CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
estrym bursztynianowy karboksyfluoresceiny (CFSE) jest skutecznym i popularnym sposobem monitorowania podziałów limfocytów1-3. CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE ulega podziałowi, jej potomstwo otrzymuje połowę liczby cząsteczek znakowanych karboksyfluoresceiną, dzięki czemu każdy podział komórkowy można ocenić poprzez pomiar odpowiadającego mu spadku fluorescencji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Zdolność CFSE do znakowania populacji limfocytów z wysoką intensywnością fluorescencji o wyjątkowo niskiej wariancji, w połączeniu z niską toksycznością komórkową, czyni go idealnym barwnikiem do pomiaru podziałów komórkowych. Ponieważ jest to barwnik oparty na fluoresceinie, jest on również kompatybilny z szeroką gamą innych fluorochromów, co pozwala na jego zastosowanie w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich w celu monitorowania do 8 podziałów komórkowych. Znakowane komórki mogą być wykorzystywane zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo.
Protokół
1) Przygotowanie odczynników
1.1) Roztwór zapasowy CFSE
Barwnik CFSE jest nabywany w postaci estru sukcesymidylowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFDA, SE) (MW 557,47 g/mole), zazwyczaj w fiolkach 25 mg. Rozpuścić 25 mg w 8,96 mL DMSO, aby otrzymać końcowy roztwór zapasu o stężeniu 5 mM (przechowywać w alikwotach 50-100 μL w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy). CFDA, SE reaguje z roztworami wodnymi, dlatego podczas przechowywania należy bezwzględnie unikać kontaktu z wodą.
1.2) Limfocyty
Wyizolować limfocyty ze śledziony i/lub węzłów chłonnych myszy i resuspender w 1 mL pożywki hodowlanej (np. RPMI) z dodatkiem 5% inaktywowanego termicznie (HI) płodowej surowicy cielęcej (FCS), przy stężeniu komórek od 0.5 x 106 do 10 x 107/mL.
2) Znakowanie CFSE
2.1) Metoda rutynowa:
- Komórki należy dokładnie resuspender w 1 mL medium i ostrożnie umieścić na dnie nowej (niewilgotnej) probówki stożkowej o pojemności 10 mL.
- Probówkę należy ułożyć poziomo (użycie niewilgotnej probówki zapobiegnie przemieszczaniu się 1 mL zawiesiny komórek i jej przedwczesnemu zmieszaniu z roztworami CFDA, SE).
- Do niewilgotnej części plastiku w górnej części probówki należy ostrożnie dodać 110 μL PBS, upewniając się, że nie ma on kontaktu z roztworem komórek.
- Należy resuspender 1,1 μL 5 mM roztworu stokowego CFDA, SE w 110 μL PBS.
- Probówkę należy szybko zakręcić, odwrócić i dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex, aby uzyskać szybkie i jednorodne zmieszanie roztworów. Należy zauważyć, że końcowe stężenie barwnika CFSE wynosi 5 μM, jednak optymalne stężenie może wymagać oznaczenia dla każdej przygotowanej partii, a następnie sprawdzania co 6 miesięcy w celu zapewnienia jego skuteczności.
- Komórki należy inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że po konwersji CFDA, SE do CFSE (patrz dyskusja) barwnik staje się fluorescencyjny, a zatem podatny na blaknięcie pod wpływem nadmiernego światła. W związku z tym zaleca się chronić probówkę przed światłem od tego momentu, na przykład owijając ją folią aluminiową.
- Komórki należy przemyć, rozcieńczając je w 10 objętościach PBS o temperaturze 20 °C zawierającego 5 % HI FCS, osadzając poprzez wirowanie przy 300 x g przez 5 min w 20 °C i odrzucając supernatant. Procedurę płukania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie.
2.2) Metoda alternatywna, która jest również odpowiednia dla większej liczby komórek (10 - 30 x 107):
- Przygotować roztwór 2 x (10 μM) CFDA, SE, dodając 2 μL roztworu stokowego 5 mM do 1 mL PBS, a następnie szybko dodać go do 1 mL dokładnie resuspendowanych komórek, po czym szybko zakręcić probówkę, odwrócić ją i dokładnie wymieszać w wstrząsarze wirowym (vortex), aby uzyskać szybkie i jednorodne wymieszanie.
