Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Podsumowanie

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-_L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Streszczenie

Istnieje wiele podejść do redukcji złożoności proteomu w oparciu o funkcjonalne oddziaływania małych cząsteczek z białkami, takich jak chromatografia powinowactwa ¹ lub profilowanie białek w oparciu o ich aktywność (Activity Based Protein Profiling) ². Trójfunkcyjne związki wychwytujące (CC, Rysunek 1A) ³ stanowią podstawę uniwersalnego podejścia, w którym początkowe oddziaływanie między sondą w postaci małej cząsteczki (funkcja selektywności, w tym przypadku S-adenozylo-_L-homocysteina, SAH, Rysunek 1A) a białka docelowe, sterowane równowagą chemiczną, zostaje nieodwracalnie utrwalone poprzez fotousieciowanie między niezależną, fotoaktywną funkcją reaktywną (tutaj azyd fenylowy) związku CC a powierzchnią białek docelowych. Funkcja sortująca (tutaj biotyna) służy do izolacji koniugatów CC – białko z złożonych mieszanin biologicznych przy użyciu fazy stałej (tutaj magnetyczne kulki z streptawidyną). Możliwe są dwie konfiguracje eksperymentów: „off-bead” ⁴ lub obecnie opisana konfiguracja „on-bead” (Rysunek 1B). Funkcja selektywności może być praktycznie dowolną interesującą małą cząsteczką (substratami, inhibitorami, cząsteczkami leków).

S-Adenozylo-_L-metionina (SAM, Rysunek 1A) jest prawdopodobnie, po ATP, najpowszechniej występującym kofaktorem w przyrodzie ^{5, 6}. Służy ona jako główny donor grup metylowych we wszystkich organizmach żywych, a reakcja chemiczna jest katalizowana przez metylotransferazy zależne od SAM (MTazy), które metylują DNA ⁷, RNA ⁸, białka ⁹ lub małe cząsteczki ¹⁰. Biorąc pod uwagę kluczową rolę reakcji metylacji w różnych scenariuszach fizjologicznych (regulacja genów, epigenetyka, metabolizm), można oczekiwać, że profilowanie MTaz stanie się w proteomice funkcjonalnej równie istotne jak profilowanie kinaz. Jednakże narzędzia analityczne do ich profilowania nie były dostępne. Niedawno wprowadziliśmy CC z SAH jako grupą selektywności, aby wypełnić tę lukę technologiczną (Rysunek 1A).

SAH, produkt SAM powstający po transferze grupy metylowej, jest znanym ogólnym inhibitorem produktu MTazy ¹¹. Z tego powodu, a także ze względu na to, że naturalny kofaktor SAM jest wykorzystywany przez inne enzymy przenoszące pozostałe części kofaktora lub inicjujące reakcje rodnikowe, a także z powodu jego niestabilności chemicznej ¹², SAH stanowi idealną funkcję selektywności dla CC w celu celowania w MTazy. W niniejszej pracy przedstawiamy użyteczność SAH-CC i CCMS poprzez profilowanie MTaz oraz innych białek wiążących SAH z szczepu DH5α Escherichia coli (E. coli), jednego z najlepiej scharakteryzowanych prokariontów, który służy jako preferowany organizm modelowy w niezliczonych badaniach biochemicznych, biologicznych i biotechnologicznych. Fotoaktywowane sieciowanie zwiększa wydajność i czułość eksperymentu, a specyficzność można łatwo zweryfikować w doświadczeniach konkurencyjnych z zastosowaniem nadmiaru wolnego SAH.

