennie stają się całkowicie sparaliżowane, dlatego robaki z aureolą są klasyfikowane jako sparaliżowane. Niektóre robaki nie będą miały aureoli, ale nie będą też wykazywać spontanicznych ruchów; Są one testowane przez szturchanie za pomocą zbieracza robaków. Jeśli szturchnięty robak nie może przejść przez propagację fal całego ciała po szturchnięciu, jest również oceniany jako sparaliżowany. Aby uzyskać efektywną punktację, najłatwiej jest przenieść sparaliżowane robaki do niewykrytego sektora tablicy, aby nie zostały przypadkowo ponownie ocenione w następnym okresie punktacji. (Pozwala to również błędnie skategoryzowanym robakom zademonstrować ruch, co pozwala na korektę punktacji).
3. Aby wygenerować krzywą paraliżu, w każdym punkcie czasowym frakcja robaków na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczana na procent, a średni procent "niesparaliżowanych" jest wykreślany w funkcji czasu od inicjacji zmiany biegu na wyższy. (Uzasadnieniem dla wykreślania w ten sposób jest to, że wynikowa krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżycia, a zatem może być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżycia).

Istotne zmienne

Przesunięcie w górę transgenicznych robaków myo-3/Aβ musi nastąpić zanim osiągną one średni etap L4, aby paraliż został zainicjowany, ponieważ promotor myo-3 jest regulowany rozwojowo i ma znacznie zmniejszoną ekspresję u późnych L4 lub dorosłych robaków. Podobnie, ekspresja tego transgenu jest blokowana, jeśli robaki zostaną wygłodzone, dlatego ważne jest, aby robaki były dobrze odżywione przez cały czas trwania eksperymentu. Nigdy nie zaobserwowaliśmy, aby sparaliżowany robak odzyskał sprawność w jakichkolwiek warunkach, a po 12-16 godzinach zmiany biegu na wyższy wszystkie robaki CL4176 zostaną sparaliżowane, nawet jeśli zostaną zredukowane do 16°C. W szczepie CL4176 wystarczająca regulacja w górę ekspresji transgenu, aby spowodować paraliż, może wystąpić w niższych temperaturach (tj. 20-25°C), chociaż czas paraliżu zostanie zmieniony. Szybkość paraliżu zależy od konkretnego użytego szczepu transgenicznego (skonstruowaliśmy szczepy myo-3 / Aβ zarówno z szybszym, jak i wolniejszym tempem niż CL4176), więc w przypadku szczepów alternatywnych okno punktacji może wymagać dostosowania.

4) Reprezentatywne wyniki

Na rysunku 1 pokazano wykres krzywej paraliżu dla CL4176, zarówno nieleczonego, jak i wystawionego na działanie 6,27 mM kofeiny (końcowe stężenie na płytce NGM). Zabieg ten powoduje wysoce statystycznie istotne opóźnienie paraliżu wynoszące około 4 godzin, co interpretujemy jako wskazujące na tłumienie toksyczności Aβ w tym modelu. Na rysunku 2 pokazano niezależny eksperyment badający wpływ kafestolu, innego związku występującego w kawie. Wykres ten jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność Aβ. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL4176 jest sparaliżowana po 24 godzinach, a paraliż jest całkowity po 28 godzinach. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu populacji kontrolnych CL4176. Znaczne odchylenia od tego czasu wskazują na zmienione warunki środowiskowe lub spontaniczną delecję kopii transgenowych. (CL4176 zawiera chromosomalnie zintegrowaną macierz transgeniczną z wieloma kopiami transgenu myo-3 / Aβ. Chociaż ta transgeniczna matryca jest zwykle dość stabilna, każda propagacja szczepu w temperaturach >16°C wyselekcjonuje rzadkie robaki, które przeszły spontaniczną delecję transgenów, co skutkuje wariantami, które będą miały zmniejszoną ekspresję Aβ i wolniejsze wyniki paraliżu).

Rysunek 1. Krzywa paraliżu dla robaków szczepu CL4176 nieleczonych lub narażonych na 6,27 mM kofeiny (Sigma). Wskazane czasy są od rozpoczęcia zmiany temperatury w górę. Słupki błędów = S.E.M.

Rysunek 2. Krzywa paraliżu dla robaków CL4176 wystawionych na działanie kafestolu 0,48 mM (Sigma). Słupki błędów = S.E.M.

Dyskusja

Opisany przez nas protokół może być skutecznie wykorzystany do oznaczania wpływu związków na toksyczność Aβ. Opublikowane przykłady obejmują działanie składników ekstraktu z miłorzębu japońskiego (Wu i wsp. 2006) oraz rezerpiny (Arya i wsp. 2009). Wykazano, że związki, które chroniły przed toksycznością Aβ w innych układach, również chronią w tym modelu (np. memantyna, nasze niepublikowane wyniki). Ważnym uzasadnieniem dla ustanowienia tego modelu jest fakt, że dobrze rozwinięte narzędzia genetyczne i molekularne dostępne u C. elegans mogą być wykorzystane do badania mechanizmów toksyczności Aβ. W ten sposób można określić wpływ określonych mutacji na toksyczność Aβ (np. Wpływ zmniejszenia sygnalizacji insulinopodobnej poprzez wprowadzenie mutacji powodującej utratę funkcji daf-2, Florez-McClure i wsp. 2007), a model ten można również wykorzystać do zbadania skutków transgenów o nadmiernej ekspresji (Fonte i wsp. 2008). Ostatnio szeroko wykorzystaliśmy ten model do zbadania wpływu na toksyczność podstawiania pojedynczych aminokwasów w Aβ (dane niepublikowane).

Opisany tutaj model transgeniczny bada wpływ ostrej ekspresji Aβ na funkcję komórek mięśniowych. W momencie paraliżu komórki mięśniowe i ich sarkomer są nienaruszone; Fenotyp paraliżu nie jest wynikiem śmierci komórek mięśniowych. Jednak po paraliżu ( ~ 48 godzin po początkowym biegu w górę) następuje załamanie integralności mięśni i ostateczna śmierć robaków. Nie badaliśmy tego dalszego wpływu ekspresji Aβ ani nie używaliśmy go jako markera toksyczności.

Opisany tutaj indukowalny model ekspresji Aβ nie jest odpowiedni do badania metod leczenia, które modulują tworzenie β-amyloidu per se. Chociaż transgeniczne robaki z konstytutywną ekspresją Aβ tworzą łatwo wykrywalne złogi amyloidu (Fay i wsp., 1998; Link i wsp. 2001), transgeniczne robaki z indukowalną ekspresją Aβ rzadko mają złogi amyloidu, a fenotyp paraliżu wydaje się niezależny od odkładania się amyloidu (Drake i wsp. 2003). Nasze wyniki są zgodne z poglądem, że ostra toksyczność indukowanej ekspresji Aβ wynika z akumulacji rozpuszczalnego oligomerycznego Aβ, a nie z odkładania się amyloidu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl (6g)	Sigma-Aldrich	S9888
Agar (40g)	Sigma-Aldrich	A7002
Pepton (5g)	Sigma-Aldrich	P0556
ddH2O (2L)
1M CaCl2 (2mL)			147,02mg/ml w ddH2O
Uracyl (2mL)			2 mg / ml w ddH2< / sub>O
Cholesterol (2 ml)			5 mg / ml w etanolu (nie autoklawować)
1M MgSO4 (2mL)			246,5 mg / ml w ddH2O
1M KPO4 (50mL)			98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/ml w ddH2O, kolba
Erlenmeyera	VWR international