- Inkubować komórki przez 5 min w temperaturze pokojowej i wypłukać zgodnie z krokami 2.1(f) i 2.1(g).
2.3) Następnie komórki można poddać wybranemu protokołowi w celu indukcji podziałów komórkowych. Oznakowane komórki mogą być wykorzystywane zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo.
2.4) Po zakończeniu testu proliferacji komórki są zbierane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (przykładowe wyniki przedstawiono poniżej).
3) Reprezentatywne wyniki
Aby ocenić proliferację limfocytów poprzez rozcieńczenie CFSE, użyteczne jest określenie fluorescencji niepodzielonych komórek (tj. fluorescencji maksymalnej) oraz komórek nieoznakowanych (tj. fluorescencji minimalnej). W związku z tym projekt eksperymentu powinien uwzględniać te kontrole. Poniżej przedstawiono przykłady analiz in vitro oraz in vivo z wykorzystaniem CFSE do pomiaru podziałów limfocytów T CD8+ za pomocą cytometrii przepływowej.
3.1) Stymulacja in vitro
Rysunek 1 przedstawia profile CFSE dla znakowanych CFSE limfocytów T CD8+ OT-I (transgenicznych pod względem receptora komórek T specyficznych dla owalbuminy (OVA)) po 3 dniach hodowli z komórkami dendrytycznymi obciążonymi różnymi ilościami OVA. Limfocyty T CD8+ oczyszczone ze śledziony i węzłów chłonnych myszy OT-I zostały znakowane CFSE, a 1 x 105 komórek hodowano z 3,3 x 104 DC. Komórki DC obciążano OVA przez 1 h w 37 °C i przemywano dwukrotnie przed hodowlą. Po 3 dniach komórki zebrano, znakowano przeciwciałami anty-CD8-APC oraz barwnikiem Hoechst 33258, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej (zebrano 50 000 zdarzeń). Przedstawiono żywe (Hoechst 33258-) komórki CD8+. Jako kontrole zastosowano limfocyty T CD8+ hodowane osobno, co pokazuje intensywność CFSE komórek niepodzielonych, natomiast komórki nieznakowane wykazują autofluorescencję komórek i granice wykrywalności podziałów komórkowych. Należy zauważyć, że na każdym z paneli w tym przykładzie widoczne są 4 piki CFSE, co wskazuje, że komórki przeszły do 3 podziałów.
3.2) Stymulacja in vivo
Rycina 2 przedstawia profile CFSE dla znakowanych CFSE transgenicznych limfocytów T CD8+ OT-I z receptorem dla antygenu OVA po 3 dniach in vivo w obecności 20 μg OVA. Limfocyty T CD8+ oczyszczone ze śledziony i węzłów chłonnych kongenicznych myszy OT-I CD45.1 zostały znakowane CFSE, a następnie 5 x 106 komórek wstrzyknięto dożylnie do bocznej żyły ogonowej myszy C56BL/6J (CD45.2+). Po 2 h myszom wstrzyknięto dożylnie 20 μg OVA. Po 3 dniach pobrano śledziony od myszy, przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek, znakowano ją przeciwciałami anty-B220-PerCP, anty-CD8-APC-Cy7 i anty-CD45.1-PE-Cy7 oraz barwnikiem Hoechst 33258, a następnie przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej (zebrano 1 000 000 zdarzeń). Żywe (Hoechst 33258-) komórki B220- przedstawiono na lewym panelu, a wyselekcjonowane komórki CD8+ CD45.1+ na prawym panelu. Jako kontrole zastosowano niepobudzone, znakowane CFSE limfocyty T CD8+, które wskazują intensywność CFSE dla komórek niedzielących się, natomiast komórki nieznakowane pokazują autofluorescencję komórek i granice wykrywalności podziałów komórkowych. Należy zauważyć, że wykorzystanie różnicy allotypowej CD45 jest kluczowe dla odróżnienia przeniesionych limfocytów T CD8+ od komórek gospodarza, ponieważ stanowią one niewielką subpopulację całkowitej liczby limfocytów T CD8+ (lewy panel). Zauważmy, że w tym przykładzie większość komórek mieści się w obrębie 7 pików CFSE (prawy panel), co wskazuje, że komórki przeszły do 6 podziałów.