Protokół

1) Przygotowanie lizatu komórkowego E. coli DH5α

1. Zaszczepić 2 mL kultury (pożywka LB w probówce) szczepem E. coli DH5α bezpośrednio z banku w glicerolu i inkubować w 37°C i 250 rpm przez 8 h. Należy użyć autoklawowanej pożywki LB (10 g/l Bacto-tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, pH 7,5).
2. Zaszczepić 250 mL pożywki LB w kolbie z mieszadłem i przegrodami o pojemności 1 L za pomocą 2 mL kultury i inkubować przez noc w 37°C i 166 rpm w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną.
3. Zaszczepić cztery kolby z mieszadłem i przegrodami o pojemności 5 L, z których każda zawiera 2,5 L pożywki LB, za pomocą 250 mL kultury (50 mL do każdej kolby) i inkubować kultury w 37°C i 166 rpm aż do osiągnięcia OD₆₀₀ na poziomie 0,8.
4. Zebrać komórki poprzez wirowanie w 4°C, 3000x g przez 20 min. Dalsze etapy pracy przeprowadzić w temperaturze 0-4°C lub na lodzie.
5. Resuspender zebrany materiał komórkowy w wodzie Milli-Q, połączyć w jednym koszu wirówki i wirować przez kolejne 30 min przy 6000x g i 4°C.
6. Przechowywać otrzymany materiał komórkowy o masie 20 g w temperaturze -20°C lub -78°C.
7. Resuspender komórki w 100 mL lodowatego buforu do otwierania komórek (6,7 mM MES, 6,7 mM NaOAc, 6,7 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM β-merkaptoetanolu, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w/v) glicerolu; 0,2 mM PMSF) i poddać sonikacji trzy razy po 1 min w czterech porcjach po 25 mL na lodzie, używając sonikatora (np. SONOPULS HD 2070 firmy BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, maksymalna amplituda, tryb ciągły).
8. Wirować lizat przez noc w 2370x g i 2°C.
9. Zagęścić supernatant do objętości 14 mL poprzez ultrafiltrację (np. używając koncentratorów iCON, 7 mL/9K, firmy Pierce) w 2370x g i 2°C.
10. Usunąć z lepki koncentratu małe cząsteczki, takie jak SAM lub SAH, poprzez filtrację żelową w 2°C (np. kolumny Zeba Desalt Spin Columns, 10 mL, firmy Pierce; cztery kolumny; usunięcie buforu do przechowywania przy 1000x g przez 2 min; czterokrotna ekwilibracja 5 mL lodowatym buforem do otwierania komórek i usuwanie buforu przy 1000x g przez 2 min; naniesienie 3,5 mL koncentratu na każdą kolumnę; wirowanie przez 45 min przy 24x g, a następnie dwukrotne wirowanie przez 2 min przy 1000x g).
11. Uzupełnić otrzymany lizat o objętości 13 mL o 13 mL lodowatego glicerolu i tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz firmy Roche, bez EDTA. Wymieszać i rozpuścić tabletki.
12. Przechowywać lizat w temperaturze -20°C.
13. Wyznaczyć całkowite stężenie białka metodą Bradforda (w niniejszym przypadku 21 mg/ml). Odczynnik Bradforda: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 w 50 mL 95% etanolu, dodać 100 mL 85% (w/v) kwasu fosforowego, dopełnić do 1 L po całkowitym rozpuszczeniu barwnika i przefiltrować przez papier Whatman #1 bezpośrednio przed użyciem.

2) Analiza wychwytu (A), kontrola konkurencji (C), immunoprecypitacja (PD), kontrola konkurencji immunoprecypitacji (CPD) oraz połączona analiza wychwytu i immunoprecypitacja (A+PD)

