In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Podsumowanie

Szczegółowo opisujemy nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), służący do dwuwymiarowego wewnątrznaczyniowego obrazowania molekularnego biologii blaszki miażdżycowej in vivo. Cewnik NIRF umożliwia wizualizację kluczowych procesów biologicznych, takich jak zapalenie, poprzez wykrywanie obecności aktywowalnych i celowanych fluorochromów NIR wykazujących powinowactwo do blaszki miażdżycowej. Cewnik spełnia wymogi inżynieryjne i energetyczne stosowane w klinice i jest przeznaczony do zastosowania w ludzkich tętnicach wieńcowych. Poniższe badanie opisuje multimodalną strategię obrazowania, która wykorzystuje nowatorski wewnątrznaczyniowy cewnik NIRF in vivo do obrazowania i ilościowego oznaczania zapalnej blaszki miażdżycowej w proteolitycznie aktywnych, zapalnych miażdżycach u królików.

Streszczenie

Odpowiedź naczyniowa na uszkodzenie jest dobrze skoordynowaną reakcją zapalną wywołaną przez gromadzenie się makrofagów w ścianie naczynia, co prowadzi do akumulacji wewnątrzświatowej blaszki bogatej w lipidy, proliferacji komórek mięśni gładkich i postępującego zwężenia światła naczynia. Powstawanie takich podatnych na pęknięcie blaszek leży u podstaw większości przypadków ostrego zawału mięśnia sercowego. Złożona molekularna i komórkowa kaskada zapalna jest sterowana przez rekrutację limfocytów T i makrofagów oraz ich efekty parakrynne na komórki śródbłonka i mięśni gładkich.¹

Obrazowanie molekularne w miażdżycy ewoluowało w istotne narzędzie kliniczne i badawcze, które umożliwia wizualizację stanu zapalnego oraz innych procesów biologicznych in vivo. Kilka niedawnych przykładów wykazuje możliwość wykrywania blaszek o wysokim ryzyku u pacjentów oraz oceny efektów farmakoterapii w miażdżycy.⁴ Chociaż szereg metod obrazowania molekularnego (w szczególności MRI i PET) pozwala na obrazowanie aspektów biologicznych dużych naczyń, takich jak tętnice szyjne, możliwości obrazowania tętnic wieńcowych są ograniczone.² Pojawienie się strategii obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości, w szczególności fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), w połączeniu z aktywowalnymi sondami fluorescencyjnymi, zwiększyło czułość i doprowadziło do opracowania nowych strategii wewnątrznaczyniowych w celu usprawnienia obrazowania biologicznego miażdżycy tętnic wieńcowych u ludzi.

Molekularne obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni (NIRF) wykorzystuje światło wzbudzenia o określonej szerokości pasma (650-900 nm) jako źródło fotonów, które po dostarczeniu do optycznego środka kontrastowego lub sondy fluorescencyjnej emitują fluorescencję w oknie NIR, możliwą do wykrycia przy użyciu odpowiedniego filtra emisyjnego i wysokoczułej kamery CCD. W przeciwieństwie do światła widzialnego, światło NIR głęboko penetruje tkankę, jest znacznie mniej tłumione przez endogenne absorbenty fotonów, takie jak hemoglobina, lipidy i woda, oraz umożliwia uzyskanie wysokich stosunków sygnału docelowego do tła dzięki zredukowanej autofluorescencji w oknie NIR. Obrazowanie w „oknie” NIR może znacząco zwiększyć potencjał obrazowania in vivo.^2,5

