Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Podsumowanie

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Streszczenie

Niniejszy film przedstawia procedurę przygotowania pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila na etapie środkowej gastruli. Zaprezentowano metody zbierania embrionów oraz ich dechorionizacji przy użyciu wybielacza. Za pomocą szklanej pipety przymocowanej do rurki do ssania ustnego pokazano usuwanie wszystkich komórek z pojedynczych embrionów. Przedstawiono metodę dyspersji komórek z każdego embrionu w małej (5 µl) kropli pożywki na niepowlekanej szklanej lamelce. Widok pod mikroskopem po 1 godzinie od wysiania ilustruje preferowaną gęstość komórek. Większość komórek, które przeżywają w zdefiniowanej pożywce, to neuroblasty, które dzielą się jeden lub więcej razy w kulturze, zanim w ciągu 12-24 godzin zaczną wysuwać wypustki neurytowe. Widok pod mikroskopem pokazuje stopień wzrostu i rozgałęzień neurytów oczekiwany w zdrowej kulturze w 2. dniu in vitro. Kultury są hodowane w prostej, zdefiniowanej pożywce wodorowęglanowej, w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 22-24°C. Wypustki neurytowe nadal rozwijają się podczas pierwszego tygodnia hodowli, a po nawiązaniu kontaktu z neurytami sąsiednich komórek często tworzą funkcjonalne połączenia synaptyczne. Neurony w tych kulturach wykazują ekspresję napięciozależnych kanałów sodowych, wapniowych i potasowych oraz są elektrycznie pobudliwe. Ten system hodowli jest przydatny do badania molekularnych czynników genetycznych i środowiskowych regulujących różnicowanie neuronów, ich pobudliwość oraz tworzenie i funkcję synaps.

Protokół

I. Zbiór zarodków Drosophila

1. Przygotowanie płytek do zbierania jaj
   1. Zagotować 200 ml dH₂O z 8 g agaru
   2. Schłodzić do 50°C
   3. Dodać 2 ml EtOH i 2 ml kwasu octowego
   4. Wlać do plastikowych naczyń Petri o średnicy 35 mm, dnem do góry
   5. Schłodzić i przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4°C
   6. Pozwala to na przygotowanie około 80 płytek
2. Przygotowanie pasty drożdżowej
   1. Rozpuścić aktywne drożdże piekarnicze marki Fleischmans w wodzie, aby utworzyć pastę
   2. Podgrzewać w mikrofalówce przez 20-30 sekund, aby zabić drożdże (uważając, aby masa nie wykipiała)
   3. Przechowywać w strzykawce 10 cc (bez igły) w temperaturze 4°C przez 2 tygodnie
3. Muchy: Imago wykorzystywane do zbierania jaj są zazwyczaj najbardziej produktywne między 3 a 14 dniem po wyjściu z poczwarki, pod warunkiem, że miały dostęp do świeżego pokarmu. Wiele linii mutantów wykazuje obniżoną płodność, co może objawiać się mniejszą liczbą składanych jaj oraz zmianą wieku, w którym są one najbardziej produktywne. Zazwyczaj populacja składająca się z kilkuset osobników dorosłych zapewnia odpowiednią liczbę jaj.
4. Procedura: Nałożyć cienką warstwę pasty drożdżowej na płytkę do zbierania jaj. Stanowi ona korzystne podłoże do składania jaj. Przenieść dorosłe muchy do czystej butelki do zbierania jaj i przymocować płytkę do wylotu butelki za pomocą taśmy. Nie pozostawiać much w tych butelkach dłużej niż przez 3-4 godziny, ponieważ wilgotność wzrasta, a muchy przyklejają się do pasty i ścianek butelki.

II. Dechorionizacja embrionów przy użyciu podchlorynu sodu

1. Przygotować lejek Buchnera połączony z kolbą filtracyjną podłączoną do aspiratora. Włożyć do lejka kawałek papieru Whatman nr 1. Przy włączonej próżni zwilżyć papier sterylną wodą destylowaną.
2. Przepłukać embriony z płytek zbiorczych na papier filtracyjny, używając strumienia wody z butelki myjącej.
3. Przepłukać je kilkukrotnie sterylną wodą, wyłączyć aspirator, a następnie dodać objętość lejka 50% roztworu wybielacza. Pozostawić jaja na 5-10 minut. Choriony rozpuszczą się w ciągu 1-2 minut, jednak im dłużej embriony pozostaną w wybielaczu, tym więcej zanieczyszczających drożdży zostanie zniszczonych. Usunąć wszelkie osobniki dorosłe lub larwy, które spłynęły z płytki.
4. Przepłukać embriony do sterylnej płytki Petriego (NIE do hodowli tkankowej) sterylną wodą destylowaną. Wiele embrionów może przykleić się do dna płytki, jeśli nie została ona wcześniej zwilżona. Kilkukrotnie przepłukać embriony sterylną wodą w tej płytce.
5. Obezwzględnić embriony w świetle przechodzącym, aby wyselekcjonować te w stadium środkowej gastruli.

III. Przygotowanie kultur pojedynczych embrionów

1. Przygotuj DDM1 (patrz przepisy w sekcji IV)
2. Tuż przed hodowlą zlej wodę z naczynia z embrionami. Przykryj embriony sterylną pożywką.
3. Przygotuj 3 płytki Petriego o średnicy 35 mm. Do każdej płytki włóż 4 autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywowe. Na każde szkiełko nanieś 5 µl pożywki. Używaj szkiełek nakrywowych Bellco z niską zawartością ołowiu.
   