1. Do eksperymentów z wychwytywaniem wykorzystano zestaw SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH), który zawiera SAH-CC, wolny SAH jako konkurent, powlekane streptawidyną kuleczki magnetyczne o średnicy 1 μm (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen Dynal), 5X bufor do wychwytywania (5X CB, zawierający 100 mM HEPES, 250 mM octanu potasu, 50 mM octanu magnezu i 50% glicerolu) oraz 5X bufor do płukania (5X WB, zawierający 250 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 M NaCl, 42,5 μM oktylo-β-_D-glukopiranosidu).
2. W przypadku kilku równoległych eksperymentów zaleca się przygotowanie master mixu wody, buforu do wychwytywania i lizatu E. coli oraz przeprowadzanie reakcji w oddzielnych probówkach jednego paska probówek PCR o pojemności 200 μL (zalecany 0,2 mL Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Poniżej podano ilości dla jednej probówki reakcyjnej. Przedstawione zostaną wyniki pięciu różnych eksperymentów: testu wychwytywania (A), kontroli konkurencji (C), pulldownu (PD), kontroli konkurencji pulldownu (CPD) oraz połączonego testu wychwytywania i pulldownu (A+PD).
3. Dla każdej reakcji przygotować 1,5 mL 1X WB, dodając 0,3 mL 5X WB do 1,2 mL wody Milli-Q.
4. Przygotować powlekane streptawidyną kuleczki magnetyczne obciążone SAH-CC (caproBeads) w paskach probówek PCR 200 μL. W tym celu zmieszać 25 μL 100 μM SAH-CC z 50 μL kuleczek magnetycznych powlekanych streptawidyną w stężeniu 10 mg/ml dla każdej alikwoty, energicznie wstrząsać otrzymanymi zawiesinami w temperaturze pokojowej przez 2 min, aby umożliwić wiązanie części biotynylowej SAH-CC ze streptawidyną na powierzchni kuleczek magnetycznych, a następnie zebrać kuleczki za pomocą silnego magnesu (np. w zakrętkach pasków probówek PCR przy użyciu urządzenia magnetycznego caproMagTM, caprotec bioanalytics GmbH). Odrzucić nadosady, ponownie zawiesić otrzymane caproBeads w 200 μL WB, zebrać magnetycznie caproBeads (w zakrętkach pasków probówek PCR) i odrzucić nadosad z WB. Zamknąć probówki, aby zapobiec wysychaniu kuleczek.
5. Przygotować alikwoty lizatu całych komórek E.coli DH5α w nowych probówkach PCR w temperaturze 0-4°C, używając master mixu (patrz 2.2). Dla jednej reakcji uzupełnić objętość wody Milli-Q do końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 100 μL, dodając 20 μL 5X CB. Wymieszać, dodać 0,26 mg lizatu E. coli i delikatnie wymieszać przez odwracanie. Tylko dla C i CPD dodać 20 μL 10 mM roztworu konkurenta SAH i delikatnie wymieszać przez odwracanie (do A, PD i A+PD dodać wodę Milli-Q zamiast roztworu SAH). Pobrać próbkę 1 μL z A do dalszej analizy (patrz poniżej).
6. Zawiesić caproBeads w odpowiednim lizacie i inkubować przez 3 h w temperaturze 4°C, utrzymując kuleczki w zawiesinie poprzez rotację, aby umożliwić odwracalne wiązanie białek wiążących SAH do funkcji selektywności SAH-CC.
7. Umieścić zawiesiny A, C i A+PD w caproBoxTM (urządzenie do naświetlania próbek biochemicznych światłem UV przy jednoczesnym chłodzeniu, caprotec bioanalytics GmbH) i naświetlać przez łączny czas 30 min w zamkniętych probówkach w temperaturze 0-4°C w celu utworzenia kowalencyjnego wiązania krzyżowego między funkcją reaktywną SAH-CC a białkami wiążącymi SAH. W związku z tym wyjmować zawiesiny z caproBoxTM po interwałach naświetlania wynoszących odpowiednio 2,5 min, chłodzić w wodzie lodowej przez ok. 15 s (szczególnie zakrętki), kilka razy wymieszać przez odwracanie, bardzo krótko (~2 s) odwirować, aby usunąć zawiesinę pozostałą w zakrętkach, i umieścić z powrotem w caproBoxTM na następny interwał naświetlania.
8. Dodać 20 μL 10 mM roztworu SAH do A lub 20 μL wody Milli-Q do C, PD, CPD i A+PD, a następnie inkubować zawiesinę przez 10 min w temperaturze 4°C, aby w próbce A usunąć białka wiążące SAH, które nie zostały powiązane krzyżowo z SAH-CC. Utrzymywać kuleczki w zawiesinie poprzez rotację lub okresowe ręczne resuspensoryzowanie.
9. Zebrać caproBeads z zawiesin za pomocą silnego magnesu (np. caproMagTM), odrzucić nadosady i przemyć kuleczki sześciokrotnie – poprzez resuspensję i zbieranie – 200 μL 1X WB oraz raz 200 μL wody Milli-Q.
10. Kuleczki można przechowywać w wodzie Milli-Q przez kilka tygodni w temperaturze 4°C. Istnieją alternatywne protokoły dalszej obróbki wychwyconych białek i ich identyfikacji (patrz dyskusja).
11. Przemyć kuleczki trzy razy 200 μL 60% acetonitrylu (ACN) i uwolnić wychwycone białka z kuleczek poprzez 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej przy energicznym wstrząsaniu z 200 μL 60% ACN/0,2% kwasu trifluorooctowego (TFA) (przygotować na świeżo). Należy używać odczynników i wody klasy LC-MS.
12. Zebrać magnetycznie kuleczki, oddzielić i odparować nadosad do suchości za pomocą odparowarki wirówkowej (np. koncentrator MiVac DNA od GeneVac, Inc., UK). Odrzucić kuleczki.

3) SDS-PAGE uchwyconych białek

1. W celu przeprowadzenia SDS-PAGE rozpuścić wychwycone białka uwolnione z kulek magnetycznych (odparowane roztwory ACN/TFA z kroku 2.12) w 20 μL buforu do próbek SDS (50 mM Tris HCl, 320 mM β-merkaptoetanol, 2,5% SDS, 0,05% błękitu bromofenolowego, 10% glicerolu, pH 6,8). Pomieszać 1 μL próbki pobranej z A (patrz krok 2.5) z 19 μL buforu do próbek SDS; do analizy SDS-PAGE użyć 5 μL tego roztworu (0,25% analizy). Próbki w buforze do próbek SDS podgrzewać przez 10 min w temperaturze 95°C, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
2. Przeprowadzić analizę metodą SDS-PAGE (standardowa konfiguracja: gotowe żele OLS® ProPage 4-20% Tris/glicyna; system elektroforezy żelowej OLS omniPAGE mini; bufor do elektroforezy SDS: 25 mM Tris base, 200 mM glicyna, 0,1% SDS, pH 8,3; czas prowadzenia 90 min przy stałym napięciu 180 V z chłodzeniem buforu do elektroforezy SDS w lodzie).
3. Przebarwić żel metodą barwienia srebrem kompatybilną z MS (np. ProteoSilver Silver Stain Kit od Sigma). Reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 2.