Zapalne proteazy cysteinowe zostały szczegółowo zbadane z wykorzystaniem aktywowalnych sond NIRF¹⁰ i odgrywają istotną rolę w aterogenezie. Poprzez degradację macierzy zewnątrzkomórkowej proteazy cysteinowe w znacznym stopniu przyczyniają się do progresji i powikłań miażdżycy⁸. W szczególności proteaza cysteinowa, katepsyna B, jest silnie eksprymowana i kolokalizuje z makrofagami w eksperymentalnych blaszkach miażdżycowych u myszy, królików i ludzi.^3,6,7 Ponadto aktywność katepsyny B w blaszkach może być wykrywana in vivo przy użyciu wcześniej opisanej jednowymiarowej (1-D) wewnątrznaczyniowej technologii fluorescencji bliskiej podczerwieni⁶, w połączeniu z wstrzykiwalnym nanoczujnikiem składającym się z polimerowego szkieletu polilizyny zderywatyzowanego wieloma fluorochromami NIR (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA), co skutkuje silnym wygaszaniem wewnątrzmolekularnym w stanie spoczynku.¹⁰ Po ukierunkowanym rozszczepieniu enzymatycznym przez proteazy cysteinowe, takie jak katepsyna B (która kolokalizuje z makrofagami w blaszkach), fluorochromy oddzielają się, co prowadzi do znacznego wzmocnienia sygnału NIRF. Wewnątrznaczyniowa detekcja sygnału fluorescencji NIR za pomocą zastosowanego nowoczesnego dwuwymiarowego (2D) wewnątrznaczyniowego cewnika NIRF umożliwia obecnie wysokorozdzielczą i geometrycznie dokładną detekcję in vivo aktywności katepsyny B w zapalnej blaszce miażdżycowej.

In vivo obrazowanie molekularne miażdżycy z wykorzystaniem cewnikowego obrazowania 2D NIRF, w przeciwieństwie do wcześniejszego podejścia spektroskopowego 1-D,⁶ jest nowatorskim i obiecującym narzędziem, które wykorzystuje zwiększoną aktywność proteaz w bogatych w makrofagi blaszkach miażdżycowych do wykrywania stanu zapalnego naczyń.^11,12 Poniższy protokół badawczy opisuje zastosowanie wewnątrznacznego cewnika 2D NIRF do obrazowania i charakteryzacji struktury blaszki z wykorzystaniem kluczowych aspektów biologii blaszki miażdżycowej. Jest to platforma translacyjna, która po zintegrowaniu z istniejącymi klinicznymi technologiami obrazowania, w tym angiografią i wewnątrznacznie ultrasonografią (IVUS), oferuje unikalną i nowatorską zintegrowaną multimodalną technikę obrazowania molekularnego, która pozwala odróżnić miażdżycowe zmiany zapalne oraz umożliwia detekcję sygnałów NIRF w wewnątrznacznych tętnicach wieńcowych o rozmiarach ludzkich.