   Bellco Biological Glassware
   800-257-7043
   Cat #1943-00012
   
   
4. Wyciągnij cienkie pipety. Stosujemy pipety wyciągane za pomocą urządzenia Narishige PP-83. Dokładne wymiary pipety nie są kluczowe; zazwyczaj wyciągamy je cieńsze niż wymagane, a następnie odłamujemy końcówkę w tym samym polu widzenia co embrion, aby ocenić rozmiar. Należy unikać zbyt dużego otworu, aby nie zassać wszystkich embrionów naraz, ale końcówka nie może być zbyt mała, by zasysanie komórek trwało zbyt długo. Należy dążyć do uzyskania rozmiaru pośredniego. Obejrzyj embriony w świetle przechodzącym i użyj rurki do ssania ustnego podłączonej do pipety, aby usunąć zawartość embrionu. Rozprowadź komórki na przygotowanym szkiełku nakrywającym, delikatnie wypuszczając je jak najbliżej szkiełka. Można obejrzeć szkiełka przy większym powiększeniu i w ten sam sposób dodatkowo rozprowadzić komórki.
5. Pozostaw komórki nie dłużej niż przez 10 minut. Zalej płytkę pożywką i umieść w inkubatorze w atmosferze 4-5% CO₂, jeśli używasz pożywki definiowanej. Temperatura powinna wynosić od 22-24°C. Standardowo stosujemy 23°C i 95% wilgotności. Wilgotność jest istotna, aby uniknąć odparowania. Można użyć standardowego inkubatora do hodowli ssaków umieszczonego w chłodni z temperaturą ustawioną na 23°C.

IV. Zdefiniowana pożywka DDM1 do hodowli kultur

1. Przygotowanie DMEM: Do 100 ml pożywki Ham's F12/DME (DMEM) (Irvine Scientific #9052).
   1. Dodać 0,476 g Hepes (20mM) (Sigma #H-3375). Wymieszać.
   2. Dodać 1,25 ml L-Glutaminy 200 mM (Irvine Scientific #9317). Wymieszać.
   3. Przefiltrować w komorze laminarnej przy użyciu octanowego filtra strzykawkowego 0,2 µm (wymagane są 2 filtry).
   4. Wartość pH wynosi 6,64, a osmolalność Osm 288.
   5. Przygotować alikwoty po 10ml w probówkach wirówkowych 15ml.
   6. Przechowywać w temperaturze 4°C nie dłużej niż przez 2 tygodnie.
      
      Uwaga: Zawsze należy używać autoklawowanej wody filtrowanej i przygotowywać roztwory w naczyniach przeznaczonych wyłącznie do pożywek i suplementów. Nigdy nie wprowadzać do pożywki elektrody pH ani mieszadła magnetycznego używanego do innych celów. Aby przygotować DDM1: Dodać wymienione poniżej suplementy do DMEM bezpośrednio przed hodowlą.
      
      
2. Do 10 ml DMEM dodać:
   • 100 µl Transferryny
   • 100 µl Putrescyny
   • 100 µl Selenu
   • 100 µl Progesteronu
   • 50 µl Insuliny

Dyskusja

W hodowlach Drosophila przygotowanych z embrionów na etapie środkowej gastruli neurony powstają z prekursorowych neuroblastów, z których wiele dzieli się przed różnicowaniem in vitro. System ten stwarza zatem wyjątkową okazję do badania czynników genetycznych i środowiskowych istotnych we wczesnych fazach rozwoju neuronalnego (Rohrbaugh et al., 2003). Wykazaliśmy, że neurony hodowane w prostej, zdefiniowanej pożywce różnicują się w neurony pobudliwe elektrycznie, które tworzą również funkcjonalne połączenia synaptyczne (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drosophila melanogaster	Zwierzę			Muszki owocówki
Transferryna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T-1147	Zapas 100x: 10 mg/ml w wodzie. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.
Insulina		Sigma-Aldrich	I-6634	Zapas 200x: 10 mg/ml w 0,05N HCl. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 120 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.
Putrescyna		Sigma-Aldrich	P-5780	Zapas 100x: 10 mM w ddH2O. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.
Selen		Sigma-Aldrich	S-5261	Zapas 100x: 3 µM w ddH2O. Włożyć 0,0051 g selenu do probówki 15 ml oznaczonej jako A (zapas 3 mM). Dodać 10 ml sterylnej wody. Przenieść 10 µl z probówki A do probówki B zawierającej 10 ml ddH2O (zapas 3 µM). Przefiltrować zawartość probówki B przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.
Progesteron		Sigma-Aldrich	P-6149	Zapas 100x: 2 µg/ml. 1. Dodać 1 ml 100% EtOH do butelki z 0,001 g progesteronu. 2. Dodać 49 ml ddH2O. 3. Przenieść 1 ml tej mieszaniny do drugiej probówki z 9 ml ddH2O. 4. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). 5. Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.
DDM1	Pożywka			Do 10 ml DMEM dodać z zapasów: 100 µl transferryny, 100 µl putrescyny, 100 µl selenu, 100 µl progesteronu, 50 µl insuliny.
Szalki Petriego
Kryszalki		Bellco Glass	1943-00012	Szkło o niskiej zawartości ołowiu, autoklawowane.
Filtr papierowy		Whatman, GE Healthcare	#1
Strzykawka 10cc	Narzędzie
Hodowle przygotowane w tej pożywce należy utrzymywać w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze około 22-24°C. Stosujemy standardowy inkubator do hodowli tkanek ssaków, umieszczony w pomieszczeniu chłodniczym i ogrzewany do 23°C. Zawsze należy używać autoklawowanej wody filtrowanej i przygotowywać roztwory w naczyniach przeznaczonych wyłącznie do pożywek i suplementów. Nigdy nie wprowadzać do pożywek miernika pH ani mieszadełka magnetycznego używanego do innych celów.