Rycina 1. Zdolność znakowanych CFSE transgenicznych komórek T CD8+ OT-I z receptorem dla specyficznej owalbuminy (OVA) do odpowiedzi in vitro na komórki DC pulsowane różnymi stężeniami OVA; przedstawione dane po 3 dniach hodowli. Zwrócono uwagę na populację niedzielących się komórek T CD8+ wobec braku antygenu (jasnoszary histogram) oraz autofluorescencję populacji nieznakowanej (ciemnoszary histogram). Rycina przedstawia komórki T CD8+, które podzieliły się 1-3 razy na podstawie pików rozcieńczenia CFSE, przy czym więcej komórek T dzieliło się przy wyższych stężeniach antygenu.
Rysunek 2. Zdolność transgenicznych limfocytów T CD8+ OT-I z receptorami dla owalbuminy (OVA), po transferze adoptywnym do myszy C57BL/6, do odpowiedzi na OVA; dane przedstawione 3 dni po transferze adoptywnym. Panel lewy: limfocyty T CD8+, CD45.1+ OT-1 w myszach biorcach. Panel prawy: profil proliferacji CFSE. Zwrócono uwagę na populację niepodzielonych limfocytów T CD8+ w myszach biorcach, które nie otrzymały antygenu (jasnoszary histogram), oraz na autofluorescencję limfocytów nieznakowanych (ciemnoszary histogram). Rysunek przedstawia limfocyty T CD8+, które podzieliły się od 1 do 6 razy na podstawie szczytów rozcieńczenia CFSE.
Rysunek 3. Przedstawienie różnych zdarzeń molekularnych zachodzących podczas znakowania komórek estrem b promoceanowym karboksyfluoresceiny (CFDA, SE). Szczegóły procesu opisano w sekcji Dyskusja. Uwaga: Ogólny akronim „CFSE”, a nie CFDA, SE, jest używany do opisania odczynnika znakującego oraz ogólnej procedury znakowania. Rysunek opracowany na podstawie pracy Parish4.
Dyskusja
Aby zrozumieć zasadę działania CFSE oraz powód, dla którego do analizy proliferacji wymagane jest szybkie i jednorodne znakowanie, warto zapoznać się z molekularnymi podstawami znakowania komórek CFSE. Proces ten można podzielić na dwie fazy: 1) wnikanie do komórki oraz 2) znakowanie białek (Rycina 3). 1) Wnikanie do komórki: Transport barwnika do wnętrza komórki jest pośredniczony przez jego formę diacetylowaną, czyli ester sukcynimidyloowy diacetylu karboksyfluoresceiny (CFDA, SE). Grupy acetylowe sprawiają, że barwnik wykazuje wysoką przenikalność przez błony, co umożliwia jego szybki przepływ przez błonę plazmatyczną. Esterazy obecne w komórce odszczepiają grupy acetylowe z CFDA, SE, przekształcając go w formę CFSE, która jest znacznie mniej przenikalna przez błony, co prowadzi do zatrzymania i koncentracji barwnika wewnątrz komórki. 2) Znakowanie białek: Choć zarówno CFDA, SE, jak i CFSE posiadają aminoreaktywne łańcuchy boczne sukcynimidylowe, tylko CFSE wykazuje fluorescencję. Wysokie wewnątrzkomórkowe stężenie CFSE sprzyja szybkiemu i intensywnemu znakowaniu białek wewnątrzkomórkowych. Znakowanie komórek CFSE musi być przeprowadzone szybko, aby uzyskać jednorodnie oznakowaną populację komórek, co jest kluczowe dla rozdzielenia komórek, które przeszły kilka podziałów, jak pokazano na reprezentatywnych wynikach (Rycina 1 i 2).
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace opisane w niniejszym artykule były wspierane przez grant programowy (CRP) National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australii oraz grant projektowy NHMRC (CRP i BJCQ). Ponadto BJCQ jest stypendystą pomaturalnym (Postdoctoral Fellow) w ramach programu Peter Doherty Fellowship NHMRC.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Limfocyty | np. mysie lub ludzkie | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| Probówki stożkowe 10-15ml | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Folia aluminiowa | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Wirówka | Eppendorf | ||
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences |
Bibliografia
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
Przedruki i uprawnienia