4) Trawienie trypsynowe białek w żelu i ekstrakcja peptydów z prążków żelowych

1. Po usunięciu roztworu zatrzymującego barwienie srebrem, przemyj żel zabarwiony srebrem co najmniej trzy razy 100 mL wody Milli-Q przez 10 min.
2. Wytnij prążki żelu (np. używając czystego skalpela i przenosząc je do probówki Eppendorf 0,5 mL) i przechowuj w temperaturze -20°C lub poddaj bezpośredniej obróbce. Przemywaj prążki żelu przez odpowiednio 15 min przy użyciu 100 μL wody, 100 μL 50% etanolu, 100 μL wody, 100 μL 50% etanolu oraz przez 5 min w czystym etanolu. Powtórz tę procedurę płukania jeszcze raz.
3. Rehydratyzuj prążek żelu za pomocą 10 μL roztworu do trawienia w żelu (trypsyna klasy sekwencyjnej 12,5 ng/μL w 50 mM wodorowęglanie amonu; przygotuj, dodając 7,5 μL roztworu trypsyny 0,5 μg/μL w 1 mM HCl do 292,5 μL 50 mM wodorowęglanu amonu) przez 45 min w temperaturze 4°C. Usuń nadsącz i zastąp go 20 μL 50 mM wodorowęglanu amonu (bez trypsyny), a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 37°C podczas wytrząsania.
4. Zbierz nadsącz. W celu ekstrakcji peptydów inkubuj prążek żelu z 20 μL 5% kwasu mrówkowego (FA) przez 15 min podczas wytrząsania, dodaj 20 μL ACN i inkubuj przez kolejne 15 min podczas wytrząsania. Połącz nadsącz z poprzednim nadsączem i powtórz procedurę ekstrakcji peptydów jeszcze raz.
5. Odparuj połączone trzy nadsącze do suchości, rozpuść w 10 μL 5% FA podczas wytrząsania i stosowania ultradźwięków (kąpiel ultradźwiękowa, np. Sonorex firmy Bandelin, Niemcy), a następnie przystąp do odsolenia (krok 5.2 i kolejne).

5) Trawienie trypsynowe wychwyconych białek i przygotowanie peptydów do LC-MS/MS

1. Rozpuścić przechwycone białka uwolnione z kulek magnetycznych (odparowane roztwory ACN/TFA z kroku 2.12) w 10 μL 50 mM wodorowęglanu amonu, stosując kąpiel ultradźwiękową i mieszanie w vortexie; dodać 1 μL 0.5 μg/μL trypsyny w 1 mM HCl i inkubować roztwór w temperaturze 37°C przez noc.
2. Odsolić roztwór zawierający peptydy tryptyczne przechwyconych białek, używając materiału C18 (np. 2-10 μL StageTips, 20 μL tip, Proxeon Biosystems A/S, Odense, Dania; procedura producenta: wstępne przygotowanie 10 μL 50% metanolu/5% FA, równoważenie 10 μL 5% FA, nałożenie peptydów przechwyconych białek, przemywanie 10 μL 5% FA, elucja dwukrotnie za pomocą 10 μL 50% metanolu/5% FA).
3. Odparować odsolone peptydy w 50% metanolu/5% FA do suchości, rozpuścić w 5.5 μL 0.1% FA podczas mieszania i stosowania ultradźwięków (kąpiel ultradźwiękowa), a następnie przeanalizować próbkę metodą nanoLC-MS/MS.

6) Analiza NanoLC-MS/MS

1. Przenieś próbkę do płytki na próbki i umieść płytkę w systemie nano-przepływowej chromatografii cieczowej (nanoLC) (np. system chromatografii cieczowej Easy-nLC; Proxeon Biosystems A/S, Dania).
2. Jako fazę ruchomą A zastosuj 0,1% FA w wodzie, a jako fazę ruchomą B 0,1% FA w ACN. Należy używać wyłącznie rozpuszczalników klasy LC-MS.
3. Nanieś 5 μL roztworu peptydów bezpośrednio na prekolumnę (np. nanoflow Biosphere C18, 5 μm, 120 Å, 20 x 0,1 mm; NanoSeparations, Holandia) połączoną z kolumną analityczną (np. nanoflow Biosphere C18, 5 μm, 120 Å, 100 x 0,075 mm; NanoSeparations, Holandia), używając 5% ACN/0,1% FA.
4. Podczas LC eluuj peptydy w ciągu 80-minutowego gradientu liniowego od 5% ACN/0,1% FA do 40% ACN/0,1% FA, a następnie przez dodatkowe 2 min do 100% ACN/0,1% FA i pozostaw w 100% ACN/0,1% FA przez kolejne 8 min przy kontrolowanej szybkości przepływu 400 nL/min.
5. Przeprowadź analizę spektrometryczną (MS) eluowanych peptydów na wysokiej dokładności, nowoczesnym spektrometrze mas (np. spektrometr mas LTQ Orbitrap XL; Thermo FisherScientific, Niemcy, wyposażony w źródło nanoelektrospray do jonizacji elektrospray (ESI); Proxeon Biosystems A/S, Dania).
6. Wykonaj analizę spektrometryczną w trybie zależnym od danych (data-dependent mode), aby automatycznie przełączać się między akwizycją orbitrap-MS (tryb profilowy) a LTQ-MS/MS (tryb centroidowy).
7. Kontroluj cykl pracy spektrometru mas, ustawiając automatyczną kontrolę wzmocnienia czasu wtrysku (automatic gain control).
8. Rejestruj pełne widma MS (od m/z 300 do 2000) w orbitrapie z rozdzielczością r = 60 000 przy m/z 400 (po akumulacji do wartości docelowej 500 000 ładunków w liniowej pułapce jonowej).
9. Ustaw urządzenie tak, aby sekwencyjnie izolować najintensywniejsze jony (do pięciu, zależnie od intensywności sygnału) w celu fragmentacji w liniowej pułapce jonowej przy użyciu dysocjacji indukowanej zderzeniowo (CID) przy wartości docelowej 10 000 ładunków. Powstałe jony fragmentowe są rejestrowane w LTQ.
10. W celu dokładnych pomiarów masy w trybie MS, jako masę blokującą (lock mass) do wewnętrznej rekalibracji w czasie rzeczywistym, zastosuj jednokrotnie naładowany jon tła polidymetylocyklosiloksanu (Si(CH₃)₂O)₆H⁺ (m/z 445,120025) generowany podczas procesu elektrospray z powietrza otoczenia.
11. Dynamicznie wykluczaj jony docelowe, które zostały już wybrane do CID, przez czas 60 s.
12. Ustaw przesiewanie stanów ładunku oraz odrzucanie jonów dla CID z nieprzypisanym ładunkiem.
13. Dalsze ustawienia spektrometryczne są następujące: ustaw napięcie spray na 1,6 kV, temperaturę podgrzewanej kapilary transferowej na 200 °C, a znormalizowaną energię zderzenia dla MS² na 35%. Minimalny sygnał wymagany dla MS² wynosi 500 counts. Zastosuj aktywację q = 0,25 i czas aktywacji 30 ms dla akwizycji MS².
14. Aby oczyścić system LC, wykonaj jeden bieg jałowy pomiędzy dwoma kolejnymi pomiarami CCMS.