Protokół

In vivo Model zwierzęcy: Tworzenie eksperymentalnej miażdżycy aortalno-biodrowej

1) Angiografia wyjściowa i denudacja balonowa

1. Przed wykonaniem angiografii wyjściowej i denudacją balonową, królik nowozelandzki otrzymuje dietę wysokocholesterolową (1%) przez 1 tydzień. Zwierzę to jest wykorzystywane ze względu na istotność translacyjną, ponieważ 1) naczynia aortylowo-biodrowe u królików mają tę samą średnicę co ludzkie tętnice wieńcowe (2,5-3,5 mm) oraz 2) hiperlipidemiczny model uszkodzenia balonowego generuje zapalną miażdżycę z udziałem komórek zapalnych (makrofagów) i cząsteczek (katepsyn) podobnych do tych występujących w ludzkiej miażdżycy.
2. Po żywieniu cholesterolowym zwierzę zostaje zanestezjowane propofolem i ketaminą. Za pomocą skalpela o rozmiarze 15 wykonuje się jedno UNCowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzusznej strony szyi. Stosując techniki rozczepiania tępego, odsłania się mięśnie znajdujące się pod powięzią po prawej stronie tchawicy. Lewy mięsień mostkowo-głowowy zostaje oddzielony wzdłuż złącza tkanki łącznej, a następnie odsłania się prawą wspólną tętnicę szyjną. Tętnicę oddziela się od nerwu błędnego. Na tętnicy umieszcza się pętle szwów proksymalnych i dystalnych, aby umożliwić retrakcję i okluzję. Wykonuje się ukośną arteriotomię o szerokości 1 do 2 mm, przez którą wprowadza się osłonkę naczyniową 5 French (średnica zewnętrzna 1,67 mm) i podaje heparynę (1000μ/mL, ~150units/kg) doglebowo do tętnicy za pomocą osłonki.
3. Następnie w czasie 2 sekund wstrzykuje się barwnik kontrastowy (Ultravist) (1 do 2 mL), aby uzyskać kontrolny angiogram dystalnej aorty i obu tętnic biodrowych.
4. Następnie tętnice biodrowo-udowe i aortę uszkadza się poprzez denudację śródbłonka. Wykorzystując standardowe metody fluoroskopii, cewnik do embolektomii Fogarty 3Fr umieszcza się w dystalnej tętnicy biodrowo-udowej i nadmuchuje 0,3 do 0,5 cc kontrastu (50% kontrastu/50% soli fizjologicznej) lub powietrza. Następnie cewnik w stanie nadmuchanym wycofuje się proksymalnie wzdłuż prawej tętnicy biodrowej i dystalnej aorty aż do odejścia lewej tętnicy nerkowej. Po denudacji balonowej powtarza się angiografię, aby udokumentować drożność naczyń. Po angiografii wszystkie cewniki i osłonki są usuwane, a proksymalny odcinek prawej wspólnej tętnicy szyjnej zostaje podwiązany; mięśnie i powięź zszywa się wchłanialnym szwem 4/0, a nacięcie skóry zamyka się niewchłanialnym szwem 4/0.
5. Następnie zwierzę przechodzi rekonwalescencję przy podaniu jednej dawki antybiotyku (cefazolina, 0,5 grama IM). Podaje się leki przeciwbólowe, w tym buprenorfinę 0,01 mg/kg IM (dwukrotnie dziennie w razie potrzeby). Zwierzęta pozostają na diecie z 1% cholesterolem przez 4 tygodnie po denudacji balonowej. W 5. tygodniu zwierzęta przechodzą na dietę z 0,3% cholesterolem.

Zintegrowane obrazowanie multimodalne zmian miażdżycowych u królika

2) Znakowanie proteolitycznie aktywnej zapalnej blaszki miażdżycowej z użyciem wstrzykiwalnego nanoczujnika; Angiografia, wewnątrznaczna ultrasonografia (IVUS) oraz wewnątrznaczne obrazowanie NIRF in vivo miażdżycy u królika

1. Osiem tygodni po urazie balonowym i 24 godziny przed obrazowaniem, królikowi podaje się dożylnie 500 nmol/kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) poprzez żyłę uszną.
2. Dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu zwierzęta są znieczulane, a dostęp tętniczy uzyskuje się poprzez lewą wspólną tętnicę szyjną (patrz krok 1.2). Podaje się heparynę do tętnicy (150 units/kg). Wykonuje się angiografię wyjściową zgodnie z powyższym opisem.
3. Cewnik IVUS zostaje załadowany na kliniczny drut prowadzący do tętnic wieńcowych o średnicy 0.014 inch i wprowadzony do pochewki. Pod kontrolą fluoroskopii radioprzepuszczalny koniec drutu zostaje umieszczony dystalnie w prawej tętnicy biodrowej. Następnie cewnik IVUS jest przesuwany do proksymalnej części tętnicy biodrowej przy użyciu standardowej klinicznej techniki monorail.
4. Inicjuje się cofanie cewnika (pullback) na odcinku 100 mm i rejestruje obrazy. Wykonuje się rekonstrukcję podłużną naczynia i identyfikuje blaszkę miażdżycową w świetle naczynia.
5. Cewnik NIRF^11,12 zostaje załadowany na drut 0.014 inch (system monorail), a następnie ostrożnie wprowadzony do pochewki, przy czym głowica obrazująca zostaje umieszczona dystalnie w prawej tętnicy biodrowej.
6. Wykonuje się wielokrotne zautomatyzowane cofnięcia (pullback podłużny z prędkością 1 mm/sec, 30 obrotów na minutę) i odnotowuje sygnały fluorescencyjne w strefach miażdżycy. Obrazy są rejestrowane, a następnie poddawane dalszej obróbce z odpowiednim skalowaniem i ustawieniem okna na podstawie zakresu sygnału.