7) Identyfikacja peptydów i białek za pomocą zautomatyzowanego przeszukiwania bazy danych sekwencji

1. Użyć algorytmu identyfikacji białek do analizy danych MS/MS (w niniejszym przypadku zapisanych w plikach raw), np. SEQUEST zaimplementowanego w BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Niemcy) oraz X!Tandem (The Global Proteome Machine Organization; wersja 2007.01.01.1) zaimplementowanego w oprogramowaniu Scaffold 3 (wersja Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc., USA).
2. Przeprowadzić zautomatyzowane przeszukiwanie bazy danych w najnowszym wydaniu bazy UniProtKB/Swiss-Prot (www.expasy.org) dla badanego organizmu (baza użyta w niniejszym badaniu: Escherichia coli, szczep K12, wydanie 57-11).
3. W przypadku zautomatyzowanego przeszukiwania bazy danych w programie SEQUEST zastosować następujące ustawienia: tolerancja prekursora 5 ppm, tolerancja jonów fragmentacyjnych 1 amu oraz pełna specyficzność trypsyny z dopuszczeniem do dwóch pominiętych miejsc cięcia. Jako modyfikacje zmienne dopuścić: fosforylację seryny, treoniny i tyrozyny; utlenianie metionin; deamidację asparaginy i glutaminy; acetylację lizyny i seryny; formylację lizyny oraz metylację argininy, lizyny, seryny, treoniny i asparaginy. W przeszukiwaniu bazy danych nie stosować modyfikacji stałych.
4. Wczytać pliki srf lub dta oraz pliki out wygenerowane przez SEQUEST do programu Scaffold 3, który dokonuje oceny prawdopodobieństwa przypisania peptydów i identyfikacji białek poprzez połączenie wyników przeszukiwania baz danych w programach SEQUEST i X!Tandem. Program Scaffold jest przydatny do łatwego porównywania i wizualizacji list białek z kilku próbek (w niniejszym przypadku A, C, PD, CPD i A+PD).
5. W oprogramowaniu Scaffold 3 ustawić parametry tak, aby uwzględnić tylko peptydy o prawdopodobieństwie ≥ 95% określonym przez algorytm Peptide Prophet (ref.13). Ustawić prawdopodobieństwo identyfikacji białek dla wielu przypisanych peptydów na poziomie ≥ 95% zgodnie z algorytmem Protein Prophet¹³. Dla identyfikacji białek na podstawie pojedynczego peptydu dowolnie ustawić prawdopodobieństwo białka na poziomie ≥ 50% i ręcznie sprawdzić odpowiadające im widma MS/MS peptydu. Białka składające się z podobnych peptydów, których nie można było rozróżnić wyłącznie na podstawie analizy MS/MS, są grupowane przez oprogramowanie zgodnie z zasadą oszczędności (parsimonii). Szacowany wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) dla identyfikacji peptydów można określić za pomocą metody odwróconej bazy białek i powinien on wynosić < 1%.
6. Reprezentatywne wyniki eksperymentów CCMS przedstawiono w tabelach 1, 2 i tabeli uzupełniającej S1 (należy pamiętać, że baza danych białek nie jest aktualna dla niektórych białek, np. PrmB (znanego jako YfcB) lub RsmH (znanego jako MraW)), a także na rysunku 3.

8) Reprezentatywne wyniki

Tabela 1:

Białko	ORF	MW/kDa	Opis	Substrat	A	C	PD	CPD	A+PD
Dcm	b1961	53.5	DNA-cytozyna MTaza	DNA (m5C)	1	0	0	0	1
RlmI	b0967	44.4	23S rRNA m5C1962 MTaza	rRNA (m5C)	17	0	17	0	20
RlmL	b0948	78.9	23S rRNA m2G2445 MTaza	rRNA (m2G)	12	0	0	0	10
TrmB	b2960	27.3	tRNA (guanina-N(7)-)-MTaza	tRNA (m7G)	11	0	0	0	13
CmoA	b1870	27.8	tRNA (cmo5U34)-MTaza	tRNA (mcmo5U)	7	0	0	0	4
RsmG	b3740	23.4	16S rRNA m7G MTaza	rRNA (m7G)	6	0	1	0	5
RsmH	b0082	34.9	16S rRNA m4C1402 MTaza	rRNA (m4C)	5	0	0	0	7
RsmD	b3465	21.7	16S rRNA m2G966 MTaza	rRNA (m2G)	2	0	0	0	2
RsmB	b3289	48.3	16S rRNA m5C967 MTaza	rRNA (m5C)	1	0	0	0	0
MnmC	b2324	74.4	Białko bifunkcyjne obejmujące tRNA (mnm(5)s(2)U34)-MTazę	tRNA (mnm5s2U)	1	0	0	0	0
PrmB	b2330	35.0	50S rybosomalna białkowa L3 Gln150 MTaza	białko (Gln)	13	0	0	0	15
CheR	b1884	32.8	Chemotaktyczne białko MTaza	białko (Glu)	0	0	0	0	1
Cfa	b1661	44.9	Syntaza cyklopropanowo-tłuszczowo-acylo-fosfolipidowa	mała cząsteczka	15	0	0	0	14
Tam	b1519	29.0	Trans-akonitan 2-MTaza	mała cząsteczka	2	0	0	0	3
CysG	b3368	50.0	Syntaza sirohemu obejmująca uroporfyrynogen-III C-MTazę	mała cząsteczka	1	0	0	0	2
SmtA	b0921	29.8	Białko smtA	(?a)	7	1	0	0	8
MtnN	b0159	24.4	5'-Metylotioadenozyna/SAH nukleozydaza	mała cząsteczkab	36	0	0	0	39
GlnA	b3870	51.9	Syntetaza glutaminy	mała cząsteczkac	90	0	0	0	97
RplK	b3983	14.9	50S rybosomalne białko L11	białka MTazy PrmAd	2	0	0	0	2

^aNie (w pełni) scharakteryzowany

^bBrak metylacji, lecz następuje rozszczepienie wiązania glikozydowego SAH

^cBrak metylacji, lecz wiązanie SAH w miejscu wiązania ATP, co wykazano w eksperymentach CCMS z zastosowaniem ATP jako konkurenta (dane nie pokazano)

^dSubstrat metylotransferazy PrmA białka rybosomalnego L11 podjednostki 50S; potwierdzona specyficzna identyfikacja za pomocą CCMS (dane nie przedstawiono)

Tabela 1: MTazy i inne wybrane białka zidentyfikowane w eksperymentach CCMS. Podane liczby oznaczają nieważoną liczbę widm peptydowych na białko. Próbki są duplikatem tych analizowanych za pomocą SDS-PAGE/barwienia srebrem na Rysunku 2. W analizie CCMS (A) zidentyfikowano znacznie więcej MTaz i innych białek wiążących SAH w porównaniu do metody pulldown (PD), a specyficzność SAH jest wykazana przez niemal całkowity brak tych białek w kontroli konkurencyjnej (C).

Tabela 2:

	A	C	PD	CPD	A+PD
A	111 (64)
C	65 (41)	107 (46)
PD	25 (15)	23 (13)	61 (17)
CPD	23 (13)	22 (12)	20 (14)	47 (14)
A+PD	87 (61)	64 (41)	23 (14)	22 (12)	124 (67)

Tabela 2: Całkowita liczba zidentyfikowanych białek w analizach CCMS oraz nakład białek pomiędzy analizami. Liczba białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej 2 peptydów podano w nawiasach. Wysoką powtarzalność metody można wywnioskować z dużego nakładu białek (głównie białek niespecyficznych) pomiędzy porównywalnymi eksperymentami (A vs. C i szczególnie A vs. A+PD, ale także PD vs. CPD), zwłaszcza w przypadku białek pewnie zidentyfikowanych za pomocą co najmniej 2 peptydów. Patrz również Rysunek 3 w celu zapoznania się z diagramami Venna oraz Tabela uzupełniająca S1 w celu uzyskania listy wszystkich zidentyfikowanych białek.

Rycina 1A: Struktura chemiczna trifunkcyjnego Związku Wychwytującego (CC). Funkcja selektywności jest zaznaczona kroplą, funkcja reaktywności gwiazdką, a funkcja sortowania półksiężycem. Chemicznie stabilna S-adenozylo-_L-homocysteina (SAH) jest kofaktorem będącym produktem S-adenozylo-_L-metioniny (SAM) po przeniesieniu grupy metylowej przez MTazy zależne od SAM, dla których SAH działa jako inhibitor produktowy.