3) Eutanazja i izolacja tkanki aortalno-biodrowej ex vivo

1. Eutanazję przeprowadza się poprzez pojedynczy wtrysk dożylny 1cc środka eutanatycznego (roztworu 390mg pentobarbitalu sodu i 50mg fenytoiny sodu).
2. Drzewo tętnicze jest perfundowane 0,9% solą fizjologiczną do momentu całkowitego oczyszczenia żyły głównej dolnej z krwi. Zidentyfikowano aortę z miażdżycą oraz tętnice biodrowe, a następnie wypreparowano je z otaczających tkanek. Dodatkowo pobiera się niewielkie fragmenty wątroby, nerek, śledziony i serca o wymiarach 2 x 2 cm.
3. Ex vivo obrazowanie NIRF z użyciem wewnątrznaczyniowego cewnika do obrazowania NIRF może zostać wykonane na tym etapie. Naczynie jest wydłużane, a cewnik NIRF ponownie wprowadzany do proksymalnej części aorty, aż głowica obrazująca zostanie umieszczona w tętnicy biodrowej prawej lub w miejscu jej rozwidlenia. Wykonuje się wielokrotne automatyczne cofnięcia cewnika (pullback), zgodnie z opisem powyżej (patrz 2.6).

4) Obrazowanie fluorescencyjnej refleksji (Ex vivo Fluorescence Reflectance Imaging, FRI) wypreparowanej aorty i tętnic biodrowych

1. Wypreparowaną tkankę umieszcza się w 10-20 cc soli fizjologicznej i transportuje do analiz FRI (Kodak Image Station 4000MM Pro, Carestream Health, Inc.).
2. Aortę oraz naczynia biodrowe rozciąga się, aby przybliżyć ich rzeczywistą długość, a następnie wykonuje się obrazy przy użyciu wielu długości fal [światło białe, zielony kanał fluorescencyjny (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) oraz Cy7 (ex 650 nm, em 760 nm)]. Dla każdej długości fali stosuje się serię czasów naświetlania (0,1-30 s), a uzyskane obrazy eksportuje się jako pliki DICOM lub 16-bitowe nieskalowane pliki TIFF do dalszych analiz. Jako kontrole pozytywne i negatywne obrazuje się narządy (wątrobę, śledzionę, nerkę i serce) przy użyciu podobnych kanałów i czasów naświetlania.
3. W tętnicach miażdżycowych odnotowuje się obszary zwiększonego sygnału w kanale bliskiej podczerwieni (780 nm+).

5) Osadzanie tkanek w parafinie do krojenia i analizy immunohistochemicznej

1. Identyfikuje się obszary tkanek prawidłowych (nieuszkodzonych; np. lewa tętnica biodrowa) oraz obszary blaszek miażdżycowych, a następnie małe pierścienie tkanki o średnicy 5-10 mm zatapia się w medium OCT (Optimal Cutting Temperature). Blokami przechowuje się w temperaturze -80 C do czasu wykonania skrawków.
2. Stosuje się standardowe techniki krojenia i analiz immunohistochemicznych. Wykonuje się barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienia na Ram-11 i katepsynę B.

Analiza i integracja obrazów multimodalnych (angiografia, IVUS, NIRF i FRI)

6) Przetwarzanie obrazów NIRF i FRI

1. Pliki DICOM zawierające dane obrazowe z wycofania NIRF i FRI (wykonanego w kanale bliskiej podczerwieni 780 nm) są przetwarzane odpowiednio przy użyciu oprogramowania MATLAB i Osirix. Stosuje się odpowiednie okienkowanie w celu wyświetlenia pełnego zakresu intensywności sygnału. Końcowe obrazy są eksportowane jako pliki TIFF.
2. Pliki są importowane do standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazów (można użyć Keynote). Obrazy są wyrównywane w oparciu o punkty odniesienia (np. kręgi na angiogramie, bifurkację tętnicy biodrowej wspólnej oraz tętnicę nerkową). Identyfikuje się obszary prawidłowego naczynia oraz blaszki miażdżycowej.
3. Obszary zainteresowania (ROI) są obrysowywane ręcznie (dla tkanki prawidłowej i obszarów blaszki miażdżycowej), a średnie intensywności sygnału są pozyskiwane odpowiednio za pomocą programów Osirix i MATLAB dla obrazów FRI i NIRF. W celu prawidłowego obrysowania wykorzystuje się podłużny obraz IVUS naczynia, co ułatwia identyfikację prawidłowego naczynia i blaszki miażdżycowej.
4. Dla stref blaszki miażdżycowej oblicza się stosunek sygnału z obszaru docelowego do tła (TBR).