Rycina 1B: Procedura CCMS „on-bead”. CC jest wiązane na kuleczkach magnetycznych za pomocą swojej funkcji sortującej (a), tak powstałe caproBeads są inkubowane ze złożoną mieszaniną białek (b), w której ustanawia się odwracalna równowaga wiązania (c) pomiędzy funkcją selektywności CC a białkami docelowymi. Po naświetlaniu UV (d) funkcja reaktywna tworzy kowalencyjne wiązanie poprzeczne. Po przemyciu kuleczek magnetycznych z uchwyconymi białkami (e), odszczepieniu sieciowanych kompleksów CC-białko z kuleczek magnetycznych (f) oraz trawieniu trypsynowym (g), uchwycone białka mogą zostać zidentyfikowane za pomocą analizy MS peptydów trypsynowych.

Rycina 2: Analiza SDS-PAGE/barwienie srebrem wychwyconych białek (po kroku f na Rycinie 1B). Opis ścieżek znajduje się nad żelem (MW: marker masy cząsteczkowej z odpowiadającymi masami cząsteczkowymi prążków markera podanymi po prawej stronie; L: 0,25% próbki pobranej z lizatu całych komórek E. coli DH5a przed dodaniem caproBeads w kroku b na Rycinie 1B; A: analiza z dodatkiem nadmiaru wolnego SAH po kroku naświetlania UV d na Rycinie 1B; C: kontrola analizy obejmująca nadmiar wolnego SAH jako kompetytora podczas kroków c i d na Rycinie 1B (niezbędna do określenia białek wychwyconych niespecyficznie); PD: pulldown, co oznacza brak kroku naświetlania UV d na Rycinie 1B oraz brak dodatku wolnego SAH; CPD: kontrola pulldown z użyciem SAH jako kompetytora; A+PD: połączona analiza i pulldown, co oznacza brak dodatku wolnego SAH podczas procedury). Białka zidentyfikowane metodą MS z wyciętych prążków żelowych po trawieniu trypsyną w żelu są podane po lewej stronie. Wyraźnie widać, że sieciowanie fotochemiczne zwiększa wydajność i czułość eksperymentu, a specyficzność można łatwo sprawdzić w eksperymentach konkurencyjnych z użyciem nadmiaru wolnego SAH. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji o MTazach i innych wybranych białkach zidentyfikowanych w eksperymentach CCMS na powtórzonych próbkach tych przedstawionych na niniejszej rycinie.

Rycina 3: Diagramy Venna wyjaśniające pokrywanie się zidentyfikowanych białek w teście CCMS (A), kontroli konkurencji (C) oraz pulldown (PD). Po lewej: Liczba MTaz i nukleozydazy SAH, wyłącznie, w odniesieniu do Tabeli 1. Po prawej: Liczba wszystkich zidentyfikowanych białek w odniesieniu do Tabeli 2 i Tabeli uzupełniającej S1. Liczba białek zidentyfikowanych za pomocą co najmniej 2 peptydów podana jest w nawiasach.

Dyskusja

Podczas stosowania opisanego protokołu przydatne mogą być następujące środki ostrożności i uwagi: a) Główną zaletą CC jest tworzenie wiązania kowalencyjnego pomiędzy CC a MTazą, co umożliwia późniejsze zastosowanie rygorystycznych warunków płukania. Kowalencyjne sieciowanie jest osiągane poprzez fotoreakcję wywołaną światłem UV (max. 310 nm). Zwykłe oświetlenie górne zawiera jedynie niewielką frakcję UV, niemniej jednak należy chronić SAH-CC przed długotrwałą ekspozycją na światło górne lub słoneczne aż do momentu kontrolowanego i chłodzonego naświetlania w caproBoxie. b) Próbki biologiczne, z których mają zostać wyizolowane MTazy, mogą zawierać białka podatne na denaturację, w związku z czym konieczne jest utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze i unikanie pienienia przez cały czas. c) Urządzenie caproBox chłodzi próbki do 0-4 °C, jednak lampy emitujące światło UV emitują również ciepło. Dlatego konieczne jest krótkie odwirowanie probówek przed naświetlaniem, aby białka przylegające do zakrętek lub ścianek probówek nie mogły tworzyć zarodków wytrącania. d) Jeśli resuspensja kulek magnetycznych (np. w roztworach płuczących) nie jest możliwa ręcznie, należy krótko zastosować ultradźwięki, umieszczając próbki w kąpieli ultradźwiękowej. e) Świeżo przygotuj roztwór 0,2% TFA/60 %ACN. Stwierdzono, że w przeciwnym razie wychwycone białka mogą nie zostać odczepione od kulek. f) Końcowa analiza wychwyconych białek jest przeprowadzana metodą LC-MS/MS. Spektrometria mas jest metodą o wysokiej czułości. W końcowych etapach (krok 2.11 i kolejne) konieczne jest stosowanie wyłącznie reagentów klasy LC-MS. Należy unikać zanieczyszczenia doświadczeń zewnętrznymi źródłami białek, np. keratyną pochodzącą z kurzu lub od eksperymentatora. Szczególnie podczas końcowych etapów trawienia zaleca się dbałość o czystość miejsca pracy, noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz ewentualnie siatki na włosy lub w idealnym rozwiązaniu przeprowadzenie końcowych etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Bufor wodorowęglanu amonu 50 mM stosowany do trawienia trypsyną należy przygotować w wodzie klasy LC-MS, przefiltrować przez filtr 0,22 μm, rozdzielić na aalikwoty, przechowywać w -20°C i używać każdej alikwoty tylko raz, aby uniknąć zanieczyszczeń. Roztwór trypsyny (klasy sekwencyjnej, Roche, przygotować roztwór 0,5 μg/μl poprzez dodanie 1 mM HCl do liofilizowanej trypsyny) można przechowywać w 4°C przez kilka tygodni. g) Aby uzyskać wiarygodne widma mas, niezbędny jest stabilny spray w analizie ESI-MS/MS. h) W przypadku innych systemów LC-MS/MS niż ten użyty w niniejszym badaniu, parametry pomiarowe i algorytmy identyfikacji peptydów muszą zostać dostosowane indywidualnie.

W odniesieniu do opisanego protokołu możliwe są następujące modyfikacje: a) Alternatywnie do uwalniania białek z kulek za pomocą 60% ACN/0,2% TFA (krok 2.11), białka można poddać bezpośredniemu trawieniu trypsyną w zawiesinie kulek (te same objętości co w kroku 5.1) lub, w przypadku SDS-PAGE, białka można uwolnić poprzez zawieszenie i podgrzanie kulek zebranych po kroku 2.9 do 95°C przez 10 min w buforze do próbek SDS (do kieszonki żelu można nałożyć zarówno całą zawiesinę, jak i sam nadsącz). Stwierdziliśmy, że podczas trawienia trypsyną na kulkach, nawet po kilku etapach płukania w fazie wodnej, kulki powoli uwalniają niewielkie ilości polimeru do wodnego roztworu trawiennego. Zanieczyszczenie polimerem zakłóca identyfikację peptydów metodą MS i można je wypłukać z kulek przy użyciu 80% ACN (co najmniej trzykrotnie). Po etapach płukania 80% ACN kulki należy raz przepłukać wodą przed trawieniem trypsyną na kulkach. b) Do wizualizacji skutecznego sieciowania zawierającego biotynę CC z białkami można również zastosować western blot z użyciem streptawidyny-peroksydazy chrzanowej i substratu ECL. W związku z tym można przeprowadzić transfer z żelu otrzymanego po kroku 3.2 lub, ponieważ czułość jest około 10-krotnie wyższa niż w przypadku barwienia żeli srebrem, analizą western blot można objąć również próbki o objętości 10 μl po kroku 2.7. Należy pamiętać, że w tym drugim przypadku, oprócz białek sztucznie biotynilowanych przez SAH-CC, wykryte zostaną również endogennie biotynilowane białka. c) Stwierdziliśmy, że to, czy lepsze wyniki daje konfiguracja „off-bead”, w której reakcja sieciowania zachodzi między wolnym CC a białkiem w roztworze ⁴, czy obecnie opisana konfiguracja „on-bead” (Rysunek 1B), zależy od konkretnego układu (lizatu, adresowanych białek docelowych, selektywności i funkcji reaktywności CC).

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta powinna być również kompatybilna z każdą nowoczesną technologią znakowania białek lub peptydów stabilnymi izotopami, a także z analizą próbki wychwyconej za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej (2D). W konfiguracji „poza koralikiem” (off-bead) możliwe jest również wychwytywanie białek w obrębie całych komórek (wyniki niepublikowane). Ponadto miejsce wiązania leku lub kofaktora w białku można określić poprzez wyznaczenie bliskiej pozycji sieciowania CC w sekwencji białka za pomocą sekwencjonowania peptydów metodą MS. Sposób wiązania małej cząsteczki z białkiem można badać, stosując różne pozycje przyłączenia chemicznego w funkcji selektywności oraz różną długość łącznika. Jak pokazano w niniejszym badaniu, można zidentyfikować również białkowe partnery wiążące białka objęte funkcją selektywności (RplK jako substrat PrmA) lub nieznane oddziaływania małych cząsteczek z białkami (SAH z GlnA). Podsumowując, dodatkowa cecha CC, jaką jest reaktywność fotousieciowania, pozwala na izolację i identyfikację białek o niskiej zawartości lub funkcjonalnych rodzin białek z kompleksowych mieszanin białkowych z wysoką czułością i dostarcza naukowcom dodatkowego narzędzia do badania oddziaływań między małymi cząsteczkami a białkami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SAH caproKit™	caprotec bioanalytics GmbH	1-1010-050 (50 reakcji) 1-1010-010 (10 reakcji)	Zawiera SAH-CC, konkurencyjny SAH, magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną, bufor wychwytujący i bufor do płukania
caproBox™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)	Do powtarzalnej fotoaktywacji przy jednoczesnym chłodzeniu próbek
caproMag™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5100-001	Do łatwej obsługi cząsteczek magnetycznych bez użycia pipety