Reprezentatywne wyniki:

Po zakończeniu powyższego protokołu możemy zidentyfikować i scharakteryzować obszary zwiększonej aktywności proteaz katepsyn w blaszkach zapalnych w obrębie aorty i naczyń biodrowych. Wstrzyknięcie aktywnego nanosensora (Prosense/VM110) pozwala nam zidentyfikować proteolitycznie aktywne blaszki. Pojawiają się one jako strefy jasne lub o intensywnym sygnale podczas obrazowania za pomocą FRI w kanale bliskiej podczerwieni (750 nm). Obrazy NIRF korelują ze zwiększoną intensywnością sygnału w FRI i są zgodne z IVUS, co umożliwia rejestrację anatomiczną sygnałów NIRF. Obliczone wartości TBR blaszek uzyskane z FRI i NIRF były podobne (patrz Rycina 3: średnie TBR NIRF 4,2, średnie TBR FRI 2,9). Analiza immunohistochemiczna jasnych blaszek potwierdza intensywną obecność RAM-11 oraz aktywność katepsyny B w obszarach blaszek (dane nie przedstawiono).

Rycina 1. Schemat 2D cewnika NIRF Aby rozszerzyć potencjał kliniczny metody detekcji 1D NIRF⁶, skonstruowaliśmy nowy cewnik 2D NIRF do obrazowania wewnątrznaczyniowego.^11,12 Cewnik wykonany na specjalne zamówienie składa się z włókna optycznego (średnica 125 µm umieszczona w rurce polietylenowej: 2,9F), które jest oświetlane za pomocą źródła wzbudzenia w postaci lasera 750 nm. Światło laserowe jest emitowane pod kątem 90 stopni względem osi włókna. System wykorzystuje dwa zautomatyzowane silniki (obrotowy i translacyjny), aby umożliwić jednoczesne obrazowanie w zakresie 360 stopni i cofanie podłużne w celu uzyskania rzeczywistego obrazowania 2D. Obrazy wykorzystane za zgodą autorów z referencji 11.

Rycina 2. Schemat przedstawiający aktywację nanoczujnika Prosense/VM110 opośredniczoną przez proteazy. Obraz wykorzystany za zgodą z literatury 10.

Rycina 3. TBR (stosunki sygnału docelowego do tła) blaszki in vivo oraz ex vivo

Dyskusja

Zapalne blaszki miażdżycowe wysokiego ryzyka lub tzw. blaszki podatne są prawdopodobnie odpowiedzialne za większość zawałów mięśnia sercowego. Identyfikacja takich blaszek przed wystąpieniem objawów ma istotne znaczenie kliniczne zarówno w przewidywaniu wyników, jak i w prowadzeniu terapii medycznej. Konwencjonalne metody obrazowania tętnic wieńcowych, takie jak angiografia rentgenowska, zazwyczaj koncentrują się na charakterystyce zwężeń światła naczynia, zamiast wyjaśniać biologiczne profile zmian wysokiego ryzyka, któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Prosense 750	Visen Medical	VM110	wstrzyknięcie dożylne 500 nmol/kg
Heparyna sodowa	APP Pharmaceuticals	401586D
Cefazolina	NovaPlus	46015683
Lidokaina HCL 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorfina	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamina	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
Dieta wysokocholesterolowa 1%	Research Diets	C30293
Dieta wysokocholesterolowa 0,3%	Research Diets	